改進的脂質制劑的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2010年6月10日、題為《改進的脂質制劑》的中國發明專利申 請201080026228. 8的分案申請。
[0002] 優先權要求
[0003] 本申請要求于2009年6月10提交的美國第61/185, 800號申請和2009年9月22 日提交的美國第61/244, 834號申請的優先權，其中每個專利申請的內容通過引用整體并 入本文。
技術領域
[0004] 本發明涉及利用脂質顆粒遞送治療劑的領域。具體地，本發明提供了有利于核酸 的體內遞送的陽離子脂質和含有此類脂質的脂質顆粒，以及適合用于體內治療用途的核 酸-脂質顆粒組合物。此外，本發明提供了制備此類組合物的方法以及利用此類組合物將 核酸引入細胞的方法，例如用于多種疾病癥狀的治療。
【背景技術】
[0005] 治療性核酸包括例如小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反義寡核苷酸、核酶、質 粒和免疫刺激性核酸。此類核酸通過多種機制起作用。對于siRNA或miRNA，此類核酸可 通過稱為RNA干擾（RNAi)的過程下調特定蛋白質的細胞內水平。在將siRNA或miRNA引 入細胞質后，此類雙鏈RNA構建體可結合稱為RISC的蛋白質。siRNA或miRNA的有義鏈在 RISC復合物中被取代，從而在RISC內提供了可識別和結合具有與所結合的siRNA或miRNA 的序列互補的序列的mRM的模板。在結合互補mRNA后，RISC復合物切割mRNA并且釋放 切割的鏈。RNAi可通過編碼蛋白質合成的相應mRNA的革巴向特異性破壞來提供特定蛋白質 的下調。
[0006] RNAi的治療性應用極其廣泛，因為SiRNA和miRNA構建體可用針對靶蛋白質的任 何核酸序列合成。迄今為止，siRNA構建體在體外和體內模型中都已顯示出特異性下調靶 蛋白質的能力。此外，目前正在臨床研宄中評估siRNA構建體。
[0007] 然而，目前SiRNA或miRNA構建體面臨的兩個問題是：首先，它們在血漿中對核酸 酶消解的易感性，其次，它們有限的進入細胞內區室（當以游離siRNA或miRNA形式全身性 施用時它們可在所述區室中結合RISC)的能力。這些雙鏈構建體可通過將化學修飾的核苷 酸連接子例如硫代磷酸酯基團摻入分子內來進行穩定。然而，這些化學修飾只提供有限的 免受核酸酶消解的保護作用并且可降低構建體的活性。siRNA或miRNA的細胞內遞送可通 過使用載體系統（例如聚合物、陽離子脂質）或通過化學修飾構建體（例如通過膽固醇分 子的共價結合）來進行促進。然而，需要改進的遞送系統來增加 siRNA和miRNA分子的效 能并且減少或消除對化學修飾的需要。
[0008] 反義寡核苷酸和核酶也可抑制mRNA翻譯成蛋白質。對于反義構建體，這些單鏈 脫氧核酸具有與靶蛋白質mRNA的序列互補的序列并且可按照沃森-克里克堿基配對結合 mRNA。該結合阻止靶mRNA的翻譯和/或觸發mRNA轉錄體的RNA酶H降解。結果，反義寡 核苷酸具有作用特異性（即，特定疾病相關蛋白的下調）的巨大潛力。迄今為止，此類化 合物已表明在幾種體外和體內模型（包括炎性疾病、癌癥和HIV的模型）中具有希望（于 Agrawal，Trends in Biotech. 14:376-387(1996)中介紹）。反義鏈也可通過與染色體 DNA 的特異性雜交影響細胞活性。目前正在進行幾種反義藥物的人晚期臨床評估。此類藥物的 靶點包括bcl2和載脂蛋白B基因以及mRNA產物。
[0009] 免疫刺激性核酸包括脫氧核糖核酸和核糖核酸。對于脫氧核糖核酸，已顯示某些 序列或基序引發哺乳動物的免疫刺激。此類序列或基序包括CpG基序、富含嘧啶的序列和 回文序列。脫氧核糖核酸中的CpG基序相信可被內體受體、即toll-樣受體9(TLR-9)特異 性識別，所述受體隨后觸發先天性和獲得性免疫刺激途徑。還報導了某些免疫刺激核糖核 酸序列。此類RNA序列據認為通過結合toll-樣受體6和7 (TLR-6和TLR-7)觸發免疫活 化。此外，還報導了雙鏈RNA具有免疫刺激性并且據認為通過結合TLR-3而活化。關于治療 性核酸的用途的一個公知的問題涉及磷酸二酯核苷酸間鍵合的穩定性和該連接子對核酸 酶的易感性。血清中外切核酸酶和內切核酸酶的存在導致具有磷酸二酯連接子的核酸的快 速降解，從而，治療性核酸在血清存在的情況下或在細胞內具有極短的半衰期。（Zelphati， 0·等人，Antisense. Res. Dev. 3:323-338(1993);和Thierry，A.R.等人，第147-161 頁，Gene Regulation :Biology of Antisense RNA and DNA (編輯 Ericksoruiyi^PIzantJGiRaven PreSS，NY(1992))。由于這些和其他已知的問題，目前正在開發的治療性核酸不使用在天然 核酸中發現的基本磷酸二酯化學物質。
[0010] 該問題已通過減少血清或細胞內降解的化學修飾得到部分克服。已測試核苷酸間 磷酸二酯橋上（例如，使用硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯鍵合）、核苷酸堿基上（例 如，5-丙炔基-喃啶）或糖上（例如，2'-修飾的糖）的修飾（Uhlmann E.等人Antisense : Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer，第 X 卷，pp 64-81Academic Press Inc. (1997))。其他研宄人員已試圖利用2'-5'糖鍵合提高穩定性（參見，例如美國專利 No. 5, 532, 130)。已嘗試其他改變。然而，這些解決方法中沒有一個已證明完全令人滿意， 并且體內游離治療性核酸仍然只具有有限的功效。
[0011] 此外，如上文中關于siRNA和miRNA所指出的，問題仍然在于有治療性核酸穿過細 胞膜的有限能力（參見，Vlassov 等人，Biochim. Biophys. Actal 197:95-1082 (1994))和在 于與全身性毒性例如補體介導的過敏反應、改變的凝血性質和血細胞減少（Galbraith等 人，Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206(1994))相關的問題。
[0012] 為了嘗試提高功效，研宄者也已利用基于脂質的載體系統遞送化學修飾的或未修 飾的治療性核酸。在 Zelphati，0 和 Szoka，F. C.，J. Contr. Rel. 41:99-119(1996)中，作者 提及陰離子（常規的）脂質體、PH敏感性脂質體、免疫脂質體、膜融合脂質體（fusogenic liposome)和陽離子脂