一種陰道基質材料及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞外基質及其制備方法，具體的說是涉及一種陰道基質材料及其制備方法。
【背景技術】
[0002]細胞外基質材料(亦稱脫細胞基質材料)是由組織或器官脫細胞后剩余的結構和功能蛋白的復合體，其由膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖和多種生長因子等構成，它對細胞黏著，細胞分化和細胞與生物材料之間的連接有著重要的作用。并且，細胞外基質材料移植后會逐漸降解為單肽類物質，其具有很強的生物活性，具有抗菌性，趨化宿主細胞和促其有絲分裂的特性。因其具有來源廣泛，無免疫原性，良好生物相容性，生物活性及抗菌性等優點，越來越受到人們的重視。
[0003]目前脫細胞基質材料通常采用動物組織或器官經過脫細胞處理后形成具有一定機械性能和生物性能的支架材料。現已公開報道的有關脫細胞基質材料的制備方法有很多。如CN103191466B公開的一種制備人體或動物脫細胞組織的方法，其是以人類或動物組織中的皮膚、胸腹膜、食道粘膜、心臟瓣膜、骨、軟骨、肌腱等為基材，經過初步加工制成所需形狀后，經過滅活、采用含過氧乙酸、氯化鈉、表面活性劑、燒堿的溶液進行兩次脫脂，然后采用過氧乙酸、氯化鈉、表面活性劑、胰酶或胰蛋白酶的溶液進行脫細胞處理，最后保存、凍干，由此將動物組織或器官進行脫細胞處理。該方法列舉了許多具體的人類/動物組織，但采用的都是同一種處理方法。本領域技術人員都知曉，在組織和器官脫細胞方法中，選用的組織不同，其脫細胞方法也不盡相同。每一種處理方法都會對所制備的支架材料的生物學組成以及組織的超微結構、機械性能產生不同的影響。另外，該文獻也未曾公開任何一個具體實例，說明其所制的具體材料的生物學特性以及機械性能特點。因此，該文獻對本領域技術人員不具有任何指導意義。朞惠等研究人員對脫細胞真皮基質制備及其生物相容性進行了研究，其采用的方法是采用新生小牛背部真皮組織，以0.5%SDS溶液水平振蕩脫細胞，然后采用0.5%胰蛋白酶行膠原纖維結構重塑，再用甲醛浸泡進行交聯，0.5%硫酸軟骨素溶液中超聲振蕩進行表面修飾。該方法制備的是一種適合軟骨細胞生長的生物支架(詳見朞惠等.脫細胞真皮基質制備及其生物相容性研究.中國修復重建外科雜志2014年6月第28卷第6期)。CN101366975B (ZL200810150792.5)公開了一種脫細胞小腸粘膜下層生物材料的制備方法，該方法是以小腸粘膜下層為基材，首先通過刮除小腸粘膜、肌層和漿膜獲得粘膜下層，然后放入0.1-1M的NaOH溶液中進行脫細胞處理，脫細胞處理的粘膜下層置入含DNA酶和α -半乳糖苷酶的混合液中，進行酶處理，將酶處理的粘膜下層于冷凍保護液中浸泡處理后，再經冷凍干燥，形成脫細胞小腸粘膜下層生物材料的膜狀產品。由此可見，目前對不同組織來源的材料的處理方法都不盡相同。
[0004]目前針對不同的疾病需求，動物組織脫細胞基質材料的研究有多種，如心臟、肝臟、肺臟、膀胱、皮膚、小腸粘膜、胸膜、腹膜、心包膜等等。陰道組織缺失、盆底損傷和機能退化造成的盆腔器官脫垂是婦產科常見的一些疾患。先天性無陰道(MRKH綜合征)、兩性畸形、創傷、腫瘤術后等均可導致陰道組織缺失。陰道組織缺失給患者軀體帶來痛苦的同時，也給患者造成巨大的精神心理壓力。盆底損傷和機能退化造成的盆腔器官脫垂(pelvic organprolapse, POP),嚴重影響了中老年婦女的健康和生活質量。這兩種疾病用到的脫細胞基質材料主要是以動物真皮、小腸粘膜和膀胱為基材，這可能是源于真皮、膀胱固有層或小腸粘膜下層比較容易進行切割、處理的緣故(如:選用真皮可采用機器切割方式或用切割刀，即可除去表皮，獲得所需真皮材質；膀胱固有層和小腸粘膜下層由于具有上皮層和肌層且與所取組織連接疏松的生理結構的特性，因此比較容易獲得)。并且，雖然已有材料的應用起到了一定的治療效果，但其生物活性、生物力學性能及其治療效果還有待進一步提高。研究者希望找到并制備出更適用于盆底修復、陰道重建的脫細胞基質材料。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種更適用于盆底修復或陰道重建的脫細胞陰道基質材料及其制備方法。
[0006]本發明的目的是這樣實現的:
本發明所提供的脫細胞陰道基質材料，其載體為豬/牛陰道組織粘膜層，所述載體經以下方式處理:
Ca)將豬/牛陰道組織粘膜層在含有苯甲基磺酰氟的去離子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震蕩處理24-72小時；其中所述Tris溶液，其濃度為0.01M、pH為8.0 ;去離子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的濃度為0.1mM/L ;
(b)將(a)步驟處理過的粘膜層放置在所含十二烷基硫酸鈉的質量體積濃度為0.1-1%的水溶液或Tris-HCl緩沖溶液中震蕩處理8-12小時；
(c)將(b)步驟處理過的粘膜層，經磷酸鹽緩沖液漂洗，然后用所含TritonX-100的體積濃度為0.1-1%的Tris-HCl緩沖溶液震蕩處理6_10天，再經磷酸鹽緩沖液漂洗；
上述(c)、(b)步驟中的所有溶液及緩沖溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟；
Cd)將(c)步驟處理過的粘膜層，放置在含脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl緩沖溶液中，在32°C _37°C溫度下震蕩處理8-12小時，再經磷酸鹽緩沖液漂洗；
(d)步所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為0.05M、pH值為8.0 ;其所含脫氧核糖核酸酶的濃度30-70U/mL ;所含核糖核酸酶的濃度為l_5U/mL ;
(e)將(d)步驟處理過的粘膜層，消毒和凍干，即得陰道基質材料。
[0007]本發明還提供了所述陰道基質材料的制備方法，具體包括以下步驟:
Ca)將豬/牛陰道組織，采用鈍器和銳器交替剝離除去陰道組織的外膜層及肌層，留取厚度均勻、無損傷的陰道粘膜層，漂洗后，放置在含有苯甲基磺酰氟的去離子水溶液或含有苯甲基磺酰氟的Tris溶液中震蕩處理24-72小時；其中所述Tris溶液的濃度為0.01M,pH為8.0 ;去離子水溶液及Tris溶液中所含苯甲基磺酰氟的濃度為0.1mM/L ；
其中所述的鈍器如機械手、機械鉗；銳器如切割刀、手術刀、手術剪等，如此采用鈍器和銳器交替剝離法，解決了陰道組織皺襞多、質地致密、粘膜層難以剝離的難題；
(b)將(a)步驟處理過的粘膜層放置在所含十二烷基硫酸鈉的質量體積濃度為0.1-1%的水溶液或Tris-HCl緩沖溶液中震蕩處理8-12小時；
(c)將(b)步驟處理過的粘膜層，經磷酸鹽緩沖液漂洗，然后用所含TritonX-100的體積濃度為0.1-1%的TriS-HCl緩沖溶液震蕩處理6_10天，再經磷酸鹽緩沖液漂洗；
上述(c)、(b)步驟中的所有溶液及緩沖溶液中均含有0.1mM/L的苯甲基磺酰氟；(c)步和(b)步中所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為0.01M、pH為8.0 ;
Cd)將(c)步驟處理過的粘膜層，放置在含脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl緩沖溶液中，在32°C _37°C溫度下震蕩處理8-12小時，再經磷酸鹽緩沖液漂洗；
其中所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為0.05M、pH值為8.0，其所含脫氧核糖核酸酶的濃度30-70U/mL，所含核糖核酸酶的濃度l_5U/mL ;
(e)將(d)步驟處理過的粘膜層，消毒和凍干，即得陰道基質材料。
[0008]所述陰道基質材料的制備方法中，步驟(e)中所述消毒的優選方案是:使用含過氧乙酸和乙醇的溶液將(d)步驟處理過的粘膜層在25°C條件下震蕩處理2小時，振蕩速率為80-200rpm，然后依次使用無菌磷酸鹽緩沖液和無菌去離子水漂洗；其中，所述含過氧乙酸和乙醇的溶液中，所含過氧乙酸的體積百分含量為0.1%，所含乙醇的體積百分含量為20%。
[0009