照射放射線時，球狀的細胞型態越明顯，神經膠質瘤細胞則因死亡而未見貼附的細胞。
[0035]試驗例2-2:基因表達分析
[0036]為確定篩選到的神經膠質瘤干細胞的標記，先以RNA提取試劑盒(Qiagen)抽取神經膠質瘤干細胞的RNA，并以RT-PCR檢測0LIG2、Sox2、CD133和Nestin的基因表達，并以GAPDH為內對照組。
[0037]試驗例2-3:ffestern印跡法
[0038]再進一步以Western印跡法確認篩選到的神經膠質瘤干細胞的蛋白質標記表達。將細胞以含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(Roche)的RIPA緩沖溶液破細胞，并以Western印跡法分析神經膠質瘤干細胞Connexin45、GFAP、S100b、S0X2、Nestin和0LIG2蛋白質的表達。
[0039]試驗例2-4:體內試驗
[0040]將3X 106篩選到的神經膠質瘤干細胞于100 μ L的PBS中，以皮下注射至Scid/bg小鼠的右側，并將IX 10s篩選到的神經膠質瘤干細胞于2yL的PBS中，以立體定位注射至Scid/bg小鼠的右側紋狀體。分別于注射后1至10周犧牲小鼠，進行腦部組織冷凍切片，并以蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin and eosin stain)和免疫組織化學染色(immunohi stochemi stry)，確定所篩選到的神經膠質瘤干細胞是否可于小鼠體內形成腫瘤。
[0041]比較例:初代神經膠質瘤細胞的分離與培養
[0042]收集多形性膠質母細胞瘤組織，先以生理食鹽水清洗并將其剪碎，于室溫以酶[含有40mg第4型膠原蛋白酶和100U第5型玻尿酸酶的漢克平衡鹽緩沖液(Hank balancedsalt soult1n)]消化3小時，并以細胞篩過濾，將打散為單個細胞或小片段的細胞懸浮液以含有10%患者血清的基本培養基(Dulbeccc/ s Modified Eagle Medium, DMEM)，培養于37°C含5% C02培養箱內。
[0043]試驗例3:樹突狀細胞的制備
[0044]樹突狀細胞來源為外周血單核球細胞(peripheral blood mononucleatedcells, PBMC)，收集患者的外周血，并通過分離術將單核球細胞自外周血中分離出來,并收集50-100mL的患者血清以作為后續體外細胞培養的用。將分離出的單核球細胞，以2X 106細胞/mL的密度培養于含有2%患者血清的A頂-V培養基(Invitrogen)中，于37°C 2小時后，單核球細胞會貼附于塑料細胞培養皿上，以PBS清洗掉未貼附的單核球細胞，并收集剩余的單核球細胞先冷凍于-196°C液態氮中保存備用。
[0045]將上述分離好的單核球細胞，以顆粒性巨嗷細胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor, GMCSF ；Becton Dickinson)和白細胞介素-4 (interleukin 4，IL-4 ；Becton Dickinson)誘導分化為樹突狀細胞，將單核球細胞于含有50ng/mL GMCSFU000U/mL IL-4及2%患者血清的A頂-V培養基中，置于37°C含5%C02培養箱內培養7天后，以流式細胞儀分析細胞是否具有MHC I和MHC II細胞表面抗原，以確認細胞是否已分化為樹突狀細胞。
[0046]試驗例4:樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備
[0047]分別以劑量為lOOGy的137銫照射神經膠質瘤干細胞和初代神經膠質瘤細胞，分別將照射放射線后的神經膠質瘤干細胞和初代神經膠質瘤細胞離心，并以細胞培養液打散，以1:1的比例與成熟的樹突狀細胞混合共同培養于37°c含5% C02培養箱內18至24小時后，可得本發明負載有神經膠質瘤干細胞的樹突狀細胞腫瘤疫苗，以及比較例初代神經膠質瘤細胞抗原的樹突狀細胞腫瘤疫苗。將上述的樹突狀細胞腫瘤疫苗以人類血清白蛋白稀釋并分為10管，每管含有2至5X 107樹突狀細胞，并冷凍于_196°C液態氮中保存備用。
[0048]試驗例5:樹突狀腫瘤疫苗對神經膠質瘤干細胞的毒殺作用
[0049]參考圖2A和圖2B，圖2A為比較例的樹突狀細胞腫瘤疫苗對于⑶133陰性神經膠質瘤細胞毒殺作用的流式細胞儀結果圖，圖2B為比較例的樹突狀細胞腫瘤疫苗對于CD133陽性神經膠質瘤細胞毒殺作用的流式細胞儀結果圖。其中白底的細胞群表示神經膠質瘤細胞，黑底的細胞表示神經膠質瘤干細胞。樹突狀細胞腫瘤疫苗和神經膠質瘤細胞的比例為1:1，神經膠質瘤細胞另分別以5Gy和10Gy的劑量進行放射線照射。結果顯示，無論是在CD133陰性或CD133陽性的神經膠質瘤細胞，經放射線照射后，神經膠質瘤細胞的數目皆下降，特別是另施以樹突狀細胞腫瘤疫苗的組別，神經膠質瘤細胞數目下降的情況更加明顯。但神經膠質瘤干細胞的數目，卻沒有因為放射線照射或施以樹突狀腫瘤疫苗而下降，顯示比較例的樹突狀腫瘤疫苗無法有效毒殺神經膠質瘤干細胞。
[0050]參考圖3，(A)部分為比較例的樹突狀細胞腫瘤疫苗對于神經膠質瘤干細胞毒殺作用的顯微照片圖，(B)部分為本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗對于神經膠質瘤干細胞毒殺作用的顯微照片圖，結果顯示，施以比較例的樹突狀細胞腫瘤疫苗的組別，大部分的神經膠質瘤干細胞仍貼附于細胞培養皿上，細胞間的界線明顯未受影響，然而施以本發明的樹突狀腫瘤疫苗的組別，細胞變得較大呈囊泡狀，并有堆棧和漂浮的群落產生，細胞變得不健康且持續死亡。
[0051]另參考圖4和圖5，圖4為本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗對神經膠質瘤干細胞毒殺作用的顯微照片圖，(A)、(B)和(C)部分分別為施以本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗后第18,90和120小時的顯微照片。圖5為本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗和神經膠質瘤細胞分別以1:1、3:1和10:1的比例對進行毒殺作用，于第18和第120小時的量化圖。由圖4結果顯示，本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗在第18小時即對神經膠質瘤干細胞具有毒殺作用，其效果于第90小時和第120小時更加明顯，細胞成囊泡狀且逐漸死亡。而于圖5的結果顯示，本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗不僅對于神經膠質瘤細胞具有毒殺作用，也對于神經膠質瘤干細胞具有毒殺作用，特別是在第120小時的效果相當顯著，且對于神經膠質瘤細胞和神經膠質瘤干細胞的毒殺作用，亦與樹突狀細胞腫瘤疫苗和神經膠質瘤細胞的比例呈正相關。
[0052]根據上述，本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法不限于神經膠質瘤，亦可用于各種離體腫瘤組織進行樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備，而所制得的樹突狀細胞腫瘤疫苗不僅具有良好的毒殺腫瘤細胞能力，更對于癌干細胞具有特異性的毒殺作用，以解決以腫瘤細胞為標靶的腫瘤疫苗對于癌干細胞不具有毒殺作用，而于治療的后復發率和轉移率高的問題。且本發明的樹突狀細胞腫瘤疫苗因為自體腫瘤干細胞和自體樹突狀細胞制得，對于日后治療的免疫排斥性低，免疫的全面性和特異性也更優于非利用自體樹突狀細胞及腫瘤抗原的腫瘤疫苗，為極具前景的腫瘤治療方法。
[0053]本發明已以實施方式揭露如上，然而其并非用以限定本發明，任何本領域技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，可作各種修改與改變，因此本發明的保護范圍以權利要求書為準。
【主權項】
1.一種樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，包含下列步驟: (a)對一腫瘤組織進行原代分離和培養得到腫瘤細胞； (b)以流式細胞儀自該腫瘤細胞篩選具有特定細胞表面抗原的癌干細胞； (c)將步驟(b)所得到的該癌干細胞照射放射線； (d)分離樹突狀細胞； (e)將該樹突狀細胞與(c)步驟所得的該癌干細胞共同培養，得到混合該樹突狀細胞和該癌干細胞的樹突狀細胞腫瘤疫苗。2.根據權利要求1所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其中該腫瘤組織為多形性膠質母細胞瘤。3.根據權利要求1所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其中該癌干細胞為神經膠質瘤干細胞。4.根據權利要求1所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其中該特定細胞表面抗原為 CD 133 及 CD15。5.根據權利要求1所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其中該放射線劑量為100Gyo6.一種樹突狀細胞腫瘤疫苗，為一樹突狀細胞和一癌干細胞混合而得。7.根據權利要求6所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗，其中該樹突狀細胞為自體樹突狀細胞。8.根據權利要求6所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗，其中該癌干細胞為自體癌干細胞。9.根據權利要求6所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗，其中該癌干細胞為CD133陽性細胞。10.根據權利要求6所述的樹突狀細胞腫瘤疫苗，其中該癌干細胞為神經膠質瘤干細胞。
【專利摘要】本發明提供一種樹突狀細胞腫瘤疫苗，其為樹突狀細胞和癌干細胞共同培養而得。本發明另提供一種樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，自腫瘤組織中分離癌干細胞，并經由流式細胞儀篩選出癌干細胞，以放射線照射目標癌干細胞后，與樹突狀細胞共同培養，以得樹突狀細胞腫瘤疫苗。
【IPC分類】A61P35/00, A61K39/00
【公開號】CN105363027
【申請號】CN201410437169
【發明人】周德陽, 邱紹智
【申請人】中國醫藥大學附設醫院
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年8月29日