具有溫敏性能的膠原蛋白敷料及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及膠原蛋白領域，具體地指一種具有溫敏性能的膠原蛋白敷料及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] 溫敏凝膠也稱為熱敏凝膠，是一類在某一特定溫度下發生溶脹或強烈收縮的凝 膠，這一特定溫度稱為凝膠的最低臨界溶解溫度（LCST)，可分為熱脹型溫敏凝膠和熱縮型 溫敏凝膠。首先觀察到凝膠溫敏性能的是Tanaka，發現N，N-次甲基雙丙烯酰胺交聯的聚丙 烯酰胺凝膠的溶脹性能在某一臨界溫度附近，隨著溫度的微小變化，其體積變化可達幾十 至幾百倍。
[0003] 目前普遍使用的N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm)類溫敏凝膠，其LCST在32~33°C 左右，在相變溫度LCST下體積會發生突變從而實現對藥物釋放的控制，常常通過向N-異丙 基丙烯酰胺的高分子鏈中添加親水或疏水基團來調解凝膠的LCST，使其具有與人體體溫相 適應的相變溫度，因此N-異丙基丙烯酰胺在醫藥、生物工程領域具有廣泛的應用前景。膠 原蛋白是一組由多種糖蛋白分子組成的大家族，廣泛分布于人體各組織器官中，它是人體 最主要的結構蛋白，以結締組織中含量最高，約占機體總蛋白的25%，目前已發現并確認了 25種類型的膠原蛋白。膠原蛋白基于其結構及特性，作為生物材料在組織創傷后的止血、修 復、缺損性填充，以及用于組織工程支架而發展起來的再生醫學中發揮著巨大作用。
[0004] 雖然已經存在各種以膠原蛋白為基材，添加殼聚糖、羧甲基纖維素等其它材料制 作而成的膠原蛋白敷料，但是具有人體體溫感應的智能膠原蛋白敷料并未發明。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種具有溫敏性能的膠原蛋白敷料及其制備方法，該膠原蛋 白敷料一方面增加了膠原蛋白的溫敏性能，使其在人體體溫的作用下較短時間內轉相為凝 膠狀，從而在一定時間范圍內穩定存在；另一方面，改善了膠原蛋白敷料的交聯度，使其在 體內自然降解的時間延長，可作為緩釋載體使用。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供的一種具有溫敏性能的膠原蛋白敷料，所述膠原蛋 白敷料的原料按重量份數比計包括1份的膠原蛋白酶解液、16~25份的N-異丙基丙烯酰 胺（NIPAAm)和70~90份的純化水。
[0007] 進一步地，所述膠原蛋白敷料的原料還包括輔料，所述輔料按重量份數比計由 0. 05~0. 1份的N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA)、0. 002~0. 01份的過硫酸銨（APS)和 0. 002~0. 01份的四甲基乙二胺（TEMED)組成。
[0008] 再進一步地，所述膠原蛋白敷料的原料按重量份數比計包括1份的膠原蛋白酶解 液、16~22份的N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm)、0. 06~0. 08份的N，N-亞甲基雙丙烯酰胺 (MBA)、0. 004~0. 01份的過硫酸銨（APS)、0. 004~0. 008份的四甲基乙二胺（TEMED)和 75~95份的純化水。
[0009] 再進一步地，所述膠原蛋白敷料的原料按重量份數比計包括1份的膠原蛋白酶解 液、18份的N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm)、0. 07份的N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA)、0. 005 份的過硫酸銨（APS)、0. 005份的四甲基乙二胺（TEMED)和80份的純化水。
[0010] 再進一步地，所述膠原蛋白酶解液的濃度為7~8mg/mL。
[0011] 再進一步地，所述膠原蛋白酶解液的制備方法，包括以下步驟：
[0012] 1)去除牛跟腱上的粗皮毛和皮下脂肪，將牛跟腱置于脫脂劑中進行脫脂處理，水 洗，其中，所述脫脂劑是丙酮和乙醇按重量比3~1 : 1混合而成；
[0013] 2)將洗凈的牛跟腱倒入組織搗碎機中在8000~14000rpm/min條件下攪拌10~ 30min成糊狀，再將糊狀的牛跟腱和質量分數為5%的NaCl溶液按重量比1 : 10~20混 合均勻，然后置于攪拌機上攪拌12~24h，過濾，用蒸餾水重復沖洗3~5次，瀝干，得到處 理料；
[0014] 3)向處理料按質量比加入1份0. 5~0. 8moL/L的冰醋酸和3份600~700mg/L 的胃蛋白酶的混合物；室溫持續攪拌20~30h得到反應液，再利用0. 5~0. 8moL/L的冰醋 酸調節反應液的pH至5 ;
[0015] 4)向反應液中加入NaCl飽和溶液，攪拌20~30h，離心棄上清，得到沉淀物；再向 沉淀物中滴加摩爾濃度為0. 5~0. 8m〇L的冰醋酸使一級沉淀物完全溶解，離心，取上清液 并用0. 5~0. 8moL/L的冰醋酸調節pH至7. 5 ;
[0016] 5)向上清液中加入NaCl飽和溶液，攪拌20~30h，離心棄上清，得到沉淀物，再向 沉淀物中滴加摩爾濃度為0. 5~0. 8m〇L的冰醋酸使沉淀物完全溶解，得到溶解液；
[0017] 6)以蒸餾水為透析外液對溶解液透析24~30h，即得膠原蛋白酶解液。
[0018] 本發明還提供了一種具有溫敏性能的膠原蛋白敷料的制備方法，包括以下步驟：
[0019] 1)按重量份數比計稱取1份的膠原蛋白酶解液、16~25份的N-異丙基丙烯酰胺、 0. 05~0. 1份的N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、0. 002~0. 01份的過硫酸銨、0. 002~0. 01份的 四甲基乙二胺和70~90份的純化水，備用；
[0020] 2)將膠原蛋白酶解液和N-異丙基丙烯酰胺溶解于純化水中，攪拌均勻，得到混合 液；
[0021] 3)向混合液中加入N,N-亞甲基雙丙稀酰胺，在氮氣保護下機械攪拌10~30min 使各組分混合均勻；繼續攪拌同時加入過硫酸銨和四甲基乙二胺，并在30~38°C水浴中充 氮反應6~8h，得到反應液；
[0022] 4)將反應液平鋪于不銹鋼托盤中，于-40°C條件下凍干，即制得膠原蛋白敷料。
[0023] 作為優選方案，所述步驟1)中，膠原蛋白酶解液的濃度為7~8mg/mL。
[0024] 作為優選方案，所述步驟1)中，膠原蛋白酶解液的制備方法，包括以下步驟：
[0025] 1)去除牛跟腱上的粗皮毛和皮下脂肪，將牛跟腱置于脫脂劑中進行脫脂處理，水 洗，其中，所述脫脂劑是丙酮和乙醇按重量比3~1 : 1混合而成；
[0026] 2)將洗凈的牛跟腱倒入組織搗碎機中在8000~14000rpm/min條件下攪拌10~ 30min成糊狀，再將糊狀的牛跟腱和質量分數為5%NaCl溶液按重量比1 : 10~20混合 均勻，然后置于攪拌機上攪拌12~24h，過濾，用蒸餾水沖洗感覺，重復沖洗3~5次，瀝干， 得到處理料；
[0027] 3)向處理料按質量比加入1份0. 5~0. 8moL/L的冰醋酸和3份600~700mg/L 的胃蛋白酶的混合物；室溫持續攪拌20~30h得到反應液，再利用0. 5~0. 8moL/L的冰醋 酸調節反應液的pH至5 ;
[0028] 4)向反應液中加入NaCl飽和溶液，攪拌20~30h，離心棄上清，得到沉淀物；再向 沉淀物中滴加摩爾濃度為0. 5~0. 8m〇L的冰醋酸使一級沉淀物完全溶解，離心，取上清液 并用0. 5~0. 8moL/L的冰醋酸調節pH至7. 5;
[0029] 5)向上清液中加入NaCl飽和溶液，攪拌20~30h，離心棄上清，得到沉淀物，再向 沉淀物中滴加摩爾濃度為0. 5~0. 8m〇L的冰醋酸使沉淀物完全溶解，得到溶解液；
[0030] 6)以蒸餾水為透析外液對溶解液透析24~30h，即得膠原蛋白酶解液。
[0031] 本發明中原料選擇的理論基礎
[0032] N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm)類溫敏凝膠的LCST在32~33°C左右，在相變溫 度LCST下體積會發生突變從而實現對藥物釋放的控制，常常通過向N-異丙基丙烯酰胺的 高分子鏈中添加親水或疏水基團來調解凝膠的LCST，使其具有與人體體溫相適應的相變溫 度，因此N-異丙基丙烯酰胺在醫藥、生物工程領域具有廣泛的應用前景。
[0033] 本發明的有益效果在于：
[0034] 膠原蛋白本身具有良好的生物相容性的材料被廣泛運用，一般的膠原制品在體內 的酶解速度較快，這樣就導致膠原本身作為骨架使用或者作為止血材料并提供傷口愈合所 需營養時并不能發揮長效穩定的功效。這樣需要發明一種新型的具有恒定并且更加緩和釋 放的膠原蛋白載體。一方面作為緩釋骨架，改性后的膠原蛋白可以為更多藥品提供緩釋支 架，增加藥物在藥劑上的突破；另一方面，改性后的膠原蛋白擁有與人體37°更為接近的 溫敏性能，在機體的體溫調節下能夠智能響應，調節載體支架的三維構型，從而控制其作為 藥物支架時藥物的釋放速率。另外，作為機體本身在不同病理條件下，不同部位的體溫會有 差異，這種溫敏響應膠原骨架可以更好的通過體溫調節不同藥物的最適釋放速率。
[0035] 本發明在尋找具有溫敏性能的材料上做了大量工作，最后通過驗證發現NIPAAm 與膠原蛋白的組合所制作成型的敷料具有與人體更為接近的突變溫度。通過一系列的實 施案例，尋找到膠原與NIPAAm的最佳比例，并且在輔料的選擇上及比重上做了大量研究工 作，制作出具有良好的吸水性能的敷料，在電鏡掃描中可以發現骨架的密度和孔徑大小最 為合適。
[0036] 在膠原蛋白敷料的制作工藝中，催化劑、引發劑所使用的量進行了大量的探究，尋 找到合適的比例，一方面能促進膠原蛋白和NIPAAm的交聯，另一方面盡量降低輔料的使用 來滿足敷料最終良好的生物相容性。
【附圖說明】
[0037] 圖1為膠原蛋白敷料1~4的樣品與空白的純膠原蛋白敷料的SEM掃描電鏡下觀 察圖；
[0038] 其中，圖1A為膠原蛋白敷料1樣品的SEM掃描電鏡下觀察圖；
[0039] 圖1B為膠原蛋白敷料2樣品的SEM掃描電鏡下觀察圖；
[0040] 圖1C為膠原蛋白敷料3樣品的SEM掃描電鏡下觀察圖；
[0041] 圖1D為膠原蛋白敷料4樣品的SEM掃描電鏡下觀察圖；
[0042] 圖1E為空白的純膠原蛋白敷料的SEM掃描電鏡下觀察圖。
【具體實施方式】
[0043] 為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但 本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。
[0044] 一種具有溫敏性能的膠原蛋白敷料，所述膠原蛋白敷料的原料按重量份數比計包 括1份的膠原蛋白酶解液、16~25份的N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm)和70~90份的純化 水。
[0045] 所述膠原蛋白敷料的原料還包括輔料，所述輔料按重量份數比計由0. 05~0. 1份 的N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA)、0. 002~0. 01份的過硫酸銨（APS)和0. 0