專利名稱:腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗及其工業化生產方法
技術領域：
本發明涉及一種腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗以及該純化疫苗的工業化生產方法。
背景技術：
腎綜合征出血熱(流行性出血熱)是一種病毒性急性傳染病，對人類的健康危害極大。在中國，具有代表性的腎綜合征出血熱病毒株有，例如，腎綜合征出血熱病毒流行株PS-6(I型)、L99(II型)、JR-C-1等等。
長期以來，人們一直致力于研制腎綜合征出血熱的疫苗，特別是針對I型和II型腎綜合征出血熱的雙價或多價疫苗。
中國專利申請，公開號CN1236646A，公開了一種流行性出血熱原代地鼠腎細胞多價純化疫苗(長春生物制品研究所)，其中用原代地鼠腎細胞來制備流行性出血熱的多價純化疫苗。盡管該發明提供了一種安全有效的流行性出血熱的多價純化疫苗，但是，由于需要使用地鼠腎細胞來培養病毒，使得生產工藝略顯復雜。
Vero細胞是非洲綠猴腎傳代細胞，20世紀80年代初世界衛生組織(WHO)批準用于生產人用疫苗，具有生物學性狀穩定、可無限繁殖傳代、質量容易控制、可結合微載體技術進行高密度培養等優點，已成功應用于人用狂犬病疫苗、乙型腦炎疫苗和脊髓灰質炎疫苗的生產。
中國專利申請，公開號CN1237456A，介紹了一種流行性出血熱傳代細胞多價純化疫苗(中國預防醫學科學院病毒學研究所)，其中用Vero細胞通過終末稀釋及乳小白鼠腦交替傳代的方法來制備病毒毒種，以生產流行性出血熱的多價純化疫苗，但用該方法選育的病毒毒種毒力僅為7.0LgCCID50/ml，而且病毒液的收獲次數很少(3次)，使得工業化生產疫苗的成本過高。
長期以來，人們一直期望得到一種腎綜合征出血熱病毒毒種，其病毒毒力更高，更適合于工業化生產， 同時也期望找到一種成本低、操作簡單的工業化生產腎綜合征出血熱純化疫苗的方法。

發明內容為了尋找病毒毒力高的腎綜合征出血熱病毒毒種和更適合于工業化生產腎綜合征出血熱雙價純化疫苗的方法，本申請人作了大量的研究。
本申請人采用在Vero細胞中經空斑克隆選育腎綜合征出血熱PS-6(I型)病毒和L99(II型)病毒，分別得到了高病毒滴度的PS-6(C-3)(I型)和L99(C-2)(II型)病毒毒種。
本申請人還發現了一種成本低、操作簡單的工業化生產腎綜合征出血熱雙價純化疫苗的方法。在本方法中，采用先培養Vero細胞，后接種本發明的病毒株，接種后，病毒在Vero細胞中培養，收獲病毒培養液，繼續培養病毒，以便多次收獲病毒培養液，病毒培養液或合并后的病毒培養液，經后續純化工藝，生產出腎綜合征出血熱雙價純化疫苗。
因此，本發明的目的之一是提供一種腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗，以有效控制腎綜合征出血熱的流行和降低發病率。
本發明的另一目的是提供一種工業化生產腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗的方法。
本發明的又一目的是提供高病毒滴度的腎綜合征出血熱病毒毒種，用于工業化生產。
本發明的其他目的體現于對本發明的詳細描述之中。
圖1為本發明工業化生產腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗的一種實施方案的流程示意圖。
本申請人經多年研究，選育分離得到了高毒力滴度的腎綜合征出血熱病毒毒種PS-6(C-3)(I型)和L99(C-2)(II型)病毒毒種。
本發明的PS-6(C-3)(I型)病毒毒種，是采用空斑克隆的方法，在Vero細胞中選育腎綜合征出血熱病毒PS-6(I型)得到的，PS-6(C-3)(I型)病毒毒種的毒力滴度≥8.0LgCCID50/ml。PS-6(C-3)(I型)病毒株已保藏在中國典型培養物保藏中心，地址為中國武漢的武漢大學，其保藏號為CCTCC-V200503，保藏日期為2005年4月24日。
本發明的L99(C-2)(II型)病毒毒種，是采用空斑克隆的方法，在Vero細胞中選育腎綜合征出血熱病毒L99(II型)得到的，L99(C-2)(II型)病毒毒種的毒力滴度≥8.5LgCCID50/ml。L99(C-2)(II型)已保藏在中國典型培養物保藏中心，地址為中國武漢的武漢大學，其保藏號為CCTCC-V200504，保藏日期為2005年4月24日。
PS-6(C-3)(I型)病毒毒種和L99(C-2)(II型)病毒毒種，經做一系列檢測，包括無菌試驗、病毒外源因子檢查、純毒試驗、抗原性、免疫源性等，各項檢查結果均符合規程要求標準，表明這兩毒種可以選定為生產疫苗用毒種。
PS-6(C-3)和L99(C-2)均為腎綜合征出血熱病毒，屬于布尼亞病毒科、漢坦病毒屬。
中國流行的腎綜合征出血熱病毒主要屬于黑線姬鼠型(國際上稱“漢灘型”或I型)和褐家鼠型(國際上稱“漢城型”或II型)兩個血清型，PS-6(C3)和L99(C2)分別屬于I型和II型。
PS-6(C3)和L99(C2)病毒株，在Vero細胞上傳代適應性強，毒力上升快，并且穩定。PS-6(C3)從第3代至第5代，L99(C2)從第2代至第5代毒力均穩定在8.5lgCCID50/ml。將PS-6(C3)和L99(C2)病毒在Vero細胞上傳代的第3、4、5代，用甲醛滅活，按常規方法免疫家兔，檢測家兔血清中和抗體，結果中和抗體滴度均≥1∶10，表明兩株病毒具有良好的免疫原性。
根據本發明，一種工業化生產腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗的方法，包括以下步驟一、分別制備腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和L99(C-2)，CCTCC-V200504的疫苗原液，包括1.在生長液的存在下，培養Vero細胞；2.將腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503或L99(C-2)，CCTCC-V200504，接種于Vero細胞；
3.在維持液的存在下，在Vero細胞中培養該病毒，收獲病毒液；4.用甲醛處理收獲的病毒液，以滅活病毒，得到疫苗原液；二、將分別得到的PS-6(C-3)疫苗原液和L99(C-2)疫苗原液合并；三、合并后的疫苗原液經純化處理后，加入佐劑，得到雙價純化疫苗。
該純化處理包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析。
本發明采用的Vero細胞可以從市場上得到，例如，從美國典型培養物保藏中心得到。可以用購得的Vero細胞，建立Vero細胞庫，以提供生產所需的Vero細胞。
根據本發明，PS-6(C-3)或L99(C-2)病毒在Vero細胞中培養，收獲病毒液后，可以通過添加維持液繼續培養病毒來再次收獲病毒液。這種過程可以重復進行，以達到多次收獲病毒液的目的。因此，本發明步驟3可以重復多次，而各次收獲的病毒液，可以合并后再用甲醛進行滅活處理。
采用本發明的腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和L99(C-2)，CCTCC-V200504，在本發明的工業化生產腎綜合征出血熱雙價純化疫苗的方法中，可以多次收獲高毒力滴度的病毒液，能很好地降低腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗的成本。
根據本發明的一種實施方案，在接種病毒時，選用長成單層的質量好的Vero細胞感染病毒，可以保證用于純化疫苗生產的細胞質量，并使細胞維持時間長，在Vero細胞中培養該病毒，可多次收獲毒力滴≥8.0LgCCID50/ml的病毒液，收獲病毒液的次數可至少為8次。
用于本發明的生長液可以是含8％-10％小牛血清的199或MEM。
本發明的維持液可以是含1％-2％小牛血清的199或MEM。
在本發明的方法中，維持液采用含小牛血清的培養基，這樣，在批量生產疫苗時，可節省大量人血白蛋白。由于人血白蛋白的價格昂貴，用本發明的生產方法可以極大地降低成本。
本發明的純化方法包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析等步驟。根據本發明，純化方法中的離心分離和超濾濃縮，可以采用常規的離心分離和超濾濃縮方法。
在本發明的純化方法中，采用了醋酸鋅沉淀步驟。本申請人發現，采用醋酸鋅沉淀步驟，不僅可以除去雜蛋白，而且能很好地去除病毒液中殘留的小牛血清，使得本發明用小牛血清替代人血白蛋白的方案可以順利實施，進一步降低了生產疫苗的成本。
本發明純化方法中的柱層析，可以采用常規的柱層析方法，優選Sepharose 4FF柱層析方法。
在本發明的純化方法中，佐劑優選采用氫氧化鋁。
用本發明的方法純化后的疫苗蛋白含量小于90μg/ml。
純化的疫苗經分裝和包裝，得到可直接用于臨床的疫苗制劑。
本發明生產腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗的方法，不僅增加了產量，又因節省人血白蛋白、減少細胞擴大培養次數及數量而取得明顯的節約，這無疑是非常符合工業化生產的。
根據本發明，一種腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗，包含有效量的腎綜合征出血熱滅活病毒I型和II型以及疫苗佐劑，該病毒來自PS-6(C-3)株，CCTCC-V200503，和L99(C-2)株，CCTCC-V200504。
在本發明的雙價純化疫苗中，PS-6(C-3)疫苗原液和L99(C-2)疫苗原液的比例，優選為1∶1。疫苗佐劑優選采用氫氧化鋁。
根據本發明，可以將腎綜合征出血熱病毒株，PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和腎綜合征出血熱病毒株，L99(C-2)，CCTCC-V200504，用于制備腎綜合征出血熱Vero細胞單/雙價純化疫苗。
具體實施方式以下參照附圖1，舉例闡述本發明生產腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗的方法。
Vero細胞接種于轉瓶中培養2～3天長成單層，生長液為含8％-10％小牛血清的199或MEM。加毒種PS-6(C-3)株(毒力滴度≥8.0LgCCID50/ml)感染細胞，維持液為含1％-2％小牛血清的199或MEM。培養5～6天收獲病毒液(即疫苗原液)，再加入1％-2％小牛血清的199或MEM維持液繼續培養，每3～4天收獲一次，可至少收獲8次，各次收獲的疫苗原液加甲醛滅活。
用上述同樣的方法，但用L99(C-2)株(毒力滴度≥8.5LgCCID50/ml)感染細胞，來制備病毒液(即疫苗原液)，其中該疫苗原液也是每3～4天收獲一次，可至少收獲8次，各次收獲的疫苗原液加甲醛滅活。
無菌試驗和毒力測定合格后，將滅活的PS-6(C-3)株的疫苗原液和L99(C-2)株的疫苗原液合并，8000～10000轉/分連續流離心分離，超濾濃縮，1％～5％醋酸鋅沉淀，柱層析(Sepharose 4FF)純化。除菌，同時進行半成品檢定。合格后，配制疫苗，包括稀釋，加人血白蛋白、硫柳汞和氫氧化鋁。疫苗分裝，成品檢定，合格后，包裝，出品。
檢定項目及質量指標疫苗原液(1)無菌試驗合格；(2)毒力測定≥6.5LgCCID50/ml；(3)滅活試驗Vero-E6細胞上盲傳三代，IFAT檢查抗原陰性；(4)支原體檢查陰性半成品檢定(1)無菌試驗合格；(2)抗原量≥1∶128(ELISA)；(3)殘余牛血清蛋白含量＜50ng/ml；(4)蛋白含量≤120μg/ml；(5)細胞DNA含量≤100pg/劑。
成品檢定(1)無菌試驗合格；(2)異常毒性試驗合格；(3)過敏性試驗合格；(4)熱原質試驗合格；(5)硫柳汞含量＜0.10mg/ml；(6) 氫氧化鋁含量≤0.7mg/ml；(7)pH 7.0～8.0；(8)細菌內毒素檢查＜100EU/劑。
(9)效力試驗每批疫苗免疫4只家兔，血清對I、II型病毒的中和抗體分別≥1∶20。
比較實施例1用本發明的病毒毒種與用CN1237456A的方法得到的病毒毒種進行生產的收獲次數的比較1.CN1237456A的方法中病毒毒種進行生產的收獲次數生長液含10％小牛血清的MEM；維持液含0.2％人血白蛋白的MEM。
Vero細胞按1傳3擴大培養同時，于生長液中加入出血熱病毒，37℃培養3天，將生長液倒掉。用生理鹽水噴洗后，換維持液，33℃繼續培養3天，第一次收獲，同時加入維持液繼續培養，每隔3天收獲一次。收獲第3次時，鏡下觀察細胞已經脫落50％～60％，剩余細胞形態不好，有許多圓縮細胞，不能再收獲合格的疫苗原液。收獲的3次疫苗原液進行病毒滴定，分別為7.0、8.0、7.67LgCCID50/ml。
2.本發明的病毒毒種進行生產的收獲次數生長液含10％小牛血清的199或MEM；維持液含1％～2％小牛血清的199或MEM。
Vero細胞于生長液中按1傳3擴大培養，37℃培養3天，將生長液倒掉。換維持液，同時加入出血熱病毒PS-6(C-3)株感染，33℃繼續培養5天，第一次收獲，同時加入維持液繼續培養，每隔3天收獲一次。收獲第8次時，鏡下觀察細胞，有30％～50％脫落，剩余細胞形態不好，不再加入維持液繼續培養。收獲的8次疫苗原液進行病毒滴定，毒力分別為8.0、8.50、8.33、8.50、8.50、8.33、8.50、7.50LgCCID50/ml。
另一次試驗中加入出血熱病毒L99(C-2)株感染，收獲10次疫苗原液，毒力分別為8.0、8.50、8.50、8.50、8.00、8.33、7.50、7.50、8.33、6.67LgCCID50/ml。
從比較實施例1中可清楚看出，與CN1237456A相比，本發明的出血熱病毒株有高很多的疫苗原液收獲次數和病毒毒力。
實施例1Vero細胞培養取長成單層的Vero細胞(來源于中國藥品生物制品檢定所)若干瓶(3L轉瓶)，棄去生長液，加入pH8.0、濃度0.1％的胰酶液，置室溫、轉瓶機上進行旋轉消化。肉眼觀察細胞面出現消化線時，棄去胰酶液，加適量含8～10％小牛血清的199培養液(生長液)，輕搖液體將細胞從瓶壁上沖下，使細胞懸于生長液中。搖勻后以1傳3的比例分裝到3立升轉瓶中，每瓶加生長液至300ml，置37℃旋轉培養，三日后，細胞長成單層。
PS-6(C-3)I型疫苗原液和L99(C-2)II型疫苗原液的分別制備選取長成單層的細胞培養瓶，棄去瓶內的生長液，將毒種(PS-6(C-3)I型或L99(C-2)II型)稀釋10000倍于1～2％小牛血清的199液中(維持液)，搖勻后分裝于3L培養瓶中，每瓶300ml置33℃～35℃旋轉培養5～6天收獲病毒液(即疫苗原液)，再加入相同的維持液繼續培養，每3～4天收獲一次，共收獲8次。每次收獲的病毒液取樣做病毒滴定和無菌試驗。各次收獲的疫苗原液按液量加入福爾馬林至1/4000，硫柳汞至1/20000。充分振搖后置37℃24小時，再轉置4℃14天進行病毒滅活。
雙價疫苗的純化及檢定取樣做安全試驗合格后，將PS-6(C-3)I型疫苗原液和L99(C-2)II型疫苗原液合并成雙價疫苗(1∶1比例)。合并的疫苗經8000r/min連續流離心去掉細胞碎片。超濾濃縮，按1/20mol/L濃度加入醋酸鋅，2-8℃鹽析30分鐘后，3000r/min離心30分鐘。將沉淀用飽和EDTA溶解，再用3mol/LTris液調pH7.6-7.8，3000r/min離心30分鐘。上清液再經超濾濃縮透析后(透析液PH7.2 0.2mol/LPB)，上Sepharose 4FF柱進行層析純化。以A280nm監測，PH7.2 0.2mol/LPB為洗脫液，收集第一峰。經0.2μm孔徑濾器除菌過濾后留樣，加硫柳汞防腐(1/20000)，放4℃保存。純化的樣品進行無菌試驗，抗原量測定，殘存牛血清蛋白含量測定，DNA含量測定，蛋白含量測定等檢定。檢定合格后，將純化的疫苗進行適當稀釋，加入AL(OH)3至0.5mg/ml，分裝1.0ml/安瓶。然后進行成品檢定，包括無菌試驗，鑒別試驗，效力試驗，異常毒性試驗，理化檢定等。成品檢定合格后，即為腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗。
權利要求
1.一種腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗，包含有效量的腎綜合征出血熱滅活病毒I型和II型以及疫苗佐劑，該I型和II型病毒，分別來自PS-6(C-3)株，CCTCC-V200503，和L99(C-2)株，CCTCC-V200504。
2.權利要求
1的雙價純化疫苗，其中該PS-6(C-3)I型病毒與L99(C-2)II型病毒的比例為1∶1。
3.一種分離的腎綜合征出血熱病毒株，PS-6(C-3)，CCTCC-V200503。
4.一種分離的腎綜合征出血熱病毒株，L99(C-2)，CCTCC-V200504。
5.腎綜合征出血熱病毒株，PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和腎綜合征出血熱病毒株，L99(C-2)，CCTCC-V200504在制備腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗中的應用。
6.一種工業化生產腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗的方法，包括以下步驟1>、分別制備腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和L99(C-2)，CCTCC-V200504的疫苗原液，包括(1)、在生長液的存在下，培養Vero細胞；(2)、將腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503或L99(C-2)，CCTCC-V200504，接種到Vero細胞中；(3)、在維持液的存在下，培養接種到Vero細胞中的該病毒，收獲病毒液；(4)、用甲醛處理收獲的病毒液，以滅活病毒，得到疫苗原液；2>、合并PS-6(C-3)和L99(C-2)的疫苗原液，3>、純化處理合并后的疫苗原液，加入佐劑，得到純化雙價疫苗。
7.權利要求
6的方法，其中，重復步驟(3)，以多次收獲病毒液。
8.權利要求
6或7的方法，其中，該純化處理包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析，其中，該柱層析優選用Sepharose 4FF進行。
9.權利要求
6-8之一的方法，其中，該生長液是含8％-10％小牛血清的199或MEM。
10.權利要求
6-9之一的方法，其中，該維持液是含1％-2％小牛血清的199或MEM。
專利摘要
本發明涉及腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗及其工業化制備方法。本發明的腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗，包含有效量的腎綜合征出血熱滅活病毒I型和II型以及疫苗佐劑，該I型和II型病毒，分別來自PS－6(C－3)株，CCTCC－V200503，和L99(C－2)株，CCTCC－V200504。本發明的制備方法包括1.分別制備腎綜合征出血熱病毒PS－6(C－3)，CCTCC－V200503和L99(C－2)，CCTCC－V200504的疫苗原液，用甲醛滅活病毒；2.將已滅活的PS－6(C－3)，CCTCC－V200503和L99(C－2)，CCTCC－V200504的疫苗原液合并后純化，包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析；3.向純化后的疫苗原液中加入佐劑，得到純化雙價疫苗。本發明制備的腎綜合征出血熱Vero細胞雙價純化疫苗，適合預防所有I型為主和II型為主的腎綜合征出血熱。
文檔編號A61P31/14GK1990041SQ200510137779
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日
發明者韓亮, 趙麗紅, 郝富勇, 岳立廣, 宋宗明, 惠連, 王曉宏, 李彤, 王偉, 趙建, 張龍梅, 馬軍, 張偉紅 申請人:長春生物制品研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan