用于腫瘤治療的基于EGFRvIII序列的肽疫苗的制作方法
【專利說明】用于腫瘤治療的基于EGFRvIII序列的肽疫苗 發明領域
[0001] 本發明涉及可用于針對表達III型突變型表皮生長因子受體的癌細胞產生免疫 應答的肽靶標。本發明涉及疫苗及在抗癌治療和方案中使用所述疫苗的方法。
[0002] 發明背景
[0003] 本發明是在政府支持下，在美國國立衛生研宄院授予的合同CA 124832下進行。 政府享有本發明中的某些權利。
[0004] 本申請要求2012年8月2日提交的美國臨時專利申請號61/678, 800的優先權， 所述專利申請以引用方式并入本文。
[0005] 表皮生長因子受體（在人中也被稱為EGFR、ErbB-1、HERl)為細胞表面受體，當它 與特定配體如表皮生長因子（EGF)和轉化生長因子a (TGFa)結合時，其被激活。對應于 正常EGF受體的cDNA序列公開于Ullrich等Nature 1984309, 418-425中。
[0006] Wong 等，Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89, 2965-2969 和 PCT 申請號 PCT/ US90/04489報道了五個惡性神經膠質瘤中，與編碼EGFR的基因的重排或缺失相關的基因 改變，其包括被稱為III型突變型EGF受體（以下為EGFRvIII)的變異型EGFR，該變異型 EGFR為對應于EGF受體cDNA中核苷酸275-1075之間的缺失的EGFR基因的剪接變體的翻 譯產物，所述缺失對應于編碼受體的胞外結構域的編碼序列的一部分的缺失，所述編碼序 列的一部分的缺失對應于外顯子2至7,使得外顯子1接合到外顯子8。由該缺失形成的同 框剪接接頭包括編碼兩個序列接合處的甘氨酸殘基的密碼子。未在正常的EGFR基因中的 正常外顯子1編碼序列或正常外顯子8編碼序列中相應的位置處找到此甘氨酸殘基編碼序 列。EGFRvIII缺失導致通常情況下遠距離的序列的融合而產生在此融合接頭編碼新穎肽序 列的突變序列。
[0007] EGFRvIII是在人腫瘤中最經常出現的天然存在的突變型EGFR，并且在被稱為多 形性成膠質細胞瘤的腦腫瘤中尤為普遍。據報道，EGFRvIII存在于56%的成膠質細胞瘤和 16%的非小細胞肺癌中。Moscatello等Cancer Res. 1995, 55, 5536-5539報道已發現所述 EGFRvIII存在于78%的乳腺癌中。因此EGFRvIII被鑒定為潛在理想腫瘤靶標，因為未在 任何正常組織中發現該序列。
[0008] 對應于外顯子2至7的缺失，其中外顯子1接合到外顯子8,所述缺失為產生接頭 處的新甘氨酸的密碼子的同框改變。所產生EGFRvIII蛋白的氨基末端的特征在于氨基酸 序列LEEKKGNYVVTDH，SEQ ID N0:1，其中L代表成熟蛋白的第一個氨基酸，并且G為外顯子 1至8融合的結果。
[0009] 使用包含對應于EGFRvIII接頭的肽的疫苗以預防在動物模型中過度表達 EGFRvIII的腫瘤或誘導這種腫瘤的消退。使用肽LEEKKGNYVVIDHC SEQ ID N0:2(其中添加 了末端半胱氨酸以用于綴合目的）綴合到免疫刺激分子KLH來形成疫苗。雖然沒有任何直 接實驗證據，但是認為甘氨酸是此肽被免疫系統識別為異物的關鍵特征，因為其為新穎的。 現在這種特定的肽：KLH綴合疫苗已用于針對成膠質細胞瘤的II期臨床試驗中，其中與匹 配的歷史對照組的15個月相比，其表現出26個月的平均存活期。
[0010] 基于由剪接接頭編碼的蛋白質序列的肽描述于美國專利號6, 224,868、 5, 212, 290、5, 401，828、5, 710, 010、5, 814, 317、5, 981，725、6, 127, 126 和 6,455,498 中。 此外，這些專利公開了綴合至載體如鑰孔血藍蛋白（KLH)的肽以及其作為疫苗的用途。 Sampson等美國公布號20090220551公開了具有不同C末端的EGFRvIII肽并且大體公開了 在癌癥治療方案中使用所述肽作為輔助療法的方法。
[0011] Heimberger 和 Sampson，Expert Opin Biol Ther. 2009 年 8 月；9 (8) : 1087-1098 公開了來自于使用包含具有綴合至KLH的SEQ ID NO: 2的EGFRvII I肽的EGFRvIII-KLH綴 合物來治療患有成膠質細胞瘤的患者的三個不同臨床試驗的結果。在一個試驗中，患者首 先進行腫瘤切除，然后進行放射療法。此后，從患者分離樹突細胞（DC)，用EGFRvIII-KLH綴 合物進行脈沖并且作為自體DC再次引入患者體內。在第二個試驗中，患者進行腫瘤切除， 然后進行放射療法，并且然后通過注射將EGFRvIII-KLH綴合物直接施用至患者。在第三個 試驗中，患者進行腫瘤切除，然后在通過注射將EGFRvIII-KLH綴合物直接施用至患者后， 進行放射療法，同時使用替莫唑胺（TMZ)對患者進行化學療法。在每個臨床試驗中，與歷史 時間進展和總存活統計數據相比，觀察到時間進展和總存活的改善。
[0012] 當前的疫苗雖然表現出存活期顯著延長，但是不能治愈。顯然，患者期望在長期存 活方面提供最好可能機會的治療。因此，存在提供改善的EGFRvIII疫苗以增強存活的需 要。存在對可用于改善診斷出患有表達EGFRvIII的癌癥的患者的臨床結果的改善的組合 物和療法的需要。
[0013] 發明概述
[0014] 本發明涉及包含預防或治療有效量的綴合至載體的肽的疫苗組合物，所述肽具有 下式：
[0015] Ll-E2-Glu-Lys-Lys-Xaa6-N7-Y8-V9-V10-Tl 1-D12-H13-C14-載體
[0016] 其中
[0017] Ll不存在或為Leu;
[0018] E2不存在或為Glu;
[0019] Xaa6 為 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、 Thr、Trp、Tyr 或 Val ;
[0020] N7不存在或為Asn ;
[0021] Y8不存在或為Tyr;
[0022] V9不存在或為Val ;
[0023]VlO不存在或為Val;
[0024] Tll不存在或為Thr;
[0025] D12不存在或為Asp;
[0026] H13不存在或為His;
[0027] C14為Cys或可將肽連接至載體的連接部分。
[0028] 在一些實施方案中，Xaa6為Ala、Val或Pro。在一些實施方案中，Ll-E2-Glu_Ly s-Lys-Xaa6-N7-Y8-V9-V10-Tll-D12-H13-C14包含至少4個氨基酸、至少5個氨基酸、至少 6個氨基酸、至少7個氨基酸、至少8個氨基酸、至少9個氨基酸、至少10個氨基酸、至少11 個氨基酸、至少12個氨基酸、至少13個氨基酸或至少14個氨基酸。
[0029] 在一些實施方案中，本發明提供包含預防或治療有效量的綴合至載體的肽的疫苗 組合物，所述肽具有下式：
[0030] a -Glu-Lys-Lys-Xaa-0
[0031] 其中
[0032] a 不存在、為酰基、Leu-Glu ;Glu;或 Leu;
[0033] Xaa 為 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、 Thr、Trp、Tyr 或 Val ;并且
【主權項】
1. 一種疫苗組合物，其包含預防或治療有效量的綴合至載體的肽，所述疫苗具有下 式： Ll-E2-Glu-Lys-Lys-Xaa6-N7-Y8-V9-V10-Tl1-D12-H13-C14-載體 其中 Ll不存在或為Leu; E2不存在或為Glu; Xaa6 為Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val; N7不存在或為Asn; Y8不存在或為Tyr; V9不存在或為Val; VlO不存在或為Val; Tll不存在或為Thr; D12不存在或為Asp; H13不存在或為His; C14為Cys或可將所述肽連接至載體的連接部分。
2. 根據權利要求1所述的疫苗，其中所述載體為半抗原。
3. 根據權利要求1所述的疫苗，其中所述載體為KLH、BSA或HSA。
4. 根據權利要求1所述的疫苗，其中Xaa6為Ala、Val或Pro。
5. 根據權利要求 1 所述的疫苗，其中Ll-E2-Glu-Lys-Lys-Xaa6-N7-Y8-V9-V10-T11_D1 2-H13-C14包含至少4個氨基酸、至少5個氨基酸、至少6個氨基酸、至少7個氨基酸、至少 8個氨基酸、至少9個氨基酸、至少10個氨基酸、至少