用于補體因子h相關蛋白質1檢測的試劑、試劑盒和方法
【專利說明】用于補體因子H相關蛋白質1檢測的試劑、試劑盒和方法
[0001] 本發明涉及用于特異性檢測來自對象的樣品中的補體因子H相關蛋白質1 (CFHR1)的測定，以及與之相關的試劑盒試劑。
[0002] 補體因子H也稱為因子H是含唾液酸糖蛋白，其在補體介導的免疫系統的調節中 起不可或缺的作用，所述補體介導的免疫系統涉及微生物防御、免疫復合物處理、程序性細 胞死亡和年齡相關性黃斑變性。補體因子H是最佳表征的補體因子H蛋白質家族成員。補 體因子H家族由下述成員組成：補體因子H(CFH)、補體因子H相關蛋白質1 (CFHR1)、補體 因子H相關蛋白質2 (CFHR2)、補體因子H相關蛋白質3 (CFHR3)、具有同種型4A和4B的 補體因子H相關蛋白質4 (CFHR4A和CFHR4B)、以及補體因子H相關蛋白質5 (CFHR5)。補 體因子H相關蛋白質在補體因子H基因下游編碼，并且與補體因子H的子結構域共享高度 同源性。補體因子H相關蛋白質還共享功能相似性（Jozsi，M.和Zipfel，P. F.，Trend in Immunology 29 (2008) 380-387)。
[0003] 補體系統由~40種蛋白質組成，所述~40種蛋白質存在于體液中或者細胞和組織 表面上，并且通過三個主要途徑以級聯樣方式活化（Walport，M. J.N.，Engl. J. Med. 344， 1058-1066)。替代途徑通過中心組分C3的自發水解以低速率連續活化，凝集素途徑通過識 別微生物碳水化合物的甘露糖結合凝集素或纖維膠原素（ficolins)起始，并且經典途徑通 過Clq與抗原結合的免疫球蛋白結合而活化。酶促步驟生成補體組分的活性片段，并且觸 發進一步的擴增。三個途徑在C3濃度時合并，所述C3在活化后被切割成C3a和C3b。補 體因子H保護宿主細胞免于起因于無限制的補體活化的損傷。補體因子H通過下述來調節 自身細胞上的補體活化：具有對因子I介導的C3b切割的輔因子活性，以及針對替代途徑 C3轉化酶C3bBb的衰變加速活性。補體因子H使自身細胞免于補體活化，而不是細菌/病 毒。由于補體因子H在補體調節中的中樞作用，存在起于異常(FH活性的許多臨床并發癥。 補體因子H基因中的突變與嚴重和多樣性疾病相關，包括罕見腎病癥溶血性尿毒癥綜合征 (HUS)和膜性增生性腎小球腎炎（MPGN)也稱為致密沉積物病（DDD)、膜性增生性腎小球腎 炎II型或致密沉積物病、以及更頻繁的視網膜疾病年齡相關性黃斑變性(AMD)。除其補體 調節活性之外，補體因子H還具有多重生理活性，并且1)充當細胞外基質組分，2)與整聯蛋 白型細胞受體結合，和3)與廣泛選擇的配體相互作用，例如C反應蛋白、凝血酶敏感蛋白、 骨唾液蛋白、骨橋蛋白和肝素。
[0004] 補體因子H蛋白質家族包含蛋白質CFH、CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4A、CFHR4B和 CFHR5〇
[0005] 顯而易見的是在現有技術中，沒有特異性方法可用于血液、血清、血漿、液體 (liquor)樣品或任何其他體液中的補體因子H相關蛋白質1 (CFHR1)的體外檢測。本發明 的發明人目前已發現且可以建立特異性測定衍生自個體的血液、血清、血漿或液體樣品中 的CFHR1的方法。
[0006] 本發明的目的是提供樣品中的CFHR1檢測的簡單和成本有效的操作，例如以便診 斷與CFHR1相關的疾病和病癥。
[0007] 全血、血清或血漿是臨床常規中最廣泛使用的樣品來源。幫助可靠檢測某種疾病 或提供早期預后信息的標記物的鑒定可以導致極大幫助該疾病診斷和管理的方法。尤其重 要的是改善某些疾病的早期診斷，因為早期干預可以減少功能殘廢且改善長期結果。
[0008] 本發明的目的是研宄在體外優選在對象的體液樣品中特異性評價CFHR1，即與其 他CFH家族成員無交叉反應性的方法。
[0009] 本發明的發明人已令人驚訝地能夠證實使用本發明的試劑盒，特異性檢測補體因 子H相關蛋白質1 (CFHR1)的方法，所述CFHR1是補體因子H家族成員的蛋白質。
[0010] 本發明的方法特別適合于對象的血液、血清、血漿或液體樣品中的CFHR1的體外 評價。
[0011] 所公開的方法和試劑盒可以克服目前已知的可用于評價CH1家族成員的方法的 幾個問題。
[0012] 在一個實施方案中，本發明涉及包含下述的試劑盒： a) 能夠結合補體因子H R1 (CFHR1)蛋白質的第一試劑，和 b) 能夠結合補體因子H R1 (CFHR1)蛋白質的第二試劑， 其中第一試劑和第二試劑與不同且非重疊的表位結合， 并且其中第一試劑和第二試劑兩者不都與(FH交叉反應， 并且其中第一試劑和第二試劑兩者不都與CFHR2交叉反應， 并且其中第一試劑和第二試劑兩者不都與CFHR3交叉反應， 并且其中第一試劑和第二試劑兩者不都與CFHR4交叉反應， 并且其中第一試劑和第二試劑兩者不都與CFHR5交叉反應， 并且其中一種試劑用可檢測標記進行標記， 并且其中另一種試劑能夠固定到固相上。
[0013] 在優選實施方案中，非重疊表位是位于CFHR1的不同結構域中的表位。
[0014] 驚訝地發現此類試劑盒允許特異性檢測來自對象的樣品中的CFHR1，如實施例 7、8、9和10中所示。特別地，成功使用包含標記的單克隆抗體MAB〈CFHRl>M-5. 1. 5和生 物素標記的抗體MAB〈CFH/CFHRl>M-L20/3的試劑盒。如實施例中所述，生物素標記的抗 體MAB〈CFH/CFHRl>M-L20/3能夠經由與包被有鏈霉抗生物素蛋白的磁性顆粒結合而固定 到固相上。另外，MAB〈CFHRl>M-5. 1.5是釕化的，并且可以通過電化學發光進行檢測。另 外，兩種抗體與不同且非重疊的表位結合，因為對應于CHFR1的氨基酸1-143的免疫原 (=CHFR1的SCR (短共有重復序列）結構域1-2)用于生成MAB〈CFHRl>M-5. 1. 5,而MAB〈CFH/ CFHRDM-L20/3與CFHR1的更C末端部分內，即在CHFR1的SCR結構域3-4-5內的表位結 合。
[0015] 第一試劑和第二試劑應理解為多肽或多肽復合物。
[0016] 因此，在本發明的試劑盒的一個優選實施方案中，第一試劑與SEQ ID No. 2的氨 基酸144 - 330內的表位結合。
[0017] 因此，在本發明的試劑盒的另一個優選實施方案中，第二試劑與SEQ ID No. 2的 氨基酸1-143內的表位結合。
[0018] 如表1中所示，MAB〈CFHRl>M-5. 1. 5不與CFH交叉反應，但顯示與CFHR2交叉反應。 另外，表1顯示MAB〈CFH/CFHRl>M-L20/3與(FH和CFHR5交叉反應，但不與CFHR2交叉反應。
[0019] 分別缺乏與CFHR2和/或era和CFHR5的交叉反應是至關重要的，因為CFH蛋白 質家族的這些成員顯示與CFHR1的最大結構相似性。
[0020] 因此，在本發明的試劑盒的另一個優選實施方案中，第一試劑不與CFHR2交叉反 應。
[0021] 在本發明的試劑盒的另一個優選實施方案中，第二試劑不與CFH交叉反應。
[0022] 在本發明的試劑盒的另一個優選實施方案中，第二試劑不與CFHR5交叉反應。
[0023] 在本發明的試劑盒的另一個優選實施方案中，第二試劑不與(FH和CFHR5交叉反 應。
[0024] 在試劑盒的一個優選實施方案中，第一試劑與(FH和CFHR5交叉反應，但不與 CFHR2、CFHR3 和 CFHR4 交叉反應。
[0025] 在試劑盒的另一個優選實施方案中，第二試劑與CFHR2交叉反應，但不與(FH、 CFHR3、CFHR4 和 CFHR5 交叉反應。
[0026] 根據本發明，"交叉反應"意指不同于靶蛋白質的所討論的蛋白質針對檢測試劑特 別是抗體的結合強度是用靶蛋白質測量的結合強度的至少〇, 2%，優選至少0,1%。結合強度 可以特別通過使用BiaCore應用本發明的實施例的親和力測試進行測量。如技術人員已知 的，如果作為Kd給出，則結合強度越佳/越高，則Kd越低。
[0027] CFH在某些體液中是可比較地豐富的，其濃度為CFHR1濃度約10倍。
[0028] 在本發明中使用的兩種試劑可以顯示出與(FH家族的其他成員的交叉反應性。然 而，在本發明中使用的兩種試劑不與CH1家族的相同成員交叉反應，即其中至多一種分別 與 CFH、CFHR2、CFHR3、CFHR4 和 CFHR5 交叉反應。
[0029] 因此，在本發明的試劑盒的一個優選實施方案中，第一試劑可以與(FH交叉反應， 但不與超過一種其他CFH家族成員交叉反應。
[0030] 因此，在本發明的試劑盒的另一個優選實施方案中，第一試劑可以與CFHR5交叉 反應，但不與超過一種其他CFH家族成員交叉反應。
[0031] 因此，在本發明的試劑盒的進一步甚至更優選的實施方案中，第一試劑可以與 CFHR5和CFH交叉反應，但不與其他CFH家族成員交叉反應。
[0032] 因此，在本發明的試劑盒的另一個優選實施方案中，第二試劑可以與CFHR2交叉 反應，但不與其他CFH家族成員交叉反應。
[0033] 根據本申請的" CFHR4 "涵蓋天然存在的變體CFHR4A和CFHR4B。如由本申請的圖 1可見的，存在CFHR4的兩種同種型，即如SEQ ID No. 5中公開的CFHR4A和如SEQ ID No. 6中公開的CFHR4B。CFHR4A和CFHR4B具有相同的N末端序列，但CFHR4B具有更短的C末 端部分。編碼CFHR4的基因轉錄物是可變剪接的，并且表達CFHR4的不同變體。存在長度 331個氨基酸的編碼CFHR4多肽的變體，以及577氨基酸變體。后者被稱為"CFHR4A"，而 短同種型被稱為"CFHR4B"。兩種變體均在人肝中表達，而僅短同種型被克隆且表達用于本 發明中。兩種變體的同源性分析顯示SCR結構域1在兩種變體中相同的。CFHR4A SCR2-5 與CFHR4B SCR2-4幾乎相同，僅具有少數氨基酸差異。進一步地，CFHR4B SCR6-9與CFHR4A SCR2-5 共享 100% 同一性（Joszi，Richter，L5schmann 等人，European Journal of Human Genetics，2005,13, 321-329)。因此，CFHR4A不被克隆且表達或用于交叉反應性測定中，因 為結構域組成已經由CFHR4B代表。在實驗中，因此使用CFHR4B以便測定與CFHR4的交叉 反應性。因此，對于CFHR4B獲得的實驗結果也應用于變體CFHR4A，并且因此應用于一般而 言的CraR4〇
[0034] 在甚至更優選的實施方案中，第一試劑是抗體，特別是抗體MAB〈CFH/ CFHRDM-L20/3。特別地，MAB〈CFH/CFHRl>M-L20/3 的重鏈具有 SEQ ID No. 41 的序列， 并且輕鏈具有SEQ ID No. 43的序列。在進一步優選的實施方案中，使用包含MAB〈CFH/ CFHRDM-L20/3的CDR序列的抗體。
[0035] 在甚至更優選的實施方案中，第一試劑是抗體，特別是抗體MAB〈CFHRl>M-5. 1. 5。 特別地，重鏈具有SEQ ID No. 16的序列。在進一步優選的實施方案中，輕鏈具有SEQ ID No. 18的序列。在進一步優選的實施方案中，使用包含根據3￡〇10此.19、3￡〇10此. 20、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 22、和 SEQ ID No. 23 的 MAB〈CFHRl>M-5. 1. 5 的 CDR 序列 和氨基酸序列ITS的抗體。
[0036] 如本文使用的，術語"可檢測標記"指能夠產生經由直接或間接檢測的信號的任何 物質。可檢測標記因此可以直接或間接檢測。對于直接檢測，適用于本發明的標記可以選 自任何已知的可檢測標記物組，如色原、熒光基團、化學發光基團（例如吖啶酯或二氧雜環 丁烷)、電化學發光化合物、催化劑、酶、酶底物、染料、熒光染料(例如熒光素、香豆素、羅丹 明、噁嗪、試鹵靈、花青及其衍生物)、膠體金屬和非金屬顆粒、以及有機聚合物膠乳顆粒。其 他可檢測標記的例子是發光金屬絡合物，例如如用于ECLIA的釕或銪絡合物，例如如用于 ELISA的酶，和例如如用于RIA的放射性同位素。
[0037] 間接檢測系統包括例如用生物親和（bioaffine)結合對的第一配偶體標記的檢測 試劑，例如檢測抗體。合適結合對的例子是半抗原或抗原/抗體、生物素或生物素類似物如 氨基生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素/抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白、糖/凝集 素、核酸或核酸類似物/互補核酸、和受體/配體例如類固醇激素受體/類固醇激素。優選 的第一結合對成員包含半抗原、抗原和激素。尤其優選的是半抗原如地高辛和生物素及其 類似物。此類結合對的第二配偶體例如抗體、鏈霉抗生物素蛋白等通常是標記的，以允許例 如通過如上所述的可檢測標記的直接檢測。
[0038] 在優選實施方案中，本發明的試劑盒進一步包含用于執行測量的輔助試劑。
[0039] 在一個優選實施方案中，本發明的試劑盒進一步包含在其上可以固定試劑的芯 片。
[0040] 本發明的試劑盒的第一試劑和第二試劑與不同且非重疊表位結合。此類表位可以 是線性或構象的。第一試劑和第二試劑可以與其CFHR1上的各自表位結合，而不干擾分別 的另一種試劑的結合。
[0041] 本發明首次允許特異性檢測對象的樣品中的CFHR1。另外，這首次允許診斷CFHR1 相關疾病和病癥，例如精神分裂癥。
[0042] 在一個實施方案中，本發明涉及用于特異性測量樣品中的補體因子H相關蛋白質 1 (CFHR1)的方法，其包括下述步驟：使樣品與能夠結合補體因子H相關蛋白質1 (CFHR1) 的第一試劑，以及能夠結合補體因子H相關蛋白質1 (CFHR1)的第二試劑接觸，從而形成在 所述第一試劑、CFHR1和所述第二試劑之間的復合物，和b)測量（a)中形成的復合物，其中 第一試劑和第二試劑均與CFHR1結合，并且不都與除CFHR1外的相同CFH家族成員交叉反 應。
[0043] 在進一步的實施方案中，本發明涉及用于檢測得自對象的樣品中的補體因子H相 關蛋白質1 (CFHR1)的體外測定，其包含 a) 使樣品與本發明的試劑盒中任一的試劑接觸， b) 將所形成的復合物固定至固相，和 c) 檢測(FHR1， 其中步驟b)可以在步驟a)之前、在步驟a)之后或與步驟a)同時執行。
[0044] 在優選實施方案中，在使預包被的固相與樣品接觸之前，能夠與CFHR1結合的一 種試劑可以固定至固體支持物，其可以與本發明的試劑盒中任一的其他試劑同時或順次與 固相一起溫育。
[0045] 在進一步的實施方案中，能夠與CFHR1結合的一種試劑可以固定至固體支持物， 同時使樣品與本發明的試劑盒中任一的其他試劑接觸。在該實施方案中，將所形成的復合 物固定至固相與步驟a)同時發生。
[0046] 在優選實施方案中，在另一種試劑與樣品接觸之前，根據步驟a)，使與（FH、 CFHR2、CFHR3、CFHR4和/或CFHR5具有更少交叉反應性的試劑與樣品接觸。
[0047] 在優選實施方案中，在步驟c)中測定CFHR1的量和/或濃度。
[0048] 當執行本發明的方法時，CFHR1以及如上所述的第一和第二試劑形成復合物，其中 第一和第二試劑各自與CFHR1結合。復合物形成可以是通過第一和第二試劑與CFHR1的共 價或非共價結合，優選通過非共價結合。因此，根據本發明"所形成的復合物"應理解為包 含CFHR1、如上所述的第一和第二試劑的復合物，其中在三種分子之間的結合可以是共價或 非共價的。
[0049] 可以在步驟a)之前，將能夠固定到固相上的試劑固定至固相。在使樣品與根據本 發明的試劑接觸前，固定的所形成的復合物將同時形成。
[0050] 可替代地，所形成的復合物在復合物形成后固定，如實施例7中所述。在實施例7 中，所形成的復合物經由非共價結合固定至磁性顆粒，所述磁性顆粒隨后使用電極固定到 表面上。在該實施方案中，步驟b)在步驟a)之前執行。
[0051] 一般而言，固定可以直接或間接地，并且通過共價或非共價方式執行。
[0052] 在優選實施方案中，固定在磁性顆粒上發生。本發明的試劑可以經由共價或非共 價結合與此類磁性顆粒結合。在實施例7中，結合經由生物素-鏈霉抗生物素蛋白結合而 發生。磁性顆粒包被有鏈霉抗生物素蛋白，而抗體是生物素化的。
[0053] 在優選實施方案中，生物親和結合對用于固定。合適的結合對的例子是半抗原或 抗原/抗體、生物素或生物素類似物如氨基生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素/抗生物素 蛋白或鏈霉抗生物素蛋白、糖/凝集素、核酸或核酸類似物/互補核酸、和受體/配體例如 類固醇激素受體/類固醇激素。優選的第一結合對成員包含半抗原、抗原和激素。尤其優 選的是半抗原如地高辛和生物素及其類似物。此類結合對的第二配偶體例如抗體、鏈霉抗 生物素蛋白等通常與固相結合，或共價附著至此類固相例如磁珠。
[0054] 在一些實施方案中，固相是測試條、芯片特別是微陣列或納米陣列芯片、微量滴定 板或微粒。
[0055] 發現樣品中的CFHR1濃度的體外測定允許對于患有神經發育、神經系統或神經精 神性病癥的患者，預測來自用甘氨酸再攝取抑制劑（GRI)治療的臨床利益。
[0056] 甘氨酸再攝取抑制劑（GRI)是被認為通過升高甘氨酸的細胞外濃度來增強NMDA 受體（NMDA-R)介導的傳遞的新類型化合物。來自健康個體、精神病患者和動物中的研宄以 及來自遺傳分析的證據經過過去15年已累積在神經發育、神經系統或神經精神性病癥的 病理生理學中的NMDA受體（NMDA-R)機能減退的改善。因為甘氨酸是NMDA-R復合物的專 性共激動劑，所以增強NMDA-R介導的神經傳遞的一種策略是升高NMDA受體的局部微環境 中的甘氨酸的細胞外濃度。甘氨酸升高可以通過GRI抑制來實現，所述GRI負責來自突觸 間隙的甘氨酸去除。超過現有神經系統和神經精神性療法的可能優點包括甘氨酸再攝取抑 制劑在具有良好功效中的潛力，以及用于治療精神分裂癥（陽性和陰性癥狀)、雙相性精神 障礙、物質依賴(酒精、可卡因）、自閉癥或強迫癥（OCD)中的陽性和陰性癥狀的改善的耐受 性概況。已知甘氨酸再攝取抑制劑可以用于治療神經發育、神經系統或神經精神性病癥例 如精神分裂癥。
[0057] 精神分裂癥是嚴重的精神障礙，通常在青春晚期或早期成人期出現，全世界流行 率為大約1%的成人群體，其具有巨大的社會和經濟影響。歐洲精神病學協會(Association of European Psychiatrists) (ICD)和美國美國精神病學協會（American Psychiatric Association) (DSM)的精神分裂癥診斷標準需要存在兩個或更多個特征性癥狀：妄想、幻 覺、言語紊亂、嚴重紊亂或緊張的行為、或陰性癥狀(失語癥、情感冷淡、缺乏動力、快感缺 乏)，以及存在其他要求例如排除情感障礙和功能受損的存在。作為群體，患有精神分裂癥 的人具有功能障礙，其可能在兒童期開始，繼續貫穿成人生活，并且使得大多數患者不能維 持正常就業或在其他方面具有正常社會功能。與一般群體相比較，他們還具有縮短的壽命， 并且患有的廣泛多樣的其他神經精神性綜合征的流行率增加，包括嚴重的物質濫用、抗精 神病藥物治療之前的強迫癥狀和異常不隨意運動。精神分裂癥還與廣泛范圍的認知障礙相 關，即使當精神病癥狀得到良好控制時，所述認知障礙的嚴重性也限制其功能。
[0058] 與谷氨酸能傳遞相關的其他適應癥是雙相性精神障礙、物質依賴(酒精、可卡因)、 自閉癥和強迫癥（0⑶）。
[0059] 因此，本發明還涉及預測如果用甘氨酸再攝取抑制劑（GRI)治療，則患有神經發 育、神經系統或神經精神性病癥的患者的應答的體外方法，其包括下述步驟： i) 通過執行本發明的測定來測定患者樣品中的CFHR1的蛋白質濃度， ii) 比較步驟i)中測定的蛋白質濃度與患有神經發育、神經系統或神經精神性病癥的 患者中的CFHR1的截斷值， iii) 其中患有神經發育、神經系統或神經精神性病癥的患者的樣品中的CFHR1的蛋白 質濃度高于截斷值指示患者將從GRI治療獲得臨床利益，和 iv) 對于患有神經發育、神經系統或神經精神性病癥的患者選擇GRI治療。
[0060] 在進一步優選的實施方案中，神經發育、神經系統或神經精神性病癥包括精神分 裂癥、雙相性精神障礙、物質依賴、自閉癥和強迫癥的陰性或陽性癥狀，特別是精神分裂癥 的陰性或陽性癥狀。
[0061] 在進一步優選的實施方案中，患者患有分裂情感性障礙。
[0062] 因此，在一個實施方案中，本發明涉及本發明的試劑盒用于測定得自對象的樣品 中的CFHR1的量和/或濃度的用途。
[0063] 此外，發現對于用GRI治療的應答者和非應答者可以可靠地通過測定體液中的 CFHR1濃度進行鑒定。
[0064] 因此，在進一步的實施方案中，本發明涉及本發明的試劑盒用于預測患者的臨床 利益的用途，所述患者用甘氨酸再攝取抑制劑進行治療。
[0065] 因此，在進一步的實施方案中，本發明涉及本發明的試劑盒用于預測如果用甘氨 酸再攝取抑制劑（GRI)治療，則患有神經發育、神經系統或神經精神性病癥的患者的臨床利 益的用途。
[0066] 例如，CFHR1基線血清值的截斷值可以計算為10 ug/ml，并且CFHR1值低于或等 于10 ug/ml的患者可以分層為"CFHR1低的"，而補體因子H血清值高于10 ug/ml的患者 可以分層為"CFHR1高的"。雖然安慰劑治療的患者在兩個亞組