專利名稱：新型血吸蟲疫苗肽的制作方法
技術領域：
本發明屬于有機化合物。
血吸蟲病在世界范圍內嚴重危害人類健康，控制疾病流行的重要策略之一是研制有效的抗血吸蟲病疫苗。為了解決傳統照射減弱活疫苗制備中蟲體來源困難以及保證疫苗的安全性、避免致病性，目前人們正積極致力于分子疫苗的研究，如基因上程疫苗、合成多肽疫苗的研究。其中，合成多肽疫苗的意義在于用含蛋白質抗原表位的多肽片段代替整個蛋白質作疫苗抗原，可以避免使用母體蛋白引起的副作用，且可以用化學方法大量合成，易于制得化學純，接種量小，無滅活不完全造成的致病危險，有實際應用前景。
然而，合成多肽一般是小分子半抗原，在體內易被迅速降解、排泄，傳統的解決方法是將多肽與蛋白質載體偶聯形成多肽-載體復合物。本發明的目的在于用J.P.Tam新近提出的多抗原肽(multiple antigen peptide,MAP)概念制備含血吸蟲抗原肽的MAP化合物作為血吸蟲病疫苗抗原。其優點在于可以將兩種不同的抗原肽結合在同-疫苗分子中，產生協同效應，所合成的新型多抗原肽疫苗能夠誘導實驗動物產生顯著抵抗血吸蟲感染的保護性免疫力，同時避免了使用在體內引起毒副作用的蛋白質載體，因而能夠用于人類臨床，且具有確定的化學結構，性質穩定，便于貯存、運輸和發放。
本發明所涉及的有機化合物-多抗原肽，由多個血吸蟲抗原肽和作為核心基質的寡聚賴氨酸組成，即n級聚合的核心基質由2n-1個賴氨酸組成，可連接2n個多肽片段，其特征在于化學結構如下所示(A-Ag)2n-1(A-Ag′)2n-1(Lys)2n-1-B-X]]>在上式中A為H或RCO-形式的基團，在這里，R是H或C1-5烷基。
Ag和Ag′分別是下列兩種不同的多肽H-Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe-Gln-Asp-Trp-Pro-Lys-OH(P1)H-Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-OH(P2)H-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly-OH(P3)H-Pro-Gln-Ile-Asp-Lys-Tyr-Leu-Lys Ser-Ser-Lys-Tyr-Ile-Ala-Trp-Pro-OH(P4)n是一個從1至10的整數，最好是2或3。
B可以是天然氨基酸殘基，或D-構型的氨基酸殘基，最好是-Gly,-Ala-，或-β-Ala-。
X可以是NHR或OR，在這里，R是H或C1-5烷基。
本發明涉及的多抗原肽及其與免疫佐劑形成的復合物，在體外活性檢測和動物實驗中，表明均有有價值的生物活性。特別是在抗血吸蟲病方面，能夠誘導昆明小鼠和BALB/C小鼠產生抵抗血吸蟲感染的保護性免疫力。如用(P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH和(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH免疫昆明小鼠，以血吸蟲正常尾蚴攻擊感染，與對照組相比，減蟲率分別為40.1％和34.4％；減卵率分別為48.4％和47.4％。用(P1)4(P2)4Lys4Lys2LysGly-OH,(P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH,(P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH和(P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH免疫BALB/C小鼠，減蟲率分別為73.6％,68.4％,47.9％和32.6％；減卵率則分別為75.9％,66.7％,45.4％和38.7％。
本發明涉及的多抗原肽可以用已知的固相多肽合成法來合成，如下述實施例。
實施例1(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH的制備稱150mgt-Boc-Gly-OCH2-Pam樹脂(0.34mol/lg resin)，置多肽合成反應器中，加入二氯甲烷充分溶脹。用50％TFA/DCM脫去t-Boc保護基后，再用10％DIPEA/DCM中和。以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，加入相當于樹脂氨基當量3倍的Nα,Nε-di-t-Boc-賴氨酸二環己基胺鹽，以BOP試劑為偶聯劑，上接第一級賴氨酸，得到[Boc-Lys(Boc)]-Gly-OCH2-Pam樹脂。用同樣的方法接上第二級賴氮酸，得到[Boc-Lys(Boc)]2Lys-Gly-OCH2-Pam樹脂。第三級賴氨酸的α和ε-氨基分別用對酸穩定的Fmoc和對堿穩定的t-Boc選擇性地保護，得到四個Boc和四個Fmoc保護的末端氨基。TFA脫去t-Boc保護基后在4個ε-NH2上用下述的Boc化學依次接上第一種抗原肽的氨基酸。
Boc-氨基酸的側鏈保護基為Glu(OBzl),Lys(2-Cl-Cbz),Ser(Bzl),Thr(Bzl)。重復如下步驟直至完成全部肽鏈的合成(1)在盛Boc保護寡聚賴氨酸-樹脂的反應器中加入TFA/DCM(1∶l,Vol/Vol)洗滌2分鐘；(2)加入TFA/DCM(1∶l,Vol/Vol)反應20分鐘，脫去t-Boc保護基；(3)DCM洗滌，1min/次×3；(4)MeOH洗滌，1min/次×3；(5)10％DIPEA/DCM中和，2min/次×2；(6)DCM洗滌，1min/次×6，抽干；(7)稱取相當于樹脂氨基當量3倍的保護氨基酸、DCC和HOBt加入反應器中，以DMF作溶劑，室溫振搖反應；(8)DCM洗滌，1min/次×3；(9)MeOH洗滌，1min/次×3；(10)DMF洗滌，1min/次×3；(11)MeOH洗滌，1min/次×3；(12)DCM洗滌，1min/次×3，抽干；(13)茚三酮法檢測偶聯反應完成情況，若陰性，接下一個氨基酸；若陽性，則重復7～13步，直至檢測結果為陰性。
在t-Boc-氨基酸肽鏈合成結束后，用哌啶脫去賴氨酸α-NH2上的Fmoc保護基，再用Fmoc保護氨基酸逐步合成第二種抗原肽。Fmoc-氨基酸的側鏈保護基為Arg(Tos),Asp(O-t-Bu),Glu(O-t-Bu),Lys(t-Boc),Ser(t-Bu),Thr(t-Bu)。Fmc-氨基酸肽鏈的合成步驟如下(1)DMF洗滌，1min/次×3；(2)哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)洗滌1min；(3)哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)脫保護，20分鐘；(4)DOM洗滌，1min/次×3；(5)MeOH洗滌，1min/次×3；(6)DMF洗滌，1min/次×3，抽干；(7)稱取相當于樹脂氨基當量3倍的Fmoc-氨基酸、DCC和HOBt加入反應器中，以DMF作溶劑，室溫振搖反應；(8)DMF洗滌，1min/次×3；(9)MeOH洗滌，1min/次×3；(10)DCM洗滌，1min/次×3；(11)DMF洗滌，1min/次×3；(12)DCM洗滌，1min/次×3，抽干；(13)茚三酮法檢測偶聯反應完成情況，若陰性，接下一個氨基酸；若陽性，則重復7～13步，直至檢測結果為陰性。
Fmoc-氨基酸肽鏈合成結束后，用哌啶/DMF(1∶1,Vol/Vol)脫去Nα-Fmoc保護基，再用TFA/DCM(1∶1,Vol/Vol)脫去Nα-Boc保護基。low-high HF法脫去側鏈保護基并切下樹脂，肽-樹脂混合物用10％醋酸溶液抽提，冷凍干燥得粗品肽，經SephadexG-50凝膠滲透色譜法分批純化，凍干得白色粉末狀固體295mg，收率44.2％,[α]D23=-74.2°(C=0.07,H2O)，產品肽的結構由氨基酸組成分析確定。
下列多抗原肽也可以用實施例1中給出的相似方法來合成實施例2 (P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH [α]D23=-61.2°(C=0.085,H2O)實施例3 (P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH [α]D23=-54.5°(C=0.14,H2O)實施例4 (P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-61.8°(C=0.055,H2O)實施例5 (P1)4(P2)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-72.7°(C=0.055,H2O)實施例6 (P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH [α]D23=-70.5°(C=0.095,H2O)縮略語表Ag antigen 抗原Alaalanine 丙氨酸Argarginine 精氨酸Ashasparagine 天冬酰胺Aspaspartic acid 天冬氨酸t-BOC t-butyloxycarbonyl 叔丁氧羰基t-Bu t-butyl 叔丁基BOPbenzotriazolyl-1-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate
Bzlbenzyl 芐基Cbzbenzyloxycarbonyl 芐氧羰基DCCdicyclohexylcarbodiimide 二環己基碳二亞胺DCMdichloromethane 二氯甲烷DIPEA diisopropylethylamine 二異丙基乙基胺DMFdimethylformamide 二甲基甲酰胺Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 9-芴甲氧羰基Glyglycine 甘氨酸Gluglutamie acid 谷氨酸Glnglutamine 谷氨酰胺HOBt 1-hydroxybenzotriazole 1-羥基苯并三氮唑Ileisoleucine 異亮氨酸Lleleucine 亮氨酸Lyslysine 賴氨酸MAPmultiple antigen peptide 多抗原肽Pam resin phenylacetamidomethyl resin Pam樹脂Phephenylalanine 苯丙氨酸Proproline 脯氨酸Serserine 絲氨酸TFAtrifluoroacetic acid 三氟乙酸Thrthreonine 蘇氨酸Trptryptophan 色氨酸Tostosyl 對甲苯磺酰基Tyrtyrosinc 酪氨酸Vlavaline 纈氨酸
權利要求
1．本發明涉及一種有機化合物-多抗原肽，由多個血吸蟲抗原肽和作為核心基質的寡聚賴氨酸組成，其特征在于化學結構如下所示(A-Ag)2n-1(A-Ag′)2n-1(Lys)2n-1-B-X]]>在上式中A為H或RCO-形式的基團，在這里，R是H或C1-5烷基。Ag和Ag′可以分別是下列多肽中的兩種不同的多肽H-Ala-Ala-Gly-Val-Asp-Tyr-Glu-Asp-Glu-Arg-Ile-Ser-Phe--Gln-Asp-Trp-Pro-Lys-OH(P1)H-Pro-Gln-Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Ile-Thr-Lys-Glu-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-OH(P2)H-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Leu-Ala-Val-Gly-OH(P3)H-Pro-Gln-Ile-Asp-Lys-Tyr-Leu-Lys-Ser-Ser-Lys-Tyr-Ile-Ala-Trp-Pro-OH(P4)n是一個從1至10的整數，最好是2或3。B可以是天然的氨基酸殘基，也可以是D-構型的氨基酸殘基，最好是-Gly,-Ala-,-β-Ala-。X可以是NHR或OR，在這里，R是H或C1-5烷基。
2．如權利要求1中所述的化合物，其特征在于A是氫。
3．如權利要求1中所述的化合物，其特征在于n是2或3。
4．如權利要求1中所述的化合物，其特征在于B是-Gly-。
5．如權利要求1中所述的化合物，其特征在于X是OR，在這里R是H。
6．如權利要求1中所述的化合物，其特征在于Ag是多肽P1,Ag′可以是P2，或P3，或P4。
7．如權利要求1中所述的化合物，其特征在于Ag是多肽P2,Ag′可以是P3。
8．如權利要求1中所述的化合物，其特征在于見下式(P1)2(P3)2Lys2LysGly-OH(P1)2(P4)2Lys2LysGly-OH(P1)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH(P1)4(P4)4Lys4Lys2LysGly-OH(P1)4(p)4Lys4Lys2LysGly-OH(P2)4(P3)4Lys4Lys2LysGly-OH
9．權利要求1-8中要求保護的多抗原肽，用作治療血吸蟲病的藥物，或用其制成的抗血吸蟲病的疫苗類藥物。
全文摘要
本發明屬于有機化合物。具有下列結構的多抗原肽;(A－Ag)
文檔編號A61P33/00GK1235164SQ98101840
公開日1999年11月17日 申請日期1998年5月8日 優先權日1998年5月8日
發明者蔡孟深, 曹勝利, 秦致輝, 石佑恩, 王述恒 申請人:北京醫科大學