專利名稱：編程性細胞死亡誘導劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有藥學作用的含生理活性物質作為有效組分的編程性細胞死亡誘導劑和抗癌劑，有效組分源自動物、微生物或植物以有利于增進健康；涉及含有上述生理活性物質的功能性食物或飲料；并涉及生產它們的方法。
現有技術近年來，編程性細胞死亡的模式一直是有關細胞組織死亡的注意點。
與病理性細胞死亡的壞死不同，認為編程性細胞死亡是一種從開始就被整合進細胞本身基因的死亡。這樣，認為決定編程性細胞死亡程序的基因在一些外源或內源性原因作為觸發器發揮作用的地方被激活，在該基因的基礎上生物合成一種程序性死亡基因蛋白質，并且細胞本身被所產生的程序性死亡蛋白質降解，由此引起細胞的死亡。
如果能在所需組織或細胞中表達這樣的編程性細胞死亡，將有可能從活的機體中以其天然形式排除不必要的或病原性細胞，這將具有顯著的意義。
近年來，編程性細胞死亡與鞘脂例如神經酰胺之間的關系引起關注并且有人報道通過軟脂酸和硬脂酸發生神經酰胺的從頭合成，籍此引起編程性細胞死亡[生物化學雜志(Journal of Biological Chemistry),272卷，3324-3329頁(1997)]。
本發明所要解決的問題盡管期望神經酰胺和游離脂肪酸被發展為編程性細胞死亡誘導劑，但是源自活的機體的其它脂溶性物質的編程性細胞死亡誘導作用卻完全不明確。
本發明的目的是開發一種有編程性細胞死亡誘導作用的高度安全的源自植物、微生物或動物的提取組分，以及提供一種含有該組分的編程性細胞死亡誘導劑和抗癌劑，一種含有該組分作為組成組分的功能性食物或飲料，和生產它們的方法。
解決問題的方法本發明的發明者為達到以下的目的和結論進行了深入的調查，結果他們發現得自植物、微生物或動物的甘油脂和甘油糖脂顯示了強編程性細胞死亡誘導作用和抗癌作用，并因此完成本發明。
這樣，本發明的第一個方面涉及一種編程性細胞死亡誘導劑，并且其特征在于含有甘油脂和/或甘油糖脂作為有效組分。
本發明的第二個方面涉及一種抗癌劑，并且其特征在于含有甘油脂和/或甘油糖脂作為有效組分。
本發明的第三個方面涉及生產本發明第一個和第二個方面的制劑的方法，并且其特征在于在生產本發明第一個和第二個方面的制劑的方法中，包括用一種有機溶劑提取源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
本發明的第四個方面涉及用于誘導編程性細胞死亡的食物或飲料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀釋有甘油脂和/或甘油糖脂。
本發明的第五個方面涉及抗癌食物或飲料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀釋有甘油脂和/或甘油糖脂。
本發明的第六個方面涉及生產本發明第四個或第五個方面的食物或飲料的方法，其特征在于在生產本發明第四個或第五個方面的食物或飲料的方法中，包括用一種有機溶劑提取源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
附圖的簡短說明

圖1顯示了透析后的DEAE-Sepharose Fast Flow柱的內部溶液洗脫模式。
圖2顯示了級分B和純物質的編程性細胞死亡誘導作用。
圖3顯示了純物質NMR圖譜。
圖4顯示了樣品A完全離子色譜圖。
圖5顯示了樣品B完全離子色譜圖。
圖6顯示了Sepharose LH-60柱色譜圖。
圖7顯示了級分No.20脂質組分的完全離子色譜圖。
圖8顯示了級分No.21脂質組分的完全離子色譜圖。
圖9顯示了級分No.23脂質組分的完全離子色譜圖。
圖10顯示了級分No.20糖組分的完全離子色譜圖。
圖11顯示了級分No.21糖組分的完全離子色譜圖。
圖12顯示了級分No.23糖組分的完全離子色譜圖。
圖13顯示了用氯仿洗脫的級分之脂質組分的完全離子色譜圖。
圖14顯示了用比例為80∶20的氯仿和丙酮洗脫的級分之脂質組分的完全離子色譜圖。
圖15顯示了用氯仿洗脫的級分之糖組分的完全離子色譜圖。
圖16顯示了用比例為80∶20的氯仿和丙酮洗脫的級分之糖組分的完全離子色譜圖。
圖17顯示了Rf值為約0.25的斑點之脂質組分的完全離子色譜圖。
圖18顯示了Rf值為約0.25的斑點之糖組分的完全離子色譜圖。
圖19顯示了Rf值為約0.33的斑點之脂質組分的完全離子色譜圖。
圖20顯示了Rf值為約0.33的斑點之糖組分的完全離子色譜圖。
圖21顯示了Lyophyllum ulmarium乙醇提取物的脂質組分的完全離子色譜圖。
圖22是顯示了Lyophyllum ulmarium乙醇提取物之糖組分的完全離子色譜圖。
圖23是顯示了粉末狀綠茶(matcha)乙醇提取物之脂質組分的完全離子色譜圖。
圖24是顯示了粉末狀綠茶乙醇提取物之糖組分的完全離子色譜圖。
圖25是顯示了米糠75％乙醇提取物之脂質組分的完全離子色譜圖。
圖26是顯示了米糠75％乙醇提取物之糖組分的完全離子色譜圖。
進行本發明的模式本發明將如下文特別說明。
對于本發明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂無特殊限制，并且它們/它可從植物、微生物或動物中生產或化學合成。
可在本發明中使用的植物、微生物或動物無特殊限制，只要它們其中含有甘油脂和/或甘油糖脂。植物的實例有蔬菜例如菠菜、胡蘿卜和洋蔥；雙子葉植物例如茶；單子葉植物例如大麥和水稻；調味品例如胡椒、肉桂蔻、大蒜、月桂葉、芹菜、芥末、姜、紅胡椒、百里香、藏紅花、桂皮、香草、allspice、日本芥末、西洋菜、日本胡椒、牛排植物、草藥、八角茴香、羅勒、日本韭菜、蛇麻草和日本辣根；從例如谷物的那些植物的殘留物中加工出來的產物；藻類例如棕色海藻(褐藻類)、紅色海藻(紅藻類)、綠色海藻(綠藻類)和單細胞綠色海藻；微生物例如蘑菇、酵母、絲狀真菌(例如曲霉屬)和細菌(例如納豆芽孢桿菌和乳酸菌)；以及動物例如脊椎動物和無脊椎動物。
本發明說明書中使用的術語“茶”可以是通常稱為茶的任何物質并且它的實例有未發酵的茶例如綠茶、煎茶(中級綠茶)、粗茶(低級茶)、焙粗茶(烘焙茶)、粉末狀綠茶；半發酵茶例如paipao茶、烏龍茶和泡沖茶(paochong tea)；以及后發酵茶例如普洱茶。除它們以外，術語“茶”包括冬青茶、kuko(中國婚姻藤)茶、adley茶和大麥茶。
對于本發明使用的蘑菇無特殊限制盡管優先選擇通常食用的蘑菇并且實例有擔子菌(Basidiomysetes)例如Lyophyllum ulmarium，荷葉離褶傘(Lyophyllum decastes)，香茹(Lentinus edodes),Tricholowa matsutake,Lyophyllum shimeji,Flammulina velutipes，光帽磷傘(Pholiota nameko),Gyrophora esculenta，木耳(Auricularia auricula)，純黃竹蓀(Dictyophoraindusiata)，亞磚紅沿絲傘(Naematoloma sublateritium),Boletopsisleucomelas,Sarcodon aspratus，紅根須腹菌(Rhizopogon rubescens),Amanita hemibapha，多汁乳茹(Lactarius volemus)，假蜜環菌(Armillariamellea)，紅汁乳茹(Lactarius hatsudake)，糙皮側耳(Pleurotus ostreatus),Grifola frondosa，潔麗香茹(Lentinus lepideus)和普通蘑菇(Agaricusbisporus或諸如此類)；以及子囊菌(Ascomycetes)例如tochukaso(無性黃蜂或植物蠕蟲)。
對于本說明書中使用的藻類無特殊限制，其實例有棕色海藻例如囊藻(Colpomenia sinuosa)，海蘊(Nemacystus decipiens以及索藻科(Chordariaceae)中的其它種類)，海帶(Laminaria japonica),Kjellmaniellacrassifolia，裙帶菜(Undaria pinnatifida),Eisenia pinnatifida和Hizikiafusiforme；紅色海藻例如石花菜(Gelidium)和三叉仙菜(Ceramiumkondoi)；綠色海藻例如孔石莼(Ulva pertusa),Prasiola japonica和刺松藻(Codium fragile)；以及單細胞綠色海藻例如Chlorella。
對于本發明中使用的谷物殘留物無特殊限制，并且其實例有米糠、麥糠、大麥根和豆腐的渣滓(okara)。
在本發明中優選從那些茶、蘑菇、藻類或谷物殘留物中制備的甘油脂和或甘油糖脂，并用作編程性細胞死亡誘導劑、抗癌劑或功能性食物或飲料有效組分。
對于本發明中使用的有編程性細胞死亡誘導作用的甘油脂和甘油糖脂無特殊限制，并且可應用的甘油脂實例有單、雙和三脂酰甘油，而可應用的甘油糖脂的實例有在疏水性基序帶有甘油的糖脂，例如以單脂酰基團、雙脂酰基團、烷脂酰基團、雙烷脂酰基團、鏈烯脂酰基團或二聯植烷酯等的基團作為疏水基團的甘油糖脂。這樣，單半乳糖二脂酰基甘油、單葡萄糖二脂酰基甘油、雙半乳糖二脂酰基甘油、雙葡萄糖二脂酰基甘油、雙甘露糖二脂酰基甘油、三葡萄糖二脂酰基甘油、四葡萄糖二脂酰基甘油、多聚葡萄糖二脂酰基甘油或諸如此類的物質可用作中性甘油糖脂，而cenolipid、磺基異鼠李糖二脂酰基甘油酯、gluculonosyl二脂酰基甘油、葡糖基二磷脂酰甘油、磷脂酰葡糖基二脂酰基甘油、甘油磷酰二葡糖基三脂酰基甘油、脂磷壁酸或諸如此類物質可用作酸性甘油糖脂。
組成本發明中使用的甘油脂和甘油糖脂的脂肪酸的實例有飽和和/或不飽和脂肪酸例如十四烷酸(肉豆蔻酸，C14:0)、十六烷酸(棕櫚酸，C16:0)、十四碳烯酸(肉豆蔻腦酸，C14:1)、十六碳烯酸(棕櫚油酸，C16:1)、十八碳烯酸(油酸，C18:1)、順-9，順-12-十八碳二烯酸(亞油酸，C18:2)和9,12,15-十八碳三烯酸(亞麻酸，C18:3)，而組成性的糖的實例有巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露醇和肌醇。另外，甘油糖脂包括甘油脂與糖和/或蛋白質等等的復合物。
通過其中包括一個用有機溶劑例如含水的親水性有機溶劑(例如，乙醇水溶液)提取步驟的方法，可以很容易地生產出本發明中使用的有編程性細胞死亡誘導作用的源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂。但對于該甘油脂和/或甘油糖脂的生產方法并無特殊限制。這樣，不但可以使用僅僅用水的提取法，還可以使用可用于純化該甘油脂和/或甘油糖脂的已知的方法。對含有源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的物質進行化學、物理或酶處理，然后純化目標甘油脂和/或甘油糖脂也是可能的。對于純化，甘油脂和/或甘油糖脂的物理化學特性或生理學活性(編程性細胞死亡誘導作用和抗癌作用等等)可用作純化的指標。
在本發明中，源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂經有機溶劑例如己烷、氯仿、乙酸乙酯、親水性有機溶劑(例如，丙酮、丙醇、乙醇和甲醇)提取，產物與水的混合物或混合溶劑和含有甘油脂和/或甘油糖脂的可食性物質可通過包括一個，例如，用乙醇水溶液提取步驟的生產方法很容易地生產。當被用作食物或飲料時，提取優選在以下條件下進行，其中一種有機溶劑，特別是親水性有機溶劑例如10-95％或優選20-80％乙醇水溶液通常在10～70℃或優選在20～60℃使用幾分鐘到幾天，或優選幾十分鐘到幾十小時，這樣可有效地提取是編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂。在用有機溶劑或尤其用親水性有機溶劑提取前用酸或堿處理源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂，可能更有效地提取是編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂。
關于本發明中使用的收集純凈甘油脂和/或甘油糖脂的方法，可使用有些已知的方法例如Bligh-Dyer法和Folch分配法(參看“新生化實驗教科書”(New textbook on Experiments of Biochemistry)，卷4，脂質Ⅲ,104-109頁，1990，日本生物化學協會(Japan Biochemical Society)編輯，Tokyo Kagaku Dojin出版)以及與目的相適合的它們中的任何方法以提取本發明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂。
在本發明使用的甘油脂和/或甘油糖脂的純化中，使用疏水性載體、反相載體、正相(normal phase)載體等等對上面提到的提取物進行層析，由此能進行更有效地分離。
對于疏水性載體無特殊限制，任意一種已知載體均有可能被用到。這樣的載體的實例有其中引入丁基、辛基或苯基的Sephacryl型、Sepharose型、Toyopearl型樹脂等等以及Amberlite吸附樹脂XAD-1、-2、-4、-200、-7或-8。對于反相載體無特殊限制，可使用已知載體的任意一種，并且這樣的載體的一個實例為其中有共價連接烷基鏈的硅膠。對于正相載體無特殊限制，可使用已知載體的任意一種并且該載體的一個實例為硅膠。在進行純化中，可使用甘油脂和/或甘油糖脂的物理和化學特性或生理學活性例如編程性細胞死亡誘導作用和抗癌作用作為指標。
本發明中使用的源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂，可以例如，通過傳統離子交換處理、疏水性層析處理、凝膠過濾處理等的方法從可食性植物、可食性微生物、可食性動物等等的乙醇水溶液提取物中純化出來。
通常，在很多情形中植物、微生物或動物中的甘油脂和/或甘油糖脂以與膜附近的糖或蛋白質結合的高分子物質的形式存在，并且例如一經用熱水提取，能夠得到其中甘油脂和/或甘油糖脂與糖和/或蛋白質結合的含甘油脂和/或甘油糖脂的物質。另外，術語糖意為一種存在于植物、微生物或動物中的糖，它包括單糖、寡聚糖、多聚糖和糖偶聯物。
在本發明中，可使用所制備的這樣的含甘油脂和/或甘油糖脂的高分子物質，因為盡管這是根據使用目的，經酶、化學和或物理處理糖和/或蛋白質以純化和收集甘油脂和/或甘油糖脂，由此得到更加純化狀態的甘油脂和/或甘油糖脂還是可能的。
通過上述方法得到的并在本發明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂是來自天然的高度安全的物質，并且作為食物和/或飲料特別有用。
當所得到的甘油脂和/或甘油糖脂與識別靶細胞的配體例如單克隆抗體結合時，可在任何靶細胞中特異地引起編程性細胞死亡。另外，當靶細胞是癌細胞時，可得到作為在目的癌細胞中引起編程性細胞死亡結果的抗癌作用。再者，當本發明的化合物與載體例如白蛋白質結合時，能提供有更高吸收特性的物質。
本發明的編程性細胞死亡誘導劑可通過將例如源自植物、微生物或動物的是有效組分的那些甘油脂和/或甘油糖脂與已知的藥學載體結合而被制成藥學制劑。一般地，本發明的編程性細胞死亡誘導化合物例如甘油脂和/或甘油糖脂與藥學上可接受的液體或固體載體形成化合物，如果需要，之后加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖液、穩定劑、賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑等等，由此能制備固體制劑例如片劑、粒劑、稀釋粉劑、粉末制劑和膠囊以及液體制劑例如標準液體制劑、懸浮液和乳濁液。或者，化合物可被制成干燥制劑，在實際使用前加入合適的載體將其轉變為液體。
本發明的編程性細胞死亡誘導劑可通過任何口服試劑和非腸道試劑例如注射和滴注試劑的方式來給予。
可以根據上述劑量形式和制劑形式選擇藥學載體。在口服試劑的情況下，可以使用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等等。在制備口服試劑中，結合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、促流動劑、矯味劑、著色劑、香料等等可以與其形成化合物。
另一方面在非腸道試劑的情況下，將源自例如植物、微生物或動物是本發明中有效組分有編程性細胞死亡誘導作用的甘油脂和/或甘油糖脂溶于或懸浮在稀釋劑中，例如用于注射的蒸餾水、生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液、用于注射的植物油、蓖麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇和如果需要，再向其中加入殺菌劑、穩定劑、等滲劑、麻醉劑等等。
可以根據制劑形式通過合適給藥途徑給予本發明的編程性細胞死亡誘導劑。對于給藥方法也無特殊限制，并且可以應用任何內部和外部給藥和注射。注射制劑例如可以通過靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射等等給予。外部制劑包括栓劑以及諸如此類的制劑。
雖然根據制劑形式、給藥方法和給藥目的以及給予誘導劑的病人之年齡、體重和癥狀，可以合適地確定本發明編程性細胞死亡誘導劑的劑量，但此劑量并未確定，盡管通常情況下制劑中含有的有效組分的量對于成人來說為每天0.1-200mg/kg。不言而喻，根據不同條件劑量也不同，并且因此在一些情況下，少于上面范圍的劑量可能就足夠了，而在另一些情況下，可能需要多于上面范圍的劑量。本發明的藥學試劑不僅通過口服給予，還可通過將其加入到任何食物或飲料中每天攝食。
本發明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂有抑制癌細胞生長的活性。本發明中使用的用于抑制癌細胞生長的甘油脂和/或甘油糖脂的作用機制絲毫也沒有限制本發明，并且例如，本發明也包括對癌細胞的編程性細胞死亡誘導劑。
有抗癌作用的甘油脂和/或甘油糖脂，例如，源自例如植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂被用作有效組分，并且通過與已知藥學載體形成化合物被制成藥學制劑，由此能夠制備抗癌劑。依據上述方法可以進行抗癌劑的生產。一般來說，甘油脂和/或甘油糖脂與藥學上可接受的液體或固體載體形成化合物之后，如果需要，在其中加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖液、穩定劑、賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑等等，由此可制備固體制劑例如片劑、粒劑、稀釋粉劑、粉末制劑和膠囊，以及液體制劑例如標準液體制劑、懸浮液和乳濁液。或者，也可將化合物制成干燥制劑，通過在實際使用前加入合適載體可被轉化成液體。
可以通過任何口服和非腸道試劑例如注射和滴注試劑給予抗癌劑。
可以根據上面提到的劑量形式和制劑形式選擇藥學載體，并且此藥學載體可以依據編程性細胞死亡誘導劑在上面提到的情況下使用。
依據制劑形式通過合適的給藥途徑可以給予本發明的抗癌劑。對給藥方法也無特殊限制，可以應用任何內部和外部給藥方法以及注射。注射制劑可以，例如，通過靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射等等給予。外部制劑包括栓劑以及諸如此類的制劑。
雖然根據制劑形式、給藥方法和給藥目的以及給予誘導劑的病人之年齡、體重和癥狀，可以合適地確定本發明抗癌劑的劑量，但此劑量并未確定，盡管通常情況下制劑中含有的有效組分的量對于成人來說為每天0.1-200mg/kg。不言而喻，根據不同條件劑量也不同，并且因此在一些情況下，少于上面范圍的劑量可能就足夠了，而在另一些情況下，可能需要多于上面范圍的劑量。本發明的藥學試劑不僅通過口服給予還可通過將其加入到任何食物或飲料中每天攝食。
本發明的藥學試劑能用作癌癥疾病等的治療劑。另外，在研究生物防御的機制、免疫功能或與疾病例如癌癥的關系以及在開發編程性細胞死亡誘導的抑制劑中，由本發明編程性細胞死亡誘導劑提供的編程性細胞死亡誘導方法是有用的。特別是，從作為食物有很長歷史的植物、微生物或動物中制備的是編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂在口服給藥時高度安全。另外，其中含有、向其中加入和/或在其中稀釋有例如源自植物、微生物或動物的本發明的甘油脂和/或甘油糖脂的那種或那些食物或飲料，具有天然的高度安全性，并且因為其編程性細胞死亡誘導作用和因編程性細胞死亡誘導作用產生的抗癌作用，其對于改善癥狀和阻止胃腸道癌癥等等是相當有用的。
對于本發明的食物或飲料無特殊限制，其實例有加工過的農業/林業產品、加工過的家畜產品、加工過的漁業產品等等，包括加工過的谷物產品例如加工過的麥產品、加工過的淀粉產品、加工過的預混合產品、面條、通心面、面包、豆腐、日本蕎麥面條(soba)、日本麥麩面包(fu)、中國豆膠凍棒(bifun)、日本豆膠凍棒(harusame)、和壓縮米糕；加工過的脂肪/油產品例如成形脂肪/油、用于深炸食物的油、色拉油、蛋黃醬和調味品；加工過的大豆產品例如豆腐、發酵的豆腐(miso)和發酵的大豆(natto)；加工過的肉產品例如火腿、腌肉、壓縮火腿(press ham)和香腸；漁業產品例如冷凍底棲魚類魚肉(surimi)、熟魚醬(kamaboko)、燒成竹樣形狀的熟魚醬(chikuwa)、輕魚餅(hampen)、炸魚丸(satsumaage)、有一些組分的熟魚醬(tsumire)、魚產品(suji)、魚肉火腿、香腸、炸狐鰹(katsuobushi)、加工過的魚卵產品、罐頭魚產品和在大豆沙司中煮濃的貯藏魚產品(tsukudani)；奶產品例如牛奶、奶油、酸奶、黃油、奶酪、濃縮牛奶、干奶粉和冰淇淋；加工過的蔬菜/水果產品例如糊狀物、果醬、泡菜、水果飲料、蔬菜飲料和混合飲料；甜食例如巧克力、餅干、小面包、蛋糕、米球蛋糕和米餅；酒精飲料例如日本米酒(sake)、中國葡萄酒、葡萄酒、威士忌、日本蒸餾酒(shochu)、伏特加酒、白蘭地、杜松子酒、ram、啤酒、軟酒精飲料、果酒和烈性酒；餐桌奢侈品例如綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、軟飲料和乳酸飲料；調味品例如大豆醬、Worcester醬、醋和mirin；香料例如大蒜的提取物、胡椒、紅胡椒、肉豆蔻、姜、八角茴香、草藥和羅勒；罐裝、瓶裝或袋裝食物例如配有調味牛肉的熟米、裝在小壺樣容器內的熟米(kamameshi)、和紅豆一起煮的米(sekihan)、咖喱和米飯以及其它已加工的食物；半炸或濃縮食物例如肝醬和其它涂抹食品的醬、soba和udon的湯(兩者都是日本面條)和濃縮湯；脫水食物例如速食面、速食咖喱、速溶咖啡、粉狀果汁、粉狀湯、速食miso湯、干餾食物、干餾飲料和干餾湯；冷凍食物例如sukiyaki、chawan-mushi(在鍋中煮的雜燴)、烤鰻魚(unagikabayaki)、漢堡牛排、燒賣(中國蒸餃)、餃子(塞滿碎豬肉等的煎餃)、各種烈酒和水果雞尾酒；固體食物；液體食品例如湯以及香料。
對于生產本發明的食物或飲料的方法無特殊限制，并且其實例有烹調、加工和通常使用的生產食物或飲料的方法，可以使用任何方法以生產含有是編程性細胞死亡誘導化合物的源自例如植物、微生物和動物的那些甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料。
關于烹調和加工，在上述的烹調或加工后的產品會含有具備編程性細胞死亡誘導特性的甘油脂和/或甘油糖脂。
這樣，可在烹調或加工前、加工期間或加工后加入有編程性細胞死亡誘導特性的甘油脂和/或甘油糖脂。或者，因此可將烹調或加工的產品或原材料加入含有甘油脂和/或甘油糖脂的物質中使該甘油脂和/或甘油糖脂被稀釋。
在食物或飲料的生產中，可在任何步驟加入有編程性細胞死亡誘導作用的甘油脂和/或甘油糖脂。關于加入方法，可加入甘油脂和/或甘油糖脂或因此可將食物、飲料或材料加入該甘油脂和/或甘油糖脂中使甘油脂和/或甘油糖脂被稀釋。可以進行或者一次或者幾次加入。相應地，能很容易地生產有編程性細胞死亡誘導作用的食物或飲料。當應用任意一個那些步驟時，含有具備編程性細胞死亡誘導特性的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料，或者往其中加入或在其中稀釋有本發明的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料被定義為本發明的食物或飲料。
對于在食物中有編程性細胞死亡誘導作用的本發明的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或動物的是本發明的編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂)的量無特殊限制，但此量可依器官感覺和生理學活性合適地選擇。例如，上述甘油脂和/或甘油糖脂的量不少于10-9份每100份食物，并且就作為食物產生的器官感覺和生理學作用而言，優選從10-8份到5份，更優選從10-7份到2份。
對于在飲料中本發明的有編程性細胞死亡誘導作用的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或動物的是本發明的編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂)的量無特殊限制，但此量可依器官感覺和生理學活性合適地選擇。例如，上述甘油脂和/或甘油糖脂的量不少于10-9份每100份飲料，并且就作為食物產生的器官感覺和生理學作用而言，優選從10-8份到5份，更優選從10-7份到2份。另外，在本說明書中，術語“份”代表按照重量的份。
對于其中含有、往其中加入和/或在其中稀釋有具備編程性細胞死亡誘導特性的本發明的甘油脂和/或甘油糖脂之本發明的食物或飲料的形狀無特殊限制，但可包括能被口服，例如片劑、粒劑、膠囊、凝膠和溶膠的任何形狀。
本發明的食物或飲料含有大量的有生理學活性的、是本發明的編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂，并且因為該甘油脂和/或甘油糖脂編程性細胞死亡誘導作用，其是有阻止癌發生作用和抑癌效應的健康食物或飲料，并且尤其是對維持胃和腸道良好健康有用的食物或飲料。
其中含有、往其中加入和/或在其中稀釋有本發明的甘油脂和/或甘油糖脂的例如源自植物、微生物或動物的那個/那些抗癌食物或抗癌飲料，可根據上述生產編程性細胞死亡誘導食物或編程性細胞死亡誘導飲料的方法使用抗癌活性作為指標進行生產。
是本發明編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂源自植物、微生物或動物，特別是源自可食性植物、微生物或動物到食物或飲料的此甘油脂和/或甘油糖脂的使用是相當安全的，此種情況該編程性細胞死亡誘導化合物在實現生理學功能的濃度下對動物無毒。
可食性植物、微生物或動物中本發明的甘油脂和/或甘油糖脂作為食物有很長的歷史，并且由此根據本發明制備的含有甘油脂和/或甘油糖脂的物質在口服給予時有相當高的安全性。相應地，很自然地，其中含有、往其中加入和/或在其中稀釋有本發明的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料具有高度安全性，并且由于其編程性細胞死亡誘導作用，對于腸胃道癌癥等的預防和治療是非常有用的。
如上所述，現在已澄清根據本發明的甘油脂和/或甘油糖脂是在活體內可獲得的脂類，具有編程性細胞死亡誘導活性和抗癌活性。
在本發明中應用的是編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂在植物、微生物或動物的膜部分大量存在，并且特別地，它們/它能以低成本和簡便的方法從可食的植物或微生物中生產。另外，作為編程性細胞死亡誘導目的之化合物的甘油脂和/或甘油糖脂，可以根據其疏水程度選擇一種合適的溶劑而選擇性地純化。
本發明中應用的是編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或動物的)能夠容易地將其編程性細胞死亡誘導作用和抗癌作用傳遞給食物或飲料，并且具有編程性細胞死亡誘導特性和抗癌特性的本發明的甘油脂和/或甘油糖脂作為食物或飲料的填加劑也是相當有用的。
實施例在此將更為特別地以下面的實施例對本發明加以說明，然而本發明并不受這些實施例的限制。另外，這些實施例中的符號％意為重量百分比。實施例1源于海草(Seaweed)的具有編程性細胞死亡誘導作用的組合物的制備。
(1)將Kjellmaniella crassifolia充分干燥并將20kg干燥產物在自由式磨碎機(free grinder)(由Nara Kikai Seisakusho制造)中磨碎；二水氯化鈣(由Nippon Soda生產)(7.3kg)溶于900ml自來水，然后與20kg磨碎的Kjellmaniella crassifolia混合，向該液體中吹入蒸汽40分鐘使溫度從12℃升高到90℃，并保持在90-95℃攪拌1小時，降溫得到1,100升冷卻產物。
之后對冷卻的溶液使用固-液分離器(型號CNA；由WestfalierSeparator生產)進行固-液分離，在固-液分離后約有900升上清液制備出來。
固-液分離后的上清液(360升)用FE10-FC-FUS0382(分離分子量30,000)(由Daicel生產)濃縮至20升。之后將20升自來水加于其中，再使混合物濃縮至20升，重復此步驟5次以除鹽，籍此從Kiellmaniellacrassifolia中得到25升提取物。
冷凍干燥一升上述溶液得到13g干燥產物。
(2)在實施例1-(1)中提到的提取物(1.4升)用含0.2M CaCl2的20mM醋酸緩沖液(pH6)透析，獲得經過透析的內部液體。DEAE-Sepharose Fast Flow柱(14cm直徑×45.5cm高)用同樣的緩沖液平衡，將透析后的內部液體上柱，用同一緩沖液沖洗并用上述的包含2M NaCl的緩沖液以濃度梯度的方式洗脫。總糖量和糖醛酸量用苯酚硫酸方法和咔唑-硫酸方法檢測，并依洗脫順序得出級分A、B和C。這些級分用蒸餾水透析并冷凍干燥，得到760mg級分B。
級分B顯示出編程性細胞死亡誘導活性。
圖1顯示了提取物從DEAE-Sepharose Fast Flow柱中洗脫的模式。這樣，圖1是顯示了源自海藻的提取物從DEAE-Sepharose Fast Flow柱(直徑14cm×高45.5cm)中洗脫的模式圖，其中縱坐標顯示了咔唑硫酸法在530nm的和苯酚硫酸法在480 nm的吸收以及電導率(mS/cm)，而橫坐標顯示了級分序號。在圖中，空圈是苯酚硫酸法在480nm的吸收，黑點是咔唑硫酸法在530nm的吸收，實線是電導率。另外，對于一個級分來說液體的量是1,000ml。
(3)將通過上面的方法得到的級分B(8.6g)上樣到用1M NaCl平衡(其中NaCl的終濃度調節到1M)的苯基-Sepharose 6 Fast Flow柱。用1M NaCl沖洗該柱，并通過對水的濃度梯度法洗脫得到級分。通過旋轉蒸發儀法將其濃縮，并且用蒸餾水透析得到約6.5ml純凈級分。凍干此純凈級分得到60mg純凈產物。此純凈產物顯示出編程性細胞死亡誘導活性。
(4)純凈產物編程性細胞死亡誘導作用的測定以如下方法測定上述級分B和實施例1-(3)中提及的純凈產物的編程性細胞死亡誘導活性。這樣，將級分B或上述純凈產物的0.5ml水溶液加到在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養基中培養的2.5×105細胞/4.5mlHL-60(ATCC CL-240)中，并在37℃孵育48小時。同時，加入蒸餾水和已知有編程性細胞死亡誘導活性的放線菌素D溶液制備對照樣品。在顯微鏡下肉眼觀察編程性細胞死亡體的形成、細胞的皺縮和核的聚集，由此對活細胞計數。觀察到這樣的現象并確認活細胞數減少時，可確定編程性細胞死亡誘導活性為陽性。
在加入級分B、純化產物或放線菌素D的情況下證實編程性細胞死亡誘導活性。圖2中給出了結果。這樣，圖2顯示了當以終濃度分別為2mg/ml或0.9mg/ml的限度將級分B或純凈產物加入到上述HL-60細胞培養基中時，孵育時間和培養基中活細胞數之間關系圖。橫坐標是孵育時間(小時)，而縱坐標是培養基中活細胞數(×105/5ml)。圖中空方形是加水的對照，空菱形是加級分B的情況，空圈是加純凈產物的情況。
(5)有編程性細胞死亡誘導作用的純凈產物的物理和化學特性測定上面實施例1-(3)中提及的純凈產物的物理和化學特性。
(ⅰ)NMR分析使用JNM-A500核磁共振設備(Nippon Denshi生產)測定1H-NMR。
圖3表示的1H-NMR圖譜顯示了結果。圖3中，縱坐標顯示了信號強度，橫坐標顯示了化學位移值(ppm)。另外，1H-NMR中的化學位移值以定義HOD的化學位移值為4.65ppm來表達。
1H-NMR(D2O)δ0.7(脂肪酸末端甲基的H),1.1(脂肪酸的亞甲基和巖藻糖C-5位甲基的H),3.1-5.6(源自糖的H)(ⅱ)GC-MS分析將HCl的5％甲醇溶液(1ml)加到實施例1-(3)提及的純凈產物2mg中，并且將得到的混合物封在試管中，在85℃加熱3小時。冷卻后，用1ml正己烷將其提取三次，并在氮蒸氣下將正己烷提取得到的提取物濃縮到約500μl，得到樣品A。
通過向殘余的甲醇層中加入碳酸銀將其中和并過濾，向濾液吹氮蒸氣以將其蒸發至干燥，再用真空泵干燥殘渣4小時。干燥后，將5滴TMS試劑(按如下制備即，將2.6ml六甲基二硅氮烷加到2.0ml干燥吡啶中，然后在其中加入1.6ml三甲基氯硅烷，通過離心除去得到的渾濁物質，將由此得到的上清液用作試劑)加到殘渣中，并在室溫將得到的混合物靜置30分鐘。之后在50℃加熱該混合物10分鐘，冷卻并加1ml氯仿后攪拌，再用1ml水沖洗氯仿層三次。得到的氯仿溶液用作樣品B。
使用DX-302質譜儀(Nippon Denshi生產)在以下面的條件對上述制備的樣品A和B進行GC-MS分析。柱TC-1(G.L.Science),30m×0.25mm內直徑溫度以每分鐘4℃的速度從130℃升到250℃，并在250℃保持5分鐘流動速率每分鐘1.2ml氦氣質譜測定的質量范圍m/z 50-500質譜測定的重復時間3秒柱TC-1(G.L.Science),30m×0.25mm內直徑溫度以每分鐘4℃的速度從130℃升到300℃，并在300℃保持5分鐘流動速率每分鐘1.2ml氦氣質譜測定的質量范圍m/z50-800質譜測定的重復時間3秒結果是樣品A和B分別呈現出如圖4和圖5中顯示的完全離子色譜圖。每個圖中縱坐標是相對強度(％)，而橫坐標的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
通過對質譜圖每個峰的分析來證實色譜圖中得自樣品A和B的峰。
十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲基酯(峰2)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲基酯(峰3)和十四碳烯酸的甲基酯(峰1)被證實為得自樣品A的主要組分。
從樣品B中證實了源自甘油的峰(峰1)、源自巖藻糖的峰(峰2、3和4)、源自木糖的峰(峰5和6)、源自甘露糖的峰(峰7)、源自半乳糖的峰(峰8、9和10)以及源自葡糖醛酸的峰(峰11)。
相應地，發現上述純凈產物含有甘油脂和/或甘油糖脂。實施例2(1)將干燥過的Kjellmaniella crassifolia的磨碎產物懸浮在20升80％乙醇中，在25℃攪拌3小時，過濾以除去可溶性物質。將得到的殘渣懸浮在20升含有1.5單位含內硫酸化巖藻糖的多糖(參考WO97/26896)、10％乙醇、100mM氯化鈉和50mM氯化鈣的緩沖液(pH8.2)中，在25℃攪拌24小時。然后將此攪拌過的溶液過濾，用含50mM氯化鈉的10％乙醇沖洗。將沖洗過的殘渣懸浮在40升含4g藻酸裂合酶(Nagase Seikagaku Kogyo生產)、100mM磷酸二氫鈉、100mM氯化鈉和10％乙醇的緩沖液(pH6.6)中，并在25℃攪拌96小時。溶液離心，所得上清液用裝備有排阻分子量為100,000的中空纖維的超濾器濃縮，并將其用含100mM氯化鈉的10％乙醇取代。在此溶液中加相同體積的0.4M乙酸鈣溶液，將混合物攪拌30分鐘并離心，在相同的上述條件下將得到的上清液超濾，用100mM氯化鈉取代。在此溶液中加氯化鈉使其濃度為1M并將pH調節到8，于是得到源自Kjellmaniella crassifolia的1.4升提取物。
用2.9升苯基纖維素精細柱(Phenylcellulofine柱)(Seikagaku Kogyo生產)處理提取物并用6升1M氯化鈉、6升水和8升乙醇依次洗脫。
通過實施例1-(4)中提到的方法測定每個洗脫級分的編程性細胞死亡誘導作用，在乙醇洗脫下來的級分中注意到編程性細胞死亡誘導作用和對癌細胞的抑制作用。
濃縮乙醇洗脫的級分并將其蒸發至干燥，將殘渣溶解在乙醇中以得到175ml溶液，其中的58ml用預先經乙醇平衡的1,130ml SepharoseLH-60柱(Pharmacia生產)處理，用乙醇洗脫該柱并以每60ml為一份收集洗脫液。
圖6給出了洗脫模式。這樣，圖6顯示了Sepharose LH-60柱層析結果圖，其中縱坐標是在230nm的吸光度，橫坐標是級分序號。
通過實施例1-(4)中提及的方法測定洗脫級分的編程性細胞死亡誘導活性，于是發現級分序號為8-15和27-49的級分無活性，而級分號為16-21和22-26的級分顯示了編程性細胞死亡誘導作用和抑制癌細胞生長的作用。
在顯示有活性的那些級分中，通過實施例1中提及的方法對三個級分(級分號20、21和23)進行成分分析。
圖7、8、9、10、11和12顯示了級分號20、21和23中的每一個的脂質組分或糖組分的完全離子色譜圖。這樣，圖7、8和9顯示了級分號20、21和23中的每一個的脂質組分的完全離子色譜，而圖10、11和12是顯示了級分號20、21和23中的每一個的糖組分的完全離子色譜。在每個圖中，縱坐標是相對強度(％)，而橫坐標的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖7和10中顯示了十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖7中峰1)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖7中峰3)、十六碳烯酸的甲酯峰(圖7中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖7中峰4)，從級分號為20的級分中檢測出源自甘油的峰(圖10中峰1)和源自半乳糖的峰(圖10中峰2、3和4)。圖8和11中顯示了十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖8中峰1)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖8中峰3)、十六碳烯酸的甲酯峰(圖8中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖8中峰4)，從級分號為21的級分中檢測出源自甘油的峰(圖11中峰1)和源自半乳糖的峰(圖11中峰2、3和4)。
圖9和12中顯示了十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖9中峰1)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖9中峰2)，從級分號為23的級分中檢測出源自甘油的峰(圖12中峰1)和源自半乳糖的峰(圖12中峰2、3和4)。
這樣，證實了上述級分含有甘油脂和/或甘油糖脂，并且闡明了甘油脂和/或甘油糖脂有編程性細胞死亡誘導活性和抑制癌細胞生長的活性。
(2)收集從如實施例2-(1)中提到的Sepharose LH-60柱洗脫下來的級分號為16-26的級分，濃縮并蒸發至干燥，干燥殘渣在氯仿中溶解，溶液上樣至用200ml latrobeads 6RS-8060(Iatron生產)填充的預先經氯仿平衡的柱，用氯仿洗脫，然后相繼用以80∶20、60∶40、40∶60和20∶80的比例混合的氯仿丙酮混合液連續洗脫。結果確定，用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脫的級分表現出強編程性細胞死亡誘導活性。
確定了編程性細胞死亡誘導活性的級分以實施例1中提到的方法進行組分分析。
圖13、14、15和16顯示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脫的每一級分的脂質和糖組分的完全離子色譜。這樣，圖13和14顯示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脫的每一級分的脂質組分的完全離子色譜，圖15和16顯示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脫的每一級分的糖組分的完全離子色譜。在每個圖中，縱坐標是相對強度(％)，橫坐標的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖13和15中顯示從用氯仿洗脫的級分中檢測出了一個十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖13中峰1)和一個源自甘油的峰(圖15中峰1)，而在圖14和16中顯示，從用80∶20的氯仿丙酮的混合液洗脫的級分中檢測出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖14中峰1)和十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖14中峰2)和一個源自甘油的峰(圖16中峰1)。
如此，確證了上述這些級分包含甘油脂，并且證實了甘油脂具有編程性細胞死亡誘導活性和抑制癌細胞生長的活性。實施例3(1)在230ml源自如實施例1-(1)中提到的Kjellmaniellacrassifolia的40倍濃縮提取物中加入水達到910ml，之后向其中加入490ml乙醇并將混合物攪拌兩小時，離心以制備溶解于35％乙醇的物質。這一35％乙醇溶解物質經濃縮并蒸發至干燥，加入100ml水，之后加入400ml氯仿和甲醇的2∶1混合物，得到的混合物充分攪拌，并將由此分離出的上清液回收。蒸發下層有機溶劑相，并向其中加入水至100ml，將此操作重復三次。得到的上層溶液經濃縮并蒸發至干燥，向其中加入10ml氯仿得到可溶于氯仿的物質。這一氯仿溶解物質經濃縮，上樣至一個填有200mlIatrobeads 6RS-8060(由Iatron生產)的預先用氯仿平衡的柱，該柱用氯仿洗脫，之后相繼用以90∶10、70∶30、40∶60和20∶80的比例混合的氯仿和丙酮混合液洗脫。
結果，強編程性細胞死亡誘導活性在用氯仿洗脫的級分和用40∶60氯仿和丙酮混合液洗脫的級分中得到確證。
(2)用氯仿洗脫的級分點樣于硅膠板60F254(Merck生產)上并用9∶1的己烷和乙醚作展開劑進行薄層層析，由此在Rf值為約0.25處檢測出一個具有編程性細胞死亡誘導活性和抑制癌細胞生長的活性的單一點。
對該點以實施例1中提到的方法進行不同組分的分析。
圖17和18顯示Rf值為約0.25的該點的脂質組分或糖組分的完全離子色譜。這樣，圖17顯示Rf值為約0.25的點的脂質組分的完全離子色譜，而圖18顯示Rf值為約0.25的點的糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標是相對強度，而橫坐標的上半部和下半部分別表示保留時間(分鐘)和掃描序號。
從圖17和18中顯示，從Rf值為約0.25的點檢測出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖17中峰1)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖17中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖17中峰3)和一個源自甘油的峰(圖18中峰1)。
(3)用40∶60氯仿和丙酮混合液洗脫的級分用95∶12的氯仿和甲醇作展開劑進行薄層層析，由此在Rf值為約0.33處檢測出一個具有編程性細胞死亡誘導活性和抑制癌細胞生長的活性的點。
對該點以實施例1中提到的方法進行不同組分的分析。
圖19和20顯示Rf值為約0.33的該點的脂質組分或糖組分的完全離子色譜。這樣，圖19顯示Rf值為約0.33的點的脂質組分的完全離子色譜，而圖20顯示Rf值為約0.33的點的糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標是相對強度，而橫坐標的上半部和下半部分別表示保留時間(分鐘)和掃描序號。
從圖19和20中顯示，從Rf值為約0.33的點檢測出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖19中峰1)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖19中峰2)和源自半乳糖的峰(圖20中峰2、峰3和峰4)以及一個源自甘油的峰(圖20中峰1)。
由此，確證上面給出的實施例3-(2)和實施例3-(3)中提到的點包含甘油脂和甘油糖脂，并且證實此甘油脂和甘油糖脂具有編程性細胞死亡誘導活性和抑制癌細胞生長的活性。實施例4將10倍體積的水加入到2.5kg干燥的壓碎到1mm試管中的Kjellmaniella crassifolia中，在上述海帶片膨脹后，用離心去除上清液。將乙醇和水加入到膨脹的海帶中，最終有10倍體積的60％乙醇存在，之后將此混合物在37℃攪拌三小時，離心以制備上清液。上清液經濃縮，之后在750ml它的水溶液中加入氯仿和甲醇，得到氯仿∶甲醇∶水的比例為2∶4∶0.8，混合物經充分攪拌，分離下層有機相溶液。
將下層溶液濃縮并蒸發至干燥，從中制備出來一種氯仿溶解物質，將其上樣至預先經氯仿平衡的200ml Iatrobeads 6RS-8060柱(Iatron生產)，并用氯仿、之后用氯仿和丙酮(40∶60)混合液、丙酮和甲醇混合液相繼洗脫該柱。
每個洗脫級分經濃縮后，點樣于硅膠板60F254，并對每個確證有甘油脂的級分用櫻草靈試劑和苔黑酚試劑進行甘油脂的檢測。結果是用低極性的溶劑洗脫的級分含更高量脂質，并就編程性細胞死亡誘導作用和抑制癌細胞生長作用而言表現出更強的活性。實施例5干燥的Kjellmaniella crassifolia經由一個混合器磨碎。在0.5g得到的海帶粉中加入25ml的①60mM HCl、②1M醋酸、③1％NaHCO3、④1％Na2CO3、⑤1％Na2CO3、⑥2∶1的氯仿和甲醇的混合液、⑦75％乙醇水溶液、⑧0.1％SDS或⑨0.01％SDS，在60℃以①、②、③、④和⑦提取，或在37℃以所有其它幾項提取，提取進行三小時。在此，溶液①-⑨將被稱為初級提取劑。①和②用Na2CO3中和，④和⑤用HCl中和，所有其它試劑經離心，之后用于以下操作。
A．沉淀物中加入25ml75％乙醇水溶液，在60℃進行提取兩小時，離心后的上清液經濃縮并蒸發至干燥，殘渣溶于1ml的75％乙醇水溶液。
B.10ml上清液中加入30ml乙醇，接著攪拌，離心后的上清液在真空中經濃縮并蒸發至干燥，殘渣溶于0.4ml的75％乙醇水溶液中。
C．上清液在真空中蒸發至干燥，殘渣溶于1ml的75％乙醇水溶液中。
由此制備的提取產物用75％乙醇水溶液稀釋，在96孔微量滴定板的每個孔中加入5μl并風干，向其中加入100μl的包含10％胎牛血清和5,000個HL-60細胞的RPMI 1640培養基，用將在下面實施例7中描述的MTT法檢測抑制癌細胞生長的活性。
得到如表1所示結果。這樣，表1顯示提取方法和抑制癌細胞生長的活性之間的關系，表中的數據顯示具有抑制癌細胞生長的活性的稀釋溶液的稀釋率。在用75％乙醇水溶液提取前，粉末化的海帶用酸(①A)或堿(③A、④A、⑤A)溶液為初級提取劑進行處理，由此提取出與未處理的情況(⑦C)相比較具有兩倍強度的抑制癌細胞生長的活性的物質。另外，那些級分的編程性細胞死亡誘導活性用將在下面實施例8中描述的一種方法進行檢測，以確定具有抑制癌細胞生長活性的級分的編程性細胞死亡誘導活性。
表1初級提取劑 AB C① 8＜2② 44③ 8-④ 84⑤ 82⑥ 8⑦ 4⑧ 2⑨ ＜2實施例6(1)依據日本審查專利出版物(公告)平-06/34,660中提到的方法培養Lyophyllum ulmarium M-8171(FERM BP-1415)用于制備其子實體。另外，這樣得到的子實體與日本市場上可以買到的名為“YamabikoHonshimeji”的子實體相同。再者，可依據日本公開專利出版物(公開)平-03/65,261中提到的方法，培養荷葉離褶傘K-3304(FERM BP-4348)用于制備它的子實體(日本名，hatakeshimeji)。冷凍干燥每種子實體，以及可買到的Grifola frondosa、Flammulina velutipes、香茹和光帽磷傘，并將最終的凍干產物磨碎以得到其磨碎產物。
在每0.5g上面制備的磨碎產物中加入75％的乙醇水溶液(25ml)，室溫下提取兩小時。離心獲得提取物后，將其濃縮并在真空中蒸發至干燥獲得干燥產物。再將干燥產物溶于1ml水制備乙醇提取物。
(2)上述實施例6-(1)中提到的乙醇提取物的抑制癌細胞生長活性的測定。
用GD/XPES過濾器(Whatman生產)過濾滅菌每種乙醇提取物，并用滅菌過的水制備稀釋系列。在96-孔的微量滴定板的每孔中各放置10μl稀釋液，向其中加入含有10％胎牛血清和5000 HL-60細胞的RPMI1640培養基100μl，于37℃在5％二氧化碳氣的條件下孵育48小時。在光學顯微鏡下觀察細胞形狀，加入10μl含有5mg/ml3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-聯苯酚-溴化四唑(MTT；Sigma生產)的磷酸緩沖鹽水溶液，再孵育四小時后在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態。同時，加入含0.04NHCL的2-丙醇100μl充分攪拌，于590nm測定吸光度以衡量細胞生長程度。
對于那些蘑菇乙醇提取物的抑制癌細胞生長的活性，在30倍的Lyophyllum ulmarium稀釋液和10倍的荷葉離褶傘稀釋液中發現癌細胞被殺死，由此注意到其強大的抑制癌細胞生長的活性，并且發現編程性細胞死亡體(apoptic body)。在3倍的Grifola frondosa、Flammulinavelutipes、香茹和光帽磷傘稀釋液中細胞被殺死，在10倍稀釋液中發現編程性細胞死亡體。由此可見那些蘑菇的每種乙醇提取物均顯示強的抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導活性。
(3)對于Lyophyllum ulmarium的乙醇提取物，可通過實施例1中提到的方法對其組分進行分析。
圖21和22顯示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中脂質組分或糖組分的完全離子色譜。這樣，圖21顯示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中脂質組分的完全離子色譜，圖22顯示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標為相對強度(％)，而橫坐標的上半部和下半部分別表示保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖2l和22顯示在Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖21的峰1)和順-9，順-12-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖21的峰2)。來自葡萄糖的峰(圖22的峰2,3和4)，來自甘露醇的峰(圖22的峰5)和來自甘油的峰(圖22的峰1)均可被檢測出來。
已證明其它蘑菇乙醇提取物中亦存在甘油脂和/或甘油糖脂。實施例7將實施例6中提到的冷凍磨碎Lyophyllum ulmarium(5g)懸浮于250ml的75％乙醇水溶液中，在室溫下振搖懸浮物兩小時以分離入上清液，離心沉淀制得提取物。將提取物濃縮，并用旋轉蒸發儀蒸發干燥(30℃)，殘留物重新溶解于20ml75％乙醇水溶液中，得到濃縮的Lyophyllumulmarium提取物。在Lyophyllum ulmarium的一部分濃縮提取物中加入1.5倍體積的水和同體積的氯仿，所得懸浮物經分餾后分為上層和下層。將每個分餾上層和下層濃縮，蒸發干燥，殘留物重新溶解于1.5倍體積(所用濃縮Lyophyllum ulmarium提取物)的75％的乙醇水溶液中，每種分餾物抑癌細胞生長的活性測定如下。
用75％的乙醇水溶液制備每種級分在75％乙醇水溶液中的重溶溶液稀釋系列。在96-孔微量滴定板的每一孔中各加入5μl稀釋液并干燥，加入含有10％胎牛血清和5000HL-60細胞(ATCCCCL-240)的RPMI1640培養基100μl，于37℃孵育48小時。在光學顯微鏡下觀察細胞形狀后加入10μl含有5mg/ml MTT的緩沖鹽水溶液，再孵育四小時后在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態。同時，加入含0.04N HCL的2-丙醇100μl，充分攪拌，于590nm測定吸光度以衡量細胞生長程度(一種MTT方法)。
結果由20-倍下層中的上述級分殺死細胞，由此注意到其強大的抑制癌細胞生長的活性并證實編程性細胞死亡體存在。這樣，這種Lyophyllumulmarium的濃縮提取物由氯仿以同樣的方式分餾，取得的級分重新溶解到流動相用于硅膠柱層析，從而取代了溶解于75％乙醇水溶液再用于硅膠柱層析的方法。硅膠柱層析在兩種流動相條件下獨立進行，分別為氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4(條件1)和氯仿∶甲醇=65∶25(條件2)。每種硅膠柱層析的級分均濃縮并蒸發干燥，殘留物重新溶解在相當于初始液體體積1/20的75％乙醇水溶液中，通過同上的MTT方法測定它的抑制癌細胞生長的活性，被證實具有活性的級分通過薄層層析的方法分析(氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4)。結果在條件1下，級分A中有活性，表現為與櫻草靈試劑的斑點反應(脂質)，與茚三酮試劑的斑點反應(氨基)，與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應(糖)和與Dittmer試劑的斑點反應(磷脂)，級分B的活性表現為與櫻草靈試劑的斑點反應和與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應。在條件2下，在級分C中有活性，表現為與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應，級分D中的活性表現為與櫻草靈試劑的斑點反應和苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應，級分E中的活性，表現為與櫻草靈試劑的斑點反應，與茚三酮試劑的斑點反應和與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應。進一步，在條件1下收集級分A，濃縮并蒸發干燥，溶解入流動相用于硅膠柱層析。將氯仿和甲醇95∶5比率的混合物用作流動相(條件3)。用與前面所述相同的MTT方法分析每種級分，被證實具有活性的級分通過薄層層析的方法分析(氯仿∶甲醇=95∶5)。結果在條件3下，級分F中的活性表現為與櫻草靈試劑的斑點反應，級分G中的活性表現為與櫻草靈試劑的斑點反應和與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應，級分H中的活性表現為與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應。編程性細胞死亡體的形成證實了那些抑制癌細胞生長的活性級分的編程性細胞死亡誘導活性。實施例8懸浮實施例6中提到的Lyophyllum ulmarium的磨碎凍干產物(1g)于50ml的75％乙醇水溶液或50％乙醇水溶液中，在37℃振搖兩小時，離心分離入上清液和沉淀，制得各種提取物。將每種提取物濃縮，并用旋轉蒸發儀蒸發干燥(30℃)，重新溶解于8ml的75％乙醇水溶液或50％乙醇水溶液中得到濃縮的Lyophyllum ulmarium提取物。
用75％或50％的乙醇水溶液稀釋每種濃縮的Lyophyllum ulmarium提取物。稀釋液按實施例7中提到的MTT方法分析。在用75％或50％的乙醇水溶液稀釋的10-倍提取物溶液中注意到細胞的死亡，證實了其抑制癌細胞生長的活性。這樣又證實了在用75％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液的提取條件下，具有抑制癌細胞生長的活性物質可被提取出。進一步，可用那些濃縮的Lyophyllum ulmarium提取物測定編程性細胞死亡誘導活性。因此，用25μl每種上面提到的濃縮提取物為例，從中蒸發去乙醇，殘留物中加入在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基中37℃孵育48小時的2.5×105HL-60細胞/4.5ml。同時，通過添加蒸餾水和已知具有編程性細胞死亡誘導活性的放線菌素D溶液(10μg/ml)制備對照樣品。在光學顯微鏡下目視觀察可見編程性細胞死亡體的形成、細胞的收縮和核的凝聚，并可對活細胞計數。當觀察到這些現象并注意到活細胞數目減少時，可判定樣品具有編程性細胞死亡誘導活性。結果，75％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液的提取物含有編程性細胞死亡誘導的物質。實施例9(1)將25ml的75％乙醇水溶液加入0.5g每種可買到的糙皮側耳和普通蘑菇(Agaricus bisporus或類似物)的凍干粉末，提取在37℃進行兩小時。離心后的上清液濃縮并于真空中蒸發干燥，殘留物溶解于1ml的75％乙醇水溶液并用75％的乙醇水溶液稀釋。1μl稀釋液中加入含有10％胎牛血清和5000HL-60細胞的RPMI 1640培養基100μl，此混合物用于按實施例7中提到的MTT方法測定抑制癌細胞生長的活性，亦用實施例8中提到的方法測定編程性細胞死亡誘導活性。結果2倍的糙皮側耳稀釋液和未稀釋的普通蘑菇溶液均顯示出兩種活性。
(2)在40g實施例6中提到的Lyophyllum ulmarium中加入0(0％)、50(25％)、100(50％)或150ml(75％)乙醇和160、110、60或10ml水，混合物置混合器混勻30秒，室溫下振搖兩小時，過濾得到提取物。用75％乙醇水溶液稀釋提取物，并分別通過實施例7中提到的MTT方法和實施例8中提到的方法測定其抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導活性。結果用0、25和50％乙醇水溶液的2倍稀釋提取物溶液和用75％乙醇水溶液5-倍稀釋的提取物溶液均可見兩種活性。
將上面提到的40g Lyophyllum ulmarium切成3-5mm的立方體，加入50(25％)、100(50％)或150ml(75％)乙醇和110、60或10ml水，混合物在室溫下振搖兩小時，過濾得到提取物。用75％醇水溶液稀釋提取物，并通過實施例7中提到的MTT方法測定其抑制癌細胞生長的活性，通過實施例8中提到的方法測定其編程性細胞死亡誘導活性。結果原始(未稀釋的)含25％乙醇的提取物溶液和用50％和75％醇2-倍稀釋提取物溶液均可見兩種活性。
(3)將買來的香茹(Cortinellius shiitake)凍干，磨碎，得到的粉末在表2所示的條件下提取兩小時。
表2香茹粉末乙醇濃度用于提取的液體量 用于提取的溫度①0.5g 25％20ml 60℃②0.5g 75％10ml 室溫③0.5g 50％10ml 室溫④0.5g 75％25ml 室溫提取后，不溶物質經離心后移去，濃縮上清液并在真空中蒸發干燥，用1ml與提取時相同濃度的乙醇水溶液溶解。用75％乙醇水溶液溶液稀釋該溶液，并通過實施例7提到的MTT方法測定其抑制癌細胞生長的活性，通過實施例8中提到的方法測定其編程性細胞死亡誘導活性。結果10-倍稀釋的液(1)、2-倍稀釋的液(2)、5-倍稀釋的液(3)和5-倍稀釋的液(4)中均可見兩種活性。
(4)分開買到的香茹的菌帽和菌柄。將每種分別凍干，磨碎。在0.5g得到的粉末中加75％醇水溶液25ml，于37℃提取兩小時。濃縮經離心后的上清液，并在真空中蒸發干燥，殘留物溶解于1ml75％乙醇水溶液中，所得溶液用75％乙醇水溶液稀釋。每種稀釋液抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導活性分別通過實施例7提到的MTT方法和實施例8中提到的方法測定。結果在菌帽提取物的2-倍稀釋液和菌柄提取物的20-倍稀釋液中均可見兩種活性。高級的中國香茹干以及中等級別的中國香茹的菌帽和菌柄均用混合器磨碎，用同樣提取物和同樣用于編程性細胞死亡誘導活性的測定方法處理，所有高級提取物和中等級別的菌帽和菌柄的5-倍稀釋提取物溶液均顯示兩種活性。實施例10(1)在買來的綠茶粉末(matcha)0.5g中加入25ml含75％乙醇水溶液，混合物在室溫振搖兩小時。離心提取物，濃縮上清液并在真空中蒸發干燥，殘留物溶解于1ml水中。
將提取物稀釋成從1-倍到100-倍的系列。在96-孔的微量滴定板的每孔中各放置10μl稀釋液，加入含有10％胎牛血清和5000HL-60細胞的RPMI1640培養基100μl，孵育48小時，在光學顯微鏡下觀察細胞的生長狀態。結果在用水和75％乙醇水溶液稀釋的提取物中，細胞均被殺死，即茶的水和乙醇溶液提取物均顯示很強的抑制癌細胞生長的活性。另外，由于編程性細胞死亡體的形成，證實了它們的編程性細胞死亡誘導活性。
(2)應用實施例1中提到的方法處理實施例10-(1)中提到的綠茶粉末乙醇提取物以分析不同的組分。
圖23和24顯示綠茶粉末乙醇提取物中脂質組分或糖組分的完全離子色譜。即，圖23顯示綠茶粉末乙醇提取物中脂質組分的完全離子色譜，而圖24顯示綠茶粉末乙醇提取物中糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標為相對強度(％)，而橫坐標的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖23和24顯示綠茶粉末乙醇提取物中十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖23的峰1)和9,12,15-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖23的峰2)，來自葡萄糖的峰(圖24的峰3,4)，和來自甘油的峰(圖24的峰1)均可被檢測出來，因此可證實甘油脂和/或甘油糖脂的存在。還可檢測出來自肌醇的峰(圖24的峰5)和來自奎寧酸的峰(圖24的峰2)。實施例11(1)取0.5g米糠，加水、75％乙醇水溶液或90％乙醇水溶液，在室溫振搖兩小時。離心提取物，濃縮上清液并在真空中蒸發干燥，殘留物溶解于1ml水中。在用90％乙醇水溶液獲得的提取物中，不溶于水的物質溶解于乙醇。將樣品稀釋，它們抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導活性分別通過實施例7提到的MTT方法和實施例8中提到的方法測定。結果在水提取物的5-倍稀釋液、未稀釋的75％乙醇提取物溶液和90％乙醇提取物醇溶片段的10-倍稀釋液中均可見兩種活性，可見米糠乙醇提取物顯示很強的抑制癌細胞生長和編程性細胞死亡誘導活性。
(2)應用實施例1中提到的方法處理實施例11-(1)中提到的米糠75％乙醇提取物以分析不同的組分。
圖25和26顯示米糠75％乙醇提取物中脂質組分或糖組分的完全離子色譜。即，圖25顯示米糠75％乙醇提取物中脂質組分的完全離子色譜，而圖26顯示米糠75％乙醇提取物中糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標為相對強度(％)，而橫坐標的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖25和26顯示米糠75％乙醇提取物中十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖25的峰1)、十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖25的峰3)和順-9，順-12-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖25的峰2)。來自葡萄糖的峰(圖26的峰2,3)和來自甘油的峰(圖26的峰1)均可被檢測出來，因此可證實甘油脂和/或甘油糖脂的存在。實施例13將來源于菠菜的單半乳糖甘油二酯(Wako Pure Chemical制造)，來源于小麥的單半乳糖甘油二酯(Funakoshi制造)和來源于小麥的雙半乳糖甘油二酯懸浮于少量正癸烷中，用超聲方法進一步分散懸浮物，向其中加入乙醇使正癸烷與乙醇比率為2∶98。溶液用RPMI 1640培養基稀釋至50倍，在0.5ml溶液中加入4.5ml含2.5×105HL-60細胞，該細胞在含有10％胎牛血清的RPMI1640培養基中孵育。上述產物在37℃孵育48小時，用實施例1-(4)中提到的方法測定其編程性細胞死亡誘導活性，由此證實了它具有很強的編程性細胞死亡誘導活性和抑制癌細胞生長的活性。實施例14將買來的卷心菜、茄子皮、去皮的茄子和菠菜葉凍干，磨碎，按與實施例9-(4)相同的方法提取，它們抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導活性分別通過實施例7提到的MTT方法和實施例8中提到的方法測定，由此在卷心菜、茄子皮和菠菜葉提取物的2倍稀釋液以及去皮茄子的5倍稀釋液中均有兩種活性。
本發明的益處依據本發明，提供甘油脂和/或甘油糖脂(如來自植物微生物或動物的具有強編程性細胞死亡誘導活性的甘油脂和/或甘油糖脂)是有效組分的編程性細胞死亡誘導劑，另外，由于該編程性細胞死亡誘導活性，其亦可提供抗癌劑。該甘油脂和/或甘油糖脂大量存在于植物、微生物或動物的膜組分中，可通過乙醇水溶液或類似物有效提取，由此可容易獲得本發明中的有效組分。在用溶劑提取前，可先用酸或堿處理以提高提取效率。進而，根據其疏水性選擇提取溶劑的極性、用于分離的色譜載體等，可選擇性的制得目的甘油脂和/或甘油糖脂。其中含有、向其中加入或在其中稀釋有本發明中作為編程性細胞死亡誘導化合物的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料，因其每日攝取可改善健康，可用于健康食品。其中的甘油脂和/或甘油糖脂是從可食用的植物、微生物或動物中提取和/或純化的。
權利要求
1．一種編程性細胞死亡誘導劑，其特征在于包含甘油脂和/或甘油糖脂作為有效組分。
2．一種抗癌劑，其特征在于包含甘油脂和/或甘油糖脂作為有效組分。
3．權利要求1或2中所述的制劑，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂來源于植物、微生物或動物。
4．權利要求3中所述的制劑，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂來源于茶、蘑菇、藻類或谷物殘留物。
5．一種用于制備權利要求3中所述的制劑的方法，其中該方法包括用有機溶劑提取來源于植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
6．一種用于制備權利要求5中所述的制劑的方法，其中該方法包括用酸或堿處理來源于植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
7．一種用于制備權利要求5中所述的制劑的方法，其中該方法包括選擇應用疏水、反相或正相色譜方法分離來源于植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
8．一種用于制備權利要求5到7中任意一項所述制劑的方法，其中所述甘油脂和成甘油糖脂來源于茶、蘑菇、藻類或谷物殘留物。
9．用于誘導編程性細胞死亡的食物或飲料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀釋有甘油脂和/或甘油糖脂。
10．一種抗癌的食物或飲料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀釋有甘油脂和/或甘油糖脂。
11．權利要求9或10中所述的食物或飲料，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂來源于植物、微生物或動物。
12．權利要求11中所述的食物或飲料，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂來源于茶、蘑菇、藻類或谷物殘留物。
13．一種用于制備權利要求11中所述的食物或飲料的方法，其中所述方法包括用有機溶劑提取來源于植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
14．一種用于制備權利要求13中所述的食物或飲料的方法，其中所述方法包括用酸或堿處理來源于植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
15．一種用于制備權利要求13中所述的食物或飲料的方法，其中所述方法包括選擇應用疏水、反相或正相色譜方法分離來源于植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
16．一種用于制備權利要求13到15中任意一項所述的食物或飲料的方法，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂來源于茶、蘑菇、藻類或谷物殘留物。
全文摘要
一種編程性細胞死亡誘導劑或一種抗癌劑,其特征在于包含甘油脂和/或甘油糖脂作為有效組分。
文檔編號A61K35/12GK1233961SQ9719892
公開日1999年11月3日 申請日期1997年10月31日 優先權日1996年11月8日
發明者酒井武, 于福功, 小山信人, 巽容子, 佐川裕章, 豬飼勝重, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社