蛋白質誘導的多能細胞技術及其用途
【專利摘要】通過下述生成蛋白質誘導的多能干細胞的方法：使用QQ-蛋白質轉導技術將細菌表達的重編程蛋白質遞送到起始體細胞的核內，重復幾次細胞重編程循環用于產生重編程蛋白質誘導的多能干細胞，將所述重編程的細胞移動到無飼養者培養基內用于擴增，和擴增且傳代全皿中的所述重編程的細胞用于生成同質piPS細胞。還提供的是使用這種方法形成的piPSC細胞及其用途。
【專利說明】蛋白質誘導的多能細胞技術及其用途
[0001]發明背景
1.【技術領域】
[0002]本發明涉及蛋白質轉導及其用途。更具體而言，本發明涉及蛋白質誘導的多能干細胞(piPSC)技術及其應用，所述piPSC技術在一周內以接近100%的轉換效率生成高品質PiPS細胞。本發明還涉及無飼養者piPSC培養條件和無需集落挑選和克隆擴增的全皿擴增及其應用。
[0003]2.相關技術描述
[0004]胚胎干(ES)細胞是衍生自胚胎的干細胞。對于目前技術狀態，人胚胎干細胞系的制備需要破壞人胚胎，產生關于人ES細胞研究的有爭議的倫理問題。ES細胞通過兩個區別性質不同于其他類型的細胞:多能性和無限的自我更新。在限定條件下，ES細胞能夠無限制地更新自身，允許ES細胞用作研究和再生醫學的有用工具，因為我們可以產生無限的ES細胞用于連續研究或臨床用途。ES細胞還能夠分化成三個主要胚層的所有衍生物:外胚層、內胚層和中胚層,包括成體體內超過220個細胞類型。多能性使ES細胞不同于成體組織中發現的成體干細胞；雖然ES細胞可以生成體內的所有細胞類型，但成體干細胞是多潛能的，并且僅能夠產生在這個組織類型內的有限數目的細胞類型。
[0005]ES細胞療法可以用于再生醫學和組織替代物用于損傷或疾病治療，例如血液、免疫系統和不同疾病相關遺傳疾病、癌癥、心血管疾病、青少年糖尿病、帕金森氏病和阿爾茨海默氏病、傷口愈合、類風濕性關節炎、脫發、耳聾、失明、肌萎縮側索硬化、肌營養不良和脊髓損傷。除了干細胞療法的倫理關注外，還存在與異體干細胞移植相關的移植物抗宿主病的技術問題。因為用于再生醫學的ES細胞來自人胚胎，所以當對個別患者執行ES細胞移植用于疾病治療時，免疫排斥始終是重大問題。ES細胞的其他潛在用途包括早期人發育的探索、遺傳疾病的研究、毒物學測試和藥物篩選的體外系統。
[0006]用于培養ES細胞的過程是非常繁重的。通過將內細胞團轉移到塑料實驗室培養皿內分離人ES細胞。培養皿的內表面一般由飼養層:小鼠胚胎皮膚細胞包被，所述小鼠胚胎皮膚細胞已如此處理，使得它們將不分裂，而是提供ES細胞與之附著的粘性表面。飼養細胞還將營養素釋放到培養基內。研究者已設計出無需小鼠飼養細胞生長胚胎干細胞的方法。這是顯著的科學進展，由于小鼠細胞中的病毒或其他大分子可能傳遞給人細胞的危險。
[0007]關于ES細胞擴增的過程也是非常耗時的。ES細胞形成菌落。通常，ES細胞擴增首先是選擇個別ES細胞集落，并且隨后擴增所選集落。這顯著減慢ES細胞擴增，并且如果所選集落含有基因突變，則可以引起更高的突變率。
[0008]在2006年,Shinya Yamanaka及同事顯示使用逆轉錄病毒將四種轉錄基因:0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc引入小鼠成纖維細胞內，可以生成展示多能性的經誘導的多能干細胞(iPS細胞)。這是革命性發現，因為首次顯示體細胞可以再編程回到ES樣細胞。iPS細胞被認為在許多方面等同于天然ES細胞，例如特定干細胞基因和蛋白質的表達、染色質甲基化模式、倍增時間、擬胚體形成、畸胎瘤形成、有活力的嵌合體形成、無限的自我更新性質和可辨性。然而，它們與天然多能干細胞的關系的完全程度仍有待評價。
[0009]認為iPS細胞技術是更少倫理爭論的，因為這種技術允許無需人胚胎而生成多能干細胞。這種技術還可以允許生成患者特定ES細胞系，其可以潛在用于細胞替代治療以治療多種人疾病，且允許由具有多種遺傳疾病的患者生成ES細胞系，并且將提供研究這些疾病和用于藥物篩選的無價模型。
[0010]在2007年，幾個團體顯示經由四基因逆轉錄病毒遞送由小鼠成纖維細胞生成的iPS細胞產生有活力的嵌合體。這些團體使用Nanog用于檢測iPS細胞，指示Nanog是細胞多能性的主要決定子。然而，c-Myc是致癌的，并且20%的嵌合小鼠發展癌癥。在后期研究中，Yamanaka報道iPSC可無需c_Myc而生成。該過程花費很多時間并且不夠有效，但所得到的嵌合體不發展癌癥。
[0011]同樣在2007年，由人體細胞生成iPS細胞，代表用于iPS細胞技術的里程碑。然而，使用的病毒轉染系統將基因插入宿主基因組中的隨機位置上，并且產生關于這些iPSC的潛在治療應用的主要關注，因為產生的細胞可能易于形成腫瘤。為了克服這些危險，腺病毒用于將必要的四種基因轉運到小鼠皮膚和肝細胞的基因組內，導致與胚胎干細胞等同的細胞。因為腺病毒不與靶向的宿主組合任何其自身基因，所以消除產生腫瘤的危險，盡管這種方法仍未對人細胞進行測試。Yamanaka及幾個其他實驗室自那以后已證實重編程可以經由質粒完成，完全無需任何病毒轉染系統，盡管效率極低。
[0012]在2009年5月，通過Ding和Kim的實驗室的兩個報告報道小鼠和人iPS細胞(PiPSC)通過四種蛋白質的直接遞送生成，所述四種蛋白質由四種重編程基因編碼，從而消除關于病毒的需要或人體細胞的遺傳修飾。近期報告進一步顯示iPSC可以使用mRNA生成mRNA誘導的iPS細胞(riPSC)。這解決了與個人化的基于干細胞的醫學有關的最有挑戰的安全障礙，并且允許科學家制備PiPS細胞而無需遺傳改變它們。因為蛋白質的確最終降解，所以到它們用于實驗或治療時應不存在其在細胞中存在的痕跡，代表iPS細胞技術中的重大突破。
[0013]盡管全世界密集的研究努力，目前的iPS細胞技術仍具有四個重大問題:1.低效；
2.耗時；3.復雜和昂貴；和4.質量問題。
[0014]目前的iPS細胞技術僅將0.001-1%體細胞轉換成iPS細胞。對于使用病毒載體的基因遞送，取決于不同起始體細胞，從體細胞到iPS細胞的轉換效率可以達到0.1-1%。使用胚胎成纖維細胞作為起始細胞，轉換效率達到~1% ;然而，使用成體體細胞，轉換效率〈0.1%。對于使用非病毒方法的基因遞送，這個轉換效率〈0.1%。關于人蛋白質誘導的iPS細胞的轉換效率極低，僅達到0.001%。
[0015]另外，目前的iPS細胞技術包括基因遞送和蛋白質遞送，通常花費4-8周以完成人體細胞成為iPS細胞的重編程，并且需要多個循環的基因轉染或蛋白質遞送。這使得目前的iPS細胞技術成為復雜和昂貴的技術。此外，由目前的iPS細胞技術生成的iPS細胞的質量在類似人ES細胞方面是有問題的。這些重大技術問題阻斷iPS細胞進行其人臨床應用。
[0016]引起目前的iPS細胞技術的這些重大問題的主要原因是由于基因遞送的和蛋白質遞送的技術挑戰，這具有低效率和對于多重基因/蛋白質遞送難以控制遞送基因的化學計量學的缺點。對于iPS細胞生成，必須將四種基因或四種蛋白質同時遞送到體細胞的核內，以打開起始“干細胞基因表達”且沉默“體細胞基因表達”的細胞內自動調節回路，從而體細胞可以轉變成胚胎干樣細胞。
[0017]通常已知目前的基因遞送技術包括病毒載體和非病毒方法具有用于同時四種基因遞送的低效率問題。此外，不能保證所有四種基因都以相等化學計量學遞送到細胞內。在大多數情況下，取決于使用的不同遞送媒介物，四基因遞送是隨機的。為了解決這個問題，已開發了將所有四種基因都插入一個病毒載體內的備選方法，在每種基因之間具有不同接頭。在這種情況下，僅需要一個病毒載體以被遞送到體細胞內用于iPS細胞生成，增強遞送效率。然而，即使使用這種方法，最大的iPS細胞轉換效率對于成體體細胞僅實現~1%，并且對于胚胎體細胞可以達到〈5%。
[0018]除了基因遞送的低效率外，這種方法還具有另一個問題:耗時。一旦重編程基因已遞送，它們就隨機運輸到細胞內，并且僅小部分的基因可以達到核。然而，僅具有位于核內的遞送基因的那些體細胞可以重編程，以生成iPS細胞。這進一步顯著降低iPS細胞轉換效率。為了解決這個問題，已執行反復的基因轉染，以增強遞送基因的核摻入的隨機概率，這是耗時的。遞送基因開始表達花費7-14天，并且觀察到非iPS細胞集落形成花費~30天。為了完成重編程，通常花費4-8周以由人成體體細胞生成iPS細胞。
[0019]對于蛋白質誘導的細胞重編程，必須將蛋白質遞送到成纖維細胞的核內。Ding和Kim的實驗室都通過將細胞穿透肽(CPP，9R-11R)加入C末端內來改造重編程蛋白質。盡管CPP融合法將重編程蛋白質遞送到細胞內，但的確存在基于CPP的蛋白質遞送的幾個重大缺點:
[0020](I)CPP融合物具有改變重編程蛋白質的性質/功能的高危險。
[0021 ] (2) CPP具有低蛋白質遞送效率。
`[0022](3) CPP遞送的蛋白質對細胞內蛋白酶是敏感的，因為CPP是基于肽的，引起遞送蛋白質的降解。
[0023](4) CPP不具有對核的靶向能力用于蛋白質起始重編程。
[0024]一旦蛋白質在細胞溶質內，如果它們未正確折疊，細胞內蛋白酶就首先設法降解它們。對于經受住細胞內蛋白酶降解的那些蛋白質，它們將隨機撞擊不同細胞內區室，并且僅極小部分的蛋白質可以達到核，以起始蛋白質誘導的重編程。為了增強重編程蛋白質的核定位概率，Ding和Kim的實驗室都采用蛋白質遞送的反復循環(7_10個循環)。
[0025]這些重大缺點引起體細胞轉換成iPS細胞的極低效率(〈0.005%)。此外，蛋白質起始的成纖維細胞成為iPS細胞的重編程花費很長時間。在Ding的論文中，觀察到來自小鼠胚胎成纖維細胞的iPS細胞集落形成花費5周，這與人成體成纖維細胞相比較重編程為iPS細胞容易得多。當人新生兒成纖維細胞由Kim等人用于生成iPS細胞時，觀察到iPS細胞集落花費8周。
[0026]如上文討論的，遞送效率的缺乏、核靶向的缺乏/細胞內運輸的隨機性質以及目前基因和蛋白質遞送技術的長過程使得非常難以控制生成iPS細胞的質量。這通過幾個近期報告證實，指示新近生成的iPS細胞展示與人ES細胞的那些不同模式的基因表達。然而，在50-60次傳代后，iPS細胞展示與人ES細胞非常相似的基因表達模式。基于這個結果，連續重編程概念已在iPS細胞的連續傳代過程中提出。不幸的是，還觀察到在以后傳代(50-60次傳代)時，iPS細胞展示與起始體細胞相比較的重大染色體變化，使得不能使用這些iPS細胞用于人臨床應用。
[0027]因此，開發iPS細胞技術將是有利的，所述iPS細胞技術可以在數天內以接近100%的轉換效率由人成體體細胞生成高品質iPS細胞。
[0028]發明概述
[0029]根據本發明提供了 piPSC技術，其可以使用細菌表達的重組重編程蛋白質直接由不同起始體細胞生成高品質PiPS細胞。
[0030]本發明提供了利用QQ-蛋白質遞送技術的piPSC技術，其允許重編程蛋白質在遞送后第一小時內直接進入人體細胞的核內的靶向遞送。這在12小時內開始體細胞的細胞重編程，并且在一周內完成細胞重編程以生成PiPS細胞。
[0031]本發明提供了以接近100%的轉換效率由成體成纖維細胞及其他體細胞生成小鼠、大鼠和人PiPS細胞的piPSC程序。
[0032]本發明提供了由許多不同的體細胞生成高品質iPS細胞的程序，所述體細胞包括小鼠原代成纖維細胞、成體小鼠成纖維細胞、人新生兒成纖維細胞、人原代成體成纖維細胞、人成體角化細胞和人羊水。
[0033]本發明還提供了由不同的患病體細胞生成高品質iPS細胞的程序，所述患病體細胞包括大鼠腫瘤細胞例如9L-神經膠質瘤細胞、小鼠轉移性乳腺癌細胞例如4T1-細胞、人乳腺癌細胞系例如MDA-MB-231、人腦瘤細胞系例如U87和U251-神經膠質瘤細胞、人原代4期GBM細胞、具有apoE3或apoE4同種型的來自阿爾茨海默患者的人原代成纖維細胞。
[0034]本發明提供了簡單且僅涉及體細胞與重編程蛋白質的一步溫育的piPSC技術，所述重編程蛋白質為四種重編程蛋白質(0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc)、或三種重編程蛋白質(0ct4/Sox2/Klf4)、或兩種重編程蛋 白質(0ct4/Sox2)、或僅一種重編程蛋白質(0ct4)。
[0035]本發明還使用其他重編程蛋白質組合例如Sox2、0ct4和Nanog (SON)，加上常規Yamanaka的四種轉錄因子(0ct4/Sox2/Klf4/c_Myc),以在I周內以接近100%的效率生成piPSC。因為Klf4和c-Myc是致癌蛋白質，并且SON因子是關于多能性的主要調節物，所以使用SON因子的細胞重編程可以顯著減少突變率，并且顯著增強生成的PiPSC的質量，所述PiPSC對于人臨床應用是安全的。
[0036]本發明描述了無飼養者piPSC培養條件，其集中于單層piPSC培養物用于piPSC的長期自我更新。這種無飼養者PiPSC培養條件避免小鼠飼養層，并且解決所生成的piPSC的可能交叉物種污染的重大安全關注，用于未來安全的人臨床應用。
[0037]本發明描述了單層全皿傳代法，其消除常規iPS細胞生成和擴增的集落選擇和克隆擴增，顯著增強生成的PiPS細胞的質量且加速piPS細胞擴增。
[0038]本發明的這些及其他目的、優點和特點通過參考目前實施方案和附圖的描述將得到更全面理解和了解。
[0039]附圖簡述
[0040]本發明的其他優點通過參考下述詳述將更容易了解，如下述詳述當與附圖結合考慮時變得更好理解一樣，在所述附圖中:
[0041]圖1是描述本發明的方案的流程圖，顯示這種piPSC技術的每個步驟的概要。圖1還給出在細胞重編程中使用的四種重編程蛋白質的濃度。圖1進一步描述細胞重編程循環。[0042]圖2，A:顯示用于產生四種重編程蛋白質的細菌表達方法，包括常規IPTG誘導法和高細胞密度IPTG誘導法。這些方法包括在細菌表達中使用的關鍵步驟和參數。右上圖是在細菌表達中使用的培養基的最佳化配方的表格。B:顯示用于0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的純化重編程蛋白質的SDS-PAGE和蛋白質印跡。四種重編程蛋白質的細菌表達得率是80-120mg/ 升。
[0043]圖3:在重編程蛋白質包括0ct4、Sox2、Klf4和c_Myc QQ-遞送1.5小時后，人新生兒成纖維細胞的免疫染色的熒光圖像，顯示遞送蛋白質的核定位。實驗條件顯示于上圖中。因為在蛋白質遞送過程中對于成纖維細胞獲得熒光圖像，所以重編程蛋白質可以在細胞的細胞溶質和核中觀察到。
[0044]圖4:使用針對幾種多能性標記的抗體的免疫染色的時程實驗。使HNF與QQ-修飾的四種因子一起溫育12小時，并且隨后轉到常規培養基另外108小時。在24、48、72和108小時，制備單層細胞用于免疫染色。在核和細胞溶質位置中在24小時用0ct4染色的細胞內觀察到熒光信號。然而，細胞溶質0ct4在48小時顯著減少，并且在72小時僅在核中觀察到且具有減少的熒光強度。在108小時，核染色再次顯著增強。這個數據首次表明在72小時控制在核內的內源0ct4基因表達和QQ-遞送的內源0ct4降解的轉變。在108小時恒定的內源0ct4表達指示通過四種重編程蛋白質誘導的細胞重編程的維持，這通過其他多能性標記包括ALP、Nan0g、Rexl和Tra_160的免疫染色加以證實。明確的是，這些多能性標記的熒光信號在24小時觀察到，并且在以后時間點變得強得多，指示這些多能性基因的內源表達在24小時開始，并且在以后時間點良好維持。Rexl和TRA1-60的強熒光染色指示晚期多能性標記的內源蛋白質表達，表明蛋白質誘導的細胞重編程可能在4-5天內完成。這個結果通過在6-8天時的大量集落形成的觀察加以證實(插圖)。
[0045]圖5:A:在用四 種蛋白質重編程后TK天的piPSC集落的顯微圖像，顯不在無詞養者培養基中的這個小視區中的許多piPSC集落。一般而言，在一個細胞培養皿中觀察到500-1500個piPSC集落。B:—個piPSC集落的放大視圖，顯示清晰邊緣。C-F:使用ALP作為早期多能性標記的重編程程序的最佳化。C:將人新生兒成纖維細胞(HNF)不含重編程蛋白質培養24小時，充當陰性對照。這個小圖僅顯示通過DAPI染色的HNF核，不含ALP染色。D:使HNF與四種重編程蛋白質一起培養3小時，并且隨后轉到不含重編程蛋白質的培養基。E:使HNF與四種重編程蛋白質一起培養5小時，并且隨后轉到不含重編程蛋白質的培養基。F:使HNF與以較低蛋白質濃度(0.5 μ g/ml)的四種重編程蛋白質一起培養24小時。將樣品用ALP試劑盒處理用于酶促反應，并且以紅色熒光染色用于ALP蛋白質表達。小圖C-F指示可以最佳化重編程條件，用于來自HNF的piPS細胞的最佳轉換效率。僅~30%的細胞顯示在D中的強ALP染色，而剩余細胞顯示無ALP染色或弱ALP染色。當執行5小時蛋白質重編程時，明顯更多的細胞(60%)顯示強ALP染色，盡管仍觀察到具有弱ALP染色和無ALP染色的細胞(40%)。實驗條件通過使HNF與更低濃度的四種重編程蛋白質一起溫育24小時進行最佳化(F)。基本上每一個細胞在這種條件下都是ALP陽性的，表明每一個單細胞的細胞重編程得到起始，并且在這種單循環重編程條件下能夠生成PiPS細胞。
[0046]圖6:A，在#33重編程的第一次傳代時的piPSC集落的皿(左)和加框區域的放大視圖，顯示紅色PiPSC集落。集落用ALP (紅色)染色。B，如每個小圖中標記的，使用不同多能性標記的單一免疫染色(左圖)和雙重免疫染色(右)的單層PiPSC的熒光圖像。對于雙重染色，我們僅考慮當表面和核標記都是陽性時的陽性染色的細胞。對于僅核或表面標記是陽性染色的那些細胞，我們將它們視為陰性的。還執行且展示使用起始HNF的免疫染色的陰性對照。ALP和SSEA4是表面標記,而Oct4、Sox2、Nanog和Rexl是核標記。C,顯示基于六種單一染色(左)和三種雙重染色(右)的PiPSC技術的轉換效率的條形圖。通過手動計數超過300個細胞的陽性和陰性染色，計算轉換效率。在每個條上方，上面的紅色數字是轉換效率，并且下面的藍色數字是計數用的計算相應轉換效率的細胞數目。
[0047]圖7:對30%piPSC (第4次傳代)和70%HNF的細胞混合物，使用六種多能性標記(如標記的)用于免疫染色的內部對照實驗的熒光圖像，顯示陽性染色細胞的預期稀釋度。右下:具有單層細胞的兩個集落的熒光圖像，顯示集落和單層細胞對于ALP和SSEA4都是陽性染色的。
[0048]圖8:使用單集落傳代法所生成的piPS細胞的多能性的表征。簡言之，在細胞重編程完成后，選擇具有清晰邊緣的單個集落(A)，并且使用無飼養者條件再傳代三代。注意到這個單個集落在傳代后幾天開始喪失清晰邊緣，并且該細胞在細胞增殖過程中從集落中排除。一旦細胞達到匯合，就將細胞移出且傳代到新皿內，在第二天形成許多邊緣清晰的集落。然而，細胞在其增殖過程中重復上述過程。這些是從集落中排除的觀察到的細胞(綠色箭頭)，而其他集落維持清晰邊緣(白色箭頭)(B)。使用相同多能性標記，例如對于0ct4和Nanog，對邊緣清晰的集落(Cl和C3)和從集落中排除的單層細胞(C2和C4)執行免疫染色。顯而易見的是兩類細胞都是陽性的，表明它們是PiPSC樣細胞。我們還不挑選任何集落而傳代全皿細胞共三代。我們隨后比較這兩個單集落傳代的細胞與全皿單層細胞傳代，并且在使用六種多能干細胞標記的免疫染色中未觀察到差異。
[0049]圖9:使用ALP、0ct4、Nanog、SSEA4、Tral_60和Rexl，在我們的無飼養者培養條件下，#19重編程(6.5個月，使用全皿單層細胞傳代法)的第30次傳代的piPSC集落免疫染色的熒光圖像。用DAPI標記核。
[0050]圖10:在我們的無飼養者piPSC培養條件下，使用全皿傳代法，來自第6次傳代時(50天)的第19次細胞重編程的piPSC集落免疫染色的熒光圖像。簡言之，通過移出全皿中的細胞并且傳代到兩個皿內，將全皿傳代，而無需挑選單個集落。傳代的皿第二天形成數百個集落。在第6次傳代時，使用免疫染色表征這些piPS細胞，包括piPSC集落和單層細胞。使用六種多能性標記，包括ALP (早期標記)，0ct4、Nanog、SSEA4 (中期標記)，Rexl和Tral-60 (晚期標記)。陰性對照使用HNF用SSEA4抗體顯示。HNF僅顯示單個細胞而無集落形成。該圖顯示所生成的PiPSC集落對于所有六種多能性標記都染色陽性，表明所生成的PiPSC集落是多能干細胞。
[0051]圖11:使用全皿單層細胞傳代法擴增的piPS細胞的表征。A:右:與起始HNF的那些相比較，在傳代I和傳代5時，對于iPS細胞中的基因表達的TagMan? stem Cell
Pluripotency Arrays熱圖(log2)。單個TaqMan?實時RT-PCR進一步用于證實陣列
數據。左:評價在I和5次傳代時的piPSC和HNF細胞中的0ct4、Sox2和Nanog基因表達的qRT-PCR的條形圖。相 對基因表達代表相對于HNF細胞那種的倍數變化(log2)。B:對于HNF (第17次傳代)和piPSC (第10次傳代)執行SKY染色體分析，顯示在所生成的piPS細胞和親本HNF細胞之間相同的核型。C:關鍵多能蛋白質的蛋白質印跡結果，包括piPSC(第5次傳代)和起始HNF (右)的三種主要調節物(0ct4、Sox2和Nanog)和一種晚期多能性標記(Rexl)。看家蛋白質(肌動蛋白)顯示等量piPSC和HNF細胞用于這些蛋白質印跡。D:PiPSC (~85%，第#33次重編程，第2次傳代)和NHF (~15%)的Nanog基因的脫甲基化。
[0052]圖12:使用全皿傳代法擴增的piPS細胞的分化能力。上:piPSC的體外自發分化。免疫染色圖像顯示在第14天時的所有三個胚層，包括神經(A，巢蛋白，外胚層)、肌肉和內皮樣(B，結蛋白，中胚層)和內胚層樣細胞(C，AFP,內胚層)。下:A:piPSC至神經譜系的體外特異性分化的熒光圖像。A，神經元(Tujl+，白色箭頭)。B，I型星形細胞(GFAP+)。C，II型星形細胞(GFPA+)。D，少突膠質細胞(01+)。F，神經干細胞(Sox2+)。G，神經干細胞(巢蛋白+)。在所有小圖中都觀察到顯著細胞形態差異。然而，在下圖中的A、B、C、D中的細胞展示典型的神經元/星形膠質細胞/少突膠質細胞形態，并且在F、G中的細胞展示典型的神經干細胞形態，證實免疫染色不是假陽性的。
[0053]圖13:A:畸胎瘤形成(I)。全皿傳代法用于生成足夠的piPSC用于畸胎瘤形成。在第3次傳代(25天)時，將piPSC懸浮于含有10%FBS的DMEM中。將SCID(NxGen Biosciences)小鼠用二乙醚麻醉，并且將細胞懸液注射到腎囊和肌肉下。腫瘤在第四周時明確可見(A)，并且在第六周時手術解剖。PiPSC注射的腎與不含注射的腎相比較(B)，明確顯示piPSC注射的腎的擴大。C:用于使用全皿傳代法的畸胎瘤形成的piPS集落和單層細胞的免疫染色的熒光圖像。還顯示了使用起始HNF使用SSEA4的相同免疫染色的陰性對照(右)。使piPSC集落分解成單層細胞，并且隨后執行免疫染色。結果指示基本上每一個細胞對于所有六種多能性標記都展示陽性染色，表明使用全皿傳代法的高轉換效率。僅將200，000個piPS細胞移植到裸鼠的腎囊內。
[0054]圖14:A:畸胎瘤形成(2)。在第六周時，將動物手術解剖。將腎組織樣品在含有4%甲醛的PBS中固定，并且在石蠟中包埋。將切片用蘇木精和伊紅(eosin)(H&E)染色。對于衍生自PiPS細胞的畸胎瘤形成執行H&E染色。在細胞移植到SCID小鼠的腎囊下之后，畸胎瘤由單個注射部位良好發展。所得到的畸胎瘤含有代表外胚層、中胚層和內胚層分化的多種組織。組織載玻片的組織`學數據指示這些畸胎瘤含有來自所有三個主要胚層的組織，包括神經組織和表皮組織(外胚層)、橫紋肌和軟骨(中胚層)、和腸樣上皮組織(內胚層)，證實使用全皿傳代生成的PiPS細胞在體內顯示出多能性。
[0055]圖15:衍生單個患者的piPS細胞可以用于生成用于該患者的疾病模型。簡言之，原代皮膚成纖維細胞可以經由皮膚活組織檢查得自患者，并且這些成纖維細胞可以通過四種重編程蛋白質的遞送用于生成PiPS細胞。所生成的PiPS細胞可以擴增或導致成體干細胞的特異性譜系，其可以進一步分化成患病組織。因此，這些細胞可以用于生成疾病模型，因為它們由具有特定疾病的單個患者生成。因此，可以在關于這個個體患者的皿中研究這種特定疾病。
[0056]圖16:piPS細胞可以用于藥物篩選和藥物毒性測試，如該圖中舉例說明的。對于具有遺傳疾病的那些患者，可能必須采取包括通過同源重組的遺傳修復的額外步驟。
[0057]圖17:piPS細胞可以用于基于患者的干細胞療法。簡言之，原代皮膚成纖維細胞可以得自患者，并且這些成纖維細胞可以通過四種重編程蛋白質的遞送用于生成PiPS細胞。所生成的piPS細胞可以擴增或導致成體干細胞的特異性譜系。這些piPS細胞和成體干細胞可以移植到個別患者內，以治療特定疾病，對于具有遺傳疾病的那些患者，可能必須采取包括在患者移植前通過同源重組的遺傳修復的額外步驟。
[0058]發明詳述
[0059]本發明提供了蛋白質誘導的多能干細胞(piPSC)技術。本發明提供了這種PiPSC技術的用途，所述PiPSC技術可以使用細菌表達的重組重編程蛋白質直接由不同起始體細胞生成高品質iPS細胞。
[0060]本發明的PiPSC技術是簡單的且僅涉及體細胞與重編程蛋白質的一步溫育。重編程蛋白質可以是本領域技術人員已知能夠執行所述功能的任何蛋白質。此類蛋白質的例子包括但不限于四種重編程蛋白質(0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc)、或三種重編程蛋白質(0ct4/Sox2/Klf4)、或兩種重編程蛋白質(0ct4/Sox2)、或僅一種重編程蛋白質(0ct4)。
[0061]本發明的piPSC技術還使用其他重編程蛋白質組合例如Sox2、0ct4和Nanog(SON),或 Nanog/0ct4,或僅 Nanog,加上常規 Yamanaka 的四種轉錄因子(0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc),以生成piPSC。因為Klf4和c-Myc是致癌蛋白質，并且SON因子是關于多能性的主要調節物，所以使用SON因子的細胞重編程可以減少突變率，并且顯著增強生成的piPSC的質量，所述PiPSC對于人臨床應用是安全的。
[0062]本發明的piPSC技術利用QQ-蛋白質遞送技術，其允許重編程蛋白質在遞送后前一小時內直接進入人體細胞的核內的靶向遞送。這在12小時內開始體細胞的細胞重編程，并且在一周內完成細胞重編程以生成PiPS細胞。另外，該程序以接近100%的轉換效率由成體成纖維細胞及其他體細胞生成小鼠、大鼠和人piPS細胞。
[0063]piPSC技術提供了通用程序,其不僅可以使用Yamanaka的因子或SON因子用于有效生成蛋白質誘導的多能干細胞，還可以廣泛用于使用不同組的重編程蛋白質由成體體細胞生成成體干細胞，例如神經干細胞、上皮干細胞、皮膚干細胞、間充質干細胞和造血干細胞，以及轉分化以直接生成心肌細胞、神經元、棕色脂肪細胞、胰島素分泌細胞及其他類型的終末分化的細胞。
[0064]piPSC技術可以用于由許多不同的體細胞生成高品質iPS細胞，所述體細胞包括但不限于:健康動物的小鼠原代成纖維細胞、成體小鼠成纖維細胞、人新生兒成纖維細胞、人原代成體成纖維細胞、人成體角化細胞和人羊水。高品質iPS細胞還可以由不同的患病體細胞生成，所述患病體細胞包括但不限于:大鼠腫瘤細胞例如9L-神經膠質瘤細胞、小鼠轉移性乳腺癌細胞例如4T1-細胞、人乳腺癌細胞系例如MDA-MB-231、人腦瘤細胞系例如U87和U251-神經膠質瘤細胞、人原代4期GBM細胞、具有apoE3和apoE4同種型的來自阿爾茨海默患者的人原代成纖維細胞。
[0065]本發明描述了無飼養者piPSC培養條件，其集中于單層piPSC培養物用于piPSC的長期自我更新。這種無飼養者PiPSC培養條件避免小鼠飼養層，并且解決所生成的piPSC的可能交叉物種污染的重大安全關注之一，用于未來安全的人臨床應用。
[0066]本發明描述了用于piPSC的長期自我更新和擴增的新piPSC傳代法:全皿傳代，因為這種PiPSC技術的轉換效率達到接近100%。這種新PiPSC傳代法集中于單層PiPSC的傳代和擴增，并且它是簡單和快速的。它還避免了在細胞重編程過程中的集落選擇、集落挑選和克隆擴增，可以顯著減少突變率，并且顯著增強生成的PiPSC的質量，所述piPSC對于人臨床應用是安全的 。
[0067]本發明可以用于生產大量細菌表達的重組重編程蛋白質，包括但不限于:0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog、BMP4 及其他重編程蛋白質。
[0068]更具體而言，本發明基于QQ-蛋白質轉導技術和體內重折疊技術，如通過引用并入本文的共同未決的美國專利申請12/128,320中公開的。QQ試劑具有將多種蛋白質以接近毫摩爾濃度同時或連續遞送到細胞內的能力，和將蛋白質靶向遞送到正確的細胞內區室內的能力，另外，QQ-試劑保護蛋白質不受細胞內的蛋白酶。遞送的蛋白質正確重折疊且通過細胞內機制翻譯后修飾，并且遵循與其內源對等物相同的細胞內運輸和分泌途徑。因此，QQ-蛋白質轉導是生理學相關的蛋白質轉導技術。
[0069]本發明通過QQ-試劑配方的最佳化,使QQ-蛋白質遞送延伸至piPS細胞技術。新配方有效將重編程蛋白質遞送到起始體細胞的核內。相應地，用新配方修飾的靶蛋白質的量可以通過改變QQ-組成進行調整，以對于用于細胞重編程的特定重編程蛋白質獲得進入不同體細胞內的最佳遞送效率。
[0070]本發明還提供了細胞重編程可以在QQ-蛋白質遞送后數小時內起始，因此多能性基因在這個時間段過程中開始被內源的直接實驗證據。另外，本發明還提供了細胞重編程可以在QQ-蛋白質遞送后I周內完成，因此完成的重編程標記的基因在這個時間段過程中開始內源表達的另外實驗證據。
[0071]本發明的方法和產物是最佳化重編程蛋白質的組成和濃度的有效和可行方法，用于最佳化使用QQ-蛋白質遞送所生成iPS細胞的質量。
[0072]另一個利益是此處呈現的PiPSC技術使用重編程蛋白質生成組織特異性PiPS細胞，而無需親本細胞的遺傳操作。此外，這種PiPSC技術使用“SON”蛋白質(主要ESC調節物)用于細胞重編程，并且去除致癌的KLF4和c-MYC蛋白質，解決用于可能的個人化疾病療法的未來人臨床應用的重大安全障礙。
[0073]piPSC技術可以用于人臨床應用中，包括再生醫學和細胞替代療法，來自具有遺傳病癥的個別患者的iPS細胞庫的生成，基于來自個別患者的piPS細胞的疾病模型和不同藥物的功效測試，所述不同藥物包括小 分子藥物、蛋白質藥物、DNA藥物、RNA藥物、碳水化合物藥物和基于脂質的藥物。
[0074]本發明描述了這種piPSC技術在人臨床應用中的應用，以治療不同人疾病，包括但不限于癌癥、心臟病、中風、糖尿病、肥胖、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化、心肌梗塞、肌營養不良、CMT-1A、脊髓損傷、外傷性腦損傷、學習缺陷、缺牙、傷口愈合、骨髓移植、骨關節炎、類風濕性關節炎、脫發、失明、耳聾、克羅恩氏病和遺傳疾病及其他相似疾病。
[0075]最重要的是，已實現大于85±4%的轉換效率。所生成的piPSC展示人胚胎干細胞(hESC)的特征，并且可以在無飼養者條件下穩定且同質擴增6個月。這些piPSC還具有在體外和體內分化成三個胚層的潛力。
[0076]這種piPSC技術的此類效率基于現有技術QQ-蛋白質遞送技術。QQ-試劑保護遞送的蛋白質不受通過細胞內蛋白酶的降解，并且具有基于由遞送的蛋白質攜帶的信號序列對特異性細胞內區室的靶向能力。QQ-遞送應用于蛋白質誘導的HNF細胞重編程，這在I周內以大于85 ±4%的轉換效率生成piPSC。此類高轉換效率允許消除在細胞重編程過程中的集落選擇和用于維持純PiPSC群體的克隆擴增，從而急劇加速piPSC生成和擴增的整個程序。使用無飼養者條件開發單層PiPSC傳代方法用于擴增所生成的piPSC。這種piPSC技術還可以通過減少在常規集落挑選和克隆擴增過程中的突變率，顯著增強用于安全人臨床應用的PiPSC的質量。
[0077]本發明的piPSC技術包括極高效率的細菌表達方法和用于細菌表達的培養基的配方，所述細菌表達方法可以用于以極高得率(80-120mg/升)產生純重編程蛋白質。這顯著減少這種PiPSC技術的成本。
[0078]本發明的piPSC技術利用體內蛋白質重折疊技術，其使用QQ-蛋白質遞送技術將細菌表達的重編程蛋白質直接遞送到體細胞內，用于通過哺乳動物細胞折疊機制的重折疊。因此，這種piPSC技術省略復雜和低效的細菌表達的重編程蛋白質的體外蛋白質重折疊步驟，因此使得這種piPSC技術成為更簡單和廉價的技術。
[0079]本發明的piPSC技術利用QQ-蛋白質遞送技術，以將重編程蛋白質直接遞送到體細胞的核內，以開始且維持細胞重編程。已顯示這種PiPSC技術可以在QQ-蛋白質遞送后1.5小時內將重編程蛋白質特異性遞送到基本上每一個單個體細胞的核內。
[0080]本發明的piPSC技術還可以在蛋白質遞送后的前24小時內開始細胞重編程，并且細胞重編程可以在5天內完成以生成piPS細胞，其首次證實細胞重編程不是隨機過程，而是確定和可重復的使用QQ-蛋白質遞送技術由體細胞生成PiPS細胞的過程。
[0081]本發明的piPSC技術包括無飼養者的細胞培養條件，以傳代所生成的piPSC。本文描述的是這種無飼養者條件的詳細程序，并且還報道在形狀和形態中的潛在集落變化。使用這種無飼養者條件，所生成的PiPS細胞的超過30次傳代已成功地經過超過6個月。
[0082]本發明的piPSC技術描述了顯著不同于常規傳代法的傳代法，所述常規傳代法挑選單個集落用于傳代。因為這種PiPSC技術將接近100%體細胞轉換成piPS細胞，所以開發了將全皿的細胞傳遞到新皿內用于傳代的全皿傳代法。這允許避免集落挑選和克隆擴增，并且可以顯著減少所生成的P`iPS細胞的突變率。這解決了生成足夠piPS細胞用于應用的重大問題，并且可以顯著增強用于安全人臨床應用的PiPS細胞的質量。
[0083]本發明的piPSC技術表明用于開發用于個體患者的疾病模型的程序。這是允許在皿中研究人疾病的這種PiPSC技術的重要應用。
[0084]本發明的piPSC技術表明用于個體患者的藥物篩選和藥物毒性測試的程序。這是這種piPSC技術的另一個重要應用，其潛在允許在個別患者基礎上在皿中開發新藥物。
[0085]本發明的piPSC技術表明基于患者的干細胞療法以治療人疾病，包括但不限于阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、中風、學習缺陷、外傷性腦損傷、傷口愈合、脊髓損傷、骨關節炎、類風濕性關節炎、克羅恩氏病、多部位癌癥、糖尿病、肌營養不良、心肌梗塞、肌萎縮側索硬化、脫發、失明和耳聾。這是這種PiPSC技術的最重要應用，其潛在允許我們在個體患者的基礎上治療多種人疾病。
[0086]開發三種技術以解決先前可用或目前的iPSC技術的最具挑戰性的問題。這些技術包括有效的細菌表達系統，允許克/升數量的純重組蛋白質生產；使用哺乳動物細胞的細胞內折置機制有效重折置細菌表達的蛋白質的體內蛋白質重折置技術；和對特異性細胞內細胞器包括核具有靶向能力的QQ-蛋白質轉導技術。
[0087]使用第一種技術，以80_120mg/ —升表達的得率制備了細菌表達的0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc蛋白質，其通過蛋白質印跡加以證實。這使得重組重編程蛋白質便宜得多且是能承受的。第二種技術-體內蛋白質重折疊技術允許省略由Ding等人采用的體外重折疊步驟，其是低效、昂貴和復雜的。一般地，這種方法使用QQ-蛋白質遞送技術將細菌表達的蛋白質遞送到哺乳動物細胞內。細胞內折置機制可以有效重折置細菌表達的蛋白質。
[0088]第三種技術是先進的QQ-蛋白質遞送技術，其具有幾個特點，確保這種蛋白質遞送技術的生理學關聯性:
[0089](I) QQ-試劑與蛋白質非共價結合，并且不將標簽加入遞送的蛋白質中。
[0090](2) QQ-試劑掩蔽/保護遞送的蛋白質不受細胞內蛋白酶(高代謝穩定性)。
[0091](3)基于由遞送的蛋白質攜帶的序列定位信號，QQ-試劑將蛋白質特異性遞送到其靶區室(靶向能力)。
[0092](4) QQ-試劑具有高效率的蛋白質遞送，最高達毫摩爾(mM)細胞內濃度。
[0093]QQ-試劑是基于聚乙烯亞胺(PEI)的混合物(cocktail),具有其他關鍵成分，例如脂質和增強子。它們可以配制用于特定應用。QQ-試劑與遞送蛋白質非共價結合，這在遞送蛋白質的表面上包被QQ-試劑層。這旌蔽蛋白質不受細胞內蛋白酶降解。一旦在細胞內，QQ-試劑OOES就與遞送的蛋白質逐漸經直。QQ-試劑的這些獨特特點使得遞送的蛋白質與其在細胞內的內源對等物無法區分。一旦遞送的蛋白質達到其靶向區室，細胞的機制就表現得如同它們是內源對等物一樣。證實QQ-遞送的蛋白質在細胞內正確折疊且翻譯后修飾，并且它們遵循與其內源對等物相同的細胞內運輸和分泌途徑。
[0094]通過引用并入本文的QQ-蛋白質遞送技術和體內蛋白質重折疊技術的專利申請已于2008年5月28日提交。這三種先進技術解決了目前的iPSC技術的重大問題。這允許開發PiPSC技術，用于使用重編程蛋白質在I周內以接近100%的轉換效率由許多不同體細胞生成高品質iPS細胞 。此外，iPSC技術是簡單和能承受的技術。
[0095]更具體而言，使用現有技術QQ-蛋白質遞送技術，將細菌表達的重組重編程蛋白質直接遞送到基本上每一個起始人新生兒成纖維細胞(HNF)的核內。重組重編程蛋白質通過細胞內折疊機制正確重折疊，并且在蛋白質遞送后24小時開始細胞重編程。這種細胞重編程得到良好維持，并且可以在I周內完成。所生成的PiPSC展示人胚胎干細胞(ESC)的特征，可以在無飼養者條件下穩定且同質擴增超過30代，并且具有在體外和體內成為三個主要胚層的分化潛力。最重要的是，這種PiPSC技術以大于85 ±4%的轉換效率由HNF生成PiPSC0此類高重編程效率可以顯著增強所生成piPSC的質量，所述piPSC對于未來人臨床應用是安全的。
[0096]包括下述實施例以證實本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當理解實施例中公開的技術代表由本發明人發現的技術和組合物，以在本文公開的實施方案的實踐中良好起作用，并且因此可以視為構成用于其實踐的優選方式。然而，根據本公開內容，本領域技術人員應當理解可以在公開的具體實施方案中作出許多變化，并且仍獲得相同或相似結果，而不背離本文公開的實施方案的精神和范圍。
實施例
[0097]材料與方法
[0098]質粒構建。將四種基因0ct4(NP_002692)、Sox2(NP_003097)、Klf4(NP_004226)、Nanog (NM_024865.2)和 c-Myc (NP_002458)亞克隆到 sHT_pET30a 細菌表達載體內，其中短his標簽:’ HHHHHHSS’替換長his標簽。因子Xa (IEGR)切割位點在短his標簽和編碼基因之間。細菌表達載體的序列通過DNA測序加以證實。
[0099]蛋白質表達和純化。將重編程蛋白質的DNA構建體各轉化到大腸桿菌(E.Coli)菌株BL-21 (DE3)內。選擇單個集落用于細菌蛋白質表達。在短暫最佳化后，通過0.5mMIPTG誘導蛋白質表達并且在18°C下繼續培養16小時。將細胞收獲在含有6M尿素的結合緩沖液中，并且超聲處理三次。根據手冊伴隨修飾，使用His-Bind Resin柱(Novagen)純化重組蛋白質。純化蛋白質針對水透析且凍干成蛋白質粉末。
[0100]QQ-修飾。將重編程蛋白質溶解于具有2M尿素的50mM磷酸鈉pH7.4中。QQ-試劑基于配方新鮮制備。簡言之，QQ-試劑是聚乙烯亞胺(PEI) 2，000 (2K，0.2-1.0mg/ml)和D0TAP/D0PE (25-50 μ g/ml)的混合物。通過使 QQ-混合物與蛋白質(0ct4/Sox2:lmg/ml ；Klf4/c-Myc:0.5mg/ml ；Nanog:lmg/ml)在室溫下混合4小時或在冷室中混合過夜,執行重編程蛋白質的QQ-修飾。
[0101]細胞培養和細胞重編程。HNF在35X10-mm細胞培養皿中培養，直至在具有10%FBS的DMEM培養基中70-80%匯合(5X IO4細胞)時。QQ-修飾的重編程蛋白質也與具有10%FBS的DMEM培養基(Invitrogen)混合，并且在室溫下溫育10分鐘。0ct4、Sox2和Klf4的終濃度是0.2-0.5 μ g/ml，而c-Myc是0.02-0.05 μ g/ml。為了起始重編程，將細胞培養基替換為重編程培養基(具有10%FBS、0.1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培養基)。蛋白質濃度如下逐漸減少:在循環I中，0ct4/Sox2/Klf4是0.5 μ g/ml,并且c_Myc是0.05 μ g/ml ο在循環2中，蛋白質濃度減半。在循環3中，蛋白質濃度進一步減半。每個循環含有與QQ-修飾的蛋白質的3-12小時溫育，加上不含重編程蛋白質的12-21小時溫育。在3個循環后，細胞在具有20%KSR、0.lmM2-ME、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸的DMEM培養基(補充有10ng/ml bFGF (Stemgent))中培養用于重編程后培養48小時。保存這個48小時重編程后培養基作為條件培養基。在重編程后培養結束時，細胞完全匯合。在重編程后培養后的匯合皿將在無飼養者條件下促進集落形成。
[0102]在無飼養者條件下的piPSC生成。將新皿(0.2%明膠包被的)用條件培養基預處理15分鐘。使用胰蛋白酶(0.05%)將重編 程的細胞解離為單層細胞懸液，并且轉移到新皿內。使細胞在含有Knockout DMEM的培養基中培養，所述Knockout DMEM具有20%KSR(Invitrogen)、10ng/ml bFGF、0.2mM2_ME (Sigma)、0.1mM 非必需氨基酸(Invitrogen)和2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)。第二天,觀察到數百個邊緣清晰的集落。當皿是80-90%匯合時，每5-7天傳代細胞。為了比較piPSC群體的多能性，挑選單個piPSC集落用于傳代(單集落傳代)或傳代半個皿的細胞(全皿傳代)。使用兩種傳代法繼續細胞擴增一直到第10次傳代(2個月)，并且執行免疫染色。在PiPSC傳代過程中，通過將一半培養基替換為新鮮的無飼養者培養基，每隔一天更換培養基。每隔一周制備無飼養者培養基并且將其維持在冷室中。
[0103]重編程蛋白質的劑量相對于piPSC集落形成。不同濃度的重編程蛋白質用于生成PiPSC集落。在每個蛋白質濃度時一式三份地執行兩循環重編程。在重編程和重編程后溫育(48小時)后，將全皿傳代到60x15mm皿內。在第2次傳代開始在顯微鏡下計數集落數目
共連續三天。
[0104]重編程蛋白質的核靶向。在實驗前一天將HNF種植到4個孔內。使HNF與QQ-修飾的0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc (1-μ g/ml)單獨地一起在37°C下溫育1.5小時。將細胞用PBS洗滌3次，并且用4%甲醛固定，隨后用PBS洗滌3次。將細胞封閉且用含有0.2%曲拉通的2%綿羊血清滲透化2小時，并且與具有2%綿羊血清PBS的一抗一起在冷室中溫育過夜。將細胞用1%血清洗滌3次，并且隨后與二抗(1:300稀釋度)一起在室溫下溫育2小時。使用1%血清-PBS將細胞洗滌3次，并且實施熒光成像。
[0105]人干細胞多能性基因陣列分析。使用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion, USA)在第1次和第5次傳代時，從HNF和iPSC中提取總RNA。含有92種定義明確的驗證基因的TaqMan? Stem Cell Pluripotency Arrays (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA)用于基因表達分析。根據制造商的方案執行逆轉錄反應、實時RT-PCR和數據分析，以獲得值。簡言之，使用來自 High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems)的隨機引物，分別由1.0ug總RNA逆轉錄cDNA。在ABI Veriti Thermal循環儀(AppliedBiosystems)上執行 RT-PCR。使 500ng cDNA 與TaqMan? Universal PCR Master Mix/
儲庫混合，對于每種樣品兩個儲庫。將樣品特異性PCR混合物裝載到TaqMan? stemCell Pluripotency Array 上，每個儲庫 IOOul。在離心后，隨后在 7900HT 系統(AppliedBiosystems)上運行TaqMan陣列，用于定量實時PCR分析。使用SDS軟件版本2.3和RQmanager 1.2 (Applied Biosystems),應用自動基線設置和0.05的閾值,計算原始Ct值。對于陣列數據分析，僅考慮具有等于或低于36的Ct值的那些miRNA。將原始Ct值輸入RealTime StatMiner4.2 (Integromics, Inc.)內。選擇 GAPDH 作為內源對照基因，以測定候選基因的相對表達。選擇HNF的基因表達作為校準物，以鑒定差異表達的piPSC的特異性標記。計算-Λ Λct，并且用分層聚類執行熱圖分析。單個TaqMan?實時RT-PCR進一步用于證實陣列數據。
[0106]實時RT-PCR。根據制造商的說明書，使用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion,USA)，從人新生兒成纖維細胞和piPSC (第1次和第5次傳代)中分離總RNA。對于每個RT反應，使用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription 試劑盒(Applied Biosystem,USA)，將200ng RNA用于cDNA合成。PCR反應在HT-7900系統中完成。結果是一式三份測量的平均值，并且針對對照基因GAPDH標準化。使用比較閾值循環法計算靶基因的相對表達。通過計算-Λ ACt生成表達差異。
[0107] 蛋白質印跡。純化蛋白質或piPSC裂解產物通過10%SDS_PAGE在還原條件下分離，并且點到硝酸纖維素膜上。針對人0ct4 (Santa Cruz)、Sox2 (Santa Cruz)、KLF4 (R&DSYSTEMS)和c-Myc (R&D SYSTEMS)的抗體用于檢測蛋白質。分別使用針對小鼠IgG (SantaCruz)、兔 IgG (Santa Cruz)和山羊 IgG (Sigma)的二抗。通過 SuperSignal West PigmoChemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, USA)檢測蛋白質信號。
[0108]擬胚體(EB)形成和自發體外分化。將piPSC胰蛋白酶消化成單層細胞，并且在低粘附平板(Corning)上在具有10%FBS、含有0.lmM2_ME的DMEM培養基中懸浮培養。在幾天中在懸液中觀察到EB。對于自發分化，每2天更換培養基，共10-15天。通過用所示抗體的代表性譜系特定標記的免疫染色檢查自發分化。對于特定神經譜系分化，在EB形成后的第3天時將培養基更換為神經誘導培養基:含20ng/ml神經生長因子的具有5%FBS的DMEM(PROSpect)。對于特異性心肌細胞譜系分化，在EB形成后的第3天時將培養基更換為特異性培養基。[0109]細胞化學和免疫熒光測定法。根據制造商執行ALP測定法(Vector Red ALP底物試劑盒I)。使用用于多能性和分化標記的標準方案執行免疫細胞化學。簡言之，將PiPSC和HNF種植到8孔培養室中，并且用4%多聚甲醛(Sigma)固定，用PBS洗滌三次。將細胞在0.2%tritonX和5%綿羊血清(Sigma)中在室溫下溫育2小時。接下來，使細胞與一抗一起在4°C下溫育過夜:干細胞標記抗體試劑盒(R&D Systems, 1:300)、抗Tra-1_60(Stemgent, 1:300)和抗Rexl(Stemgent, 1:300)用于多能性標記。對于體外分化,使用Tujl(Covance, 1:500)、巢蛋白(Millipore, Neural Stem cell Characterization Kit, 1:10)、MF20 (Development Studies Hybrioloma Bank,Super,1:300)、APF (Thermo Scientific,1:200)、結蛋白(Thermo Scientific, 1:300)和 Brachyury (Santa Cruz, 1:300)。在 1% 血清PBS中洗滌三次共10分鐘后，使細胞與二抗(在2%血清PBS中1:400)—起在室溫中溫育
2小時:Alexa Fluor555 驢抗山羊 IgG (1:2000, Invitrogen)、Alexa Fluro488 驢抗兔 IgG(1:2000, Invitrogen)和 Alexa Fluro488 驢抗雞 IgG (1:2000, Invitrogen)。使用 DAPI協作封固劑(cooperated mounting medium) (VactorLab)通過 DAPI 檢測核。使用 ApoTom(Zeiss) Axl0plan2成像系統獲得熒光圖像。
[0110]畸胎瘤形成。全皿傳代用于擴增P iPSC用于畸胎瘤形成。在第3次傳代時，將P iPSC懸浮于含有10%FBS的DMEM中。將SCID或無胸腺Balb/c小鼠(NxGen Biosciences)用二乙醚麻醉，并且將細胞懸液注射到腎囊和肌肉下。腫瘤在第四周時明確可見，并且在注射后的第六周時手術解剖。將組織樣品在含有4%甲醛的PBS中固定，并且在石蠟中包埋。將切片用蘇木精和伊紅染色。
[0111]DNA 甲基化研究。使用 DNeasy Blood&Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA)從HNF和piPSC中分離基因組DNA，并且通過超聲進行斷裂，以將DNA剪切成小片段(大小400_1000bp)。使用由制造商建議的方案，使用 MethylMiner Methylated DNA EnrichmentKit (Invitrogen),經由與人MBD2蛋白質的甲基-CpG結合結構域結合,從斷裂的基因組DNA 中分離甲基化的 DN A。使用 StepOne Plus Real time PCR 系統(Applied Biosystems)執行qRT-PCR，以對于甲基化DNA樣品各自測定Nanog基因啟動子區序列的Ct值，其中使用一對引物(Nanog基因啟動子區:-1519至1498和-1307至-1327)用于擴增192bp DNA片段。作為內部對照，還使用用于擴增154bp DNA片段的一對引物(外顯子5)，對于甲基化的DNA樣品各自測定β -肌動蛋白基因的Ct值。HNF中的Nanog基因啟動子區DNA的水平計數為 100%,并且使用 StepOne 軟件 v2.1 (Applied Biosystems),piPSC 中的 Nanog 基因啟動子區DNA的水平計數為相對于HNF那種的倍數變化。
[0112]SKY分析。細胞培養和染色體制備:在秋水仙酰胺(colcemid) (0.1 μ g/ml) 2小時處理后收獲細胞。在常規低滲處理后(0.4%KC1，37°C 10分鐘)，用3:1甲醇:乙酸(3x)固定染色體制劑，并且通過風干法制備載玻片。在胃蛋白酶處理和用甲醛固定后，對載玻片實施脫水。隨后使染色體載玻片在70%甲醛和2x SSC中變性，并且與變性的人涂抹探針(SKYPaint)在37°C下雜交經過48小時。在一系列載玻片洗滌步驟后檢測信號。DAPI信號也用于顯現染色體/核。使用CCD相機隨機捕獲具有良好雜交質量的50個有絲分裂圖。在圖像采集后，染色體用Applied Spectral Image軟件進行核分型(karyotyped)。
[0113]益果
[0114]簡單的piPSC方案。這種piPSC技術含有制備細菌表達的重編程蛋白質、QQ-修飾和1-5個細胞重編程循環的步驟，其中取決于不同起始細胞(圖1)。近期報道有效的細菌表達方法(圖2A)，允許對于Oct4、Sox2、Klf4和c_Myc由一升細菌表達產生80_120mg純重組蛋白質(圖2B)。因為細菌表達的重組蛋白質可能不正確折疊，所以體外蛋白質重折疊方法用于通過Zhou等人的先前piPSC方案中，所述先前piPSC方案是低效的并且需要另外的純化步驟。然而，近期開發了體內蛋白質重折疊技術，其使用QQ-蛋白質遞送將細菌表達的重組重編程蛋白質直接遞送到哺乳動物細胞內，在其中細胞內折疊機制有效重折疊蛋白質。PiPSC方案應用這種體內蛋白質重折疊技術的原理。使用QQ-蛋白質遞送將四種重編程蛋白質遞送到HNF的核內，用于重折疊且作用于起始細胞重編程(圖3)。每個重編程循環是24小時:使HNF與四種重編程蛋白質一起溫育3-12小時，允許蛋白質遞送到細胞內，隨后轉到常規細胞培養基內12-21小時(圖1)。
[0115]對于蛋白質誘導的細胞重編程，需要遞送的轉錄因子達到核，以開始細胞重編程。QQ-遞送的重編程蛋白質在遞送后1.5小時達到基本上每一個細胞的核(圖3)。遞送的蛋白質還在細胞溶質中觀察到，因為在蛋白質遞送過程中執行熒光成像。這個結果顯示蛋白質誘導的細胞重編程可以在蛋白質遞送后數小時內開始。證實蛋白質誘導的HNF細胞重編程在前24小時內開始，并且在5天內完成，如通過使用晚期多能性標記例如Rexl和Tral-60的免疫染色判斷的(圖4)。這通過在第8天時的細胞重編程皿中的集落形成進一步證實(圖4)。
[0116]piPSC方案的最佳化。蛋白質濃度首先使用堿性磷酸酶(ALP)陽性集落數目作為用于最佳化的標準進行最佳化。數據指示對于高濃度重編程蛋白質的低轉換效率。當使用5 μ g/ml蛋白質濃度時，僅發現少數ALP陽性集落。更低的濃度生成更多的ALP陽性集落，其中以0.25-0.50 μ g/ml的重編程蛋白質濃度在5天內生成最多的ALP陽性集落(表1)。這個結果受公開的人胚胎干細胞(hESC)數據支持，指示在ESC內的0ct4濃度是關鍵的，因為更高的0ct4濃度引起ES細胞分化，而更低的0ct4濃度未能維持多能性。此外，c-Myc是致癌蛋白質，其可以引起更高的突變率，并且在高細胞內濃度時參與腫瘤生成。四種重編程蛋白質的最佳化濃度對于生成的`PiPS細胞的質量是關鍵的。QQ-蛋白質遞送允許我們控制在HNF的核內的遞送蛋白質濃度(表1 )，允許蛋白質濃度的快速最佳化。
[0117]還執行細胞重編程方案的最佳化。重復僅具有一個重編程循環的最初方案(3小時重編程)，并且在循環結束時使用抗ALP抗體將細胞免疫染色。僅~30%的HNF顯示強ALP染色(圖OT)。作為對照，用不含重編程蛋白質的常規培養基培養24小時的HNF顯示無ALP染色(圖5C)。當執行5小時重編程時，顯著更多的細胞(~60%)顯示強ALP染色(圖5E)。HNF用四種重編程蛋白質(0.1 μ g/ml)的24小時連續培養指示基本上每一個HNF細胞都是ALP陽性的(圖5F)，表明可能極高的細胞重編程轉換效率。這個數據提供允許QQ-蛋白質遞送在蛋白質誘導的細胞重編程中的能力的直接證據。
[0118]最佳化的piPSC方案通常遞送以1:1:1:0.1比率的0ct4/Sox2/Klf4/c_Myc，對于第一個循環對于0ct4使用0.5 μ g/ml的蛋白質濃度,并且其后在循環中蛋白質濃度減半。通常執行1-5個重編程循環，取決于起始人體細胞。對于HNF，2_3個重編程循環足以生成PiPS細胞。在重編程結束時，將培養基轉變為含有FGF (10ng/ml)的無飼養者維持培養基共2天。將細胞移出并且轉移到新皿內，所述新皿用條件培養基預處理10分鐘。用一半條件培養基和一半新的無飼養者維持培養基培養細胞。在第5-6天時，觀察到許多邊緣清晰的集落(圖5A和5B)。整個皿含有來自IO5個起始細胞的500-1500個piPSC集落。在使用來自小鼠ES細胞的蛋白質提取物的近期研究中，相似的piPS樣細胞也在5天內制備，但具有低得多的效率。
[0119]高轉換效率。這種piPSC技術給出來自人體細胞的piPSC的高轉換效率。許多集落通常在第一次或第二次傳代中獲得。在圖6A中，左圖顯示在皿中的許多集落。集落用紅色ALP試劑盒染色；右圖顯示加框區域的放大視圖，展示紅色ALP染色的piPSC集落。為了評價轉換效率，有意由集落制備單層PiPSC，并且使用ALP、SSEA4、Nanog、0ct4、Rexl和Sox2抗體對單層細胞執行免疫染色(圖6B )。還對起始HNF執行免疫染色，顯示陰性染色(圖6B )。為了評估轉換效率，在熒光成像后以雙盲方式對于陽性和陰性染色的細胞(>400個細胞)評分最少10個隨機選擇的視野，以使主觀解釋降到最低。隨后通過陽性染色的細胞/總計數細胞的比率計算轉換效率。在圖6C中，右圖顯示結果，指示平均重編程效率在80-91%之間。這個結果與先前時程一致，表明這種PiPSC技術可以以85±4%轉換效率的平均值生成PiPSC0在先前時程實驗中，還證實對于使用QQ-蛋白質遞送的相似細胞重編程方案88±2%轉換效率的平均值(表2)。
[0120]為了證實這個結果，使用三對多能性標記執行雙重免疫染色:SSEA4/0ct4、Tral-60/Nanog和Tral_60/0ct4(表面/核標記)。在圖6B中，右圖展示這些二重染劑的例子，其中0ct4/Nanog為紅色，Tral-60為綠色，并且DAPI為藍色。僅當核和表面標記都顯示陽性染色時，才視為陽性PiPSC。再一次，結果證實~80%轉換效率(圖6B，右圖)。為了進一步驗證免疫染色是真陽性的，使用六種多能性標記對細胞混合物執行內部對照實驗，所述細胞混合物含有30%piPSC和70%起始HNF。數據指示陽性染色細胞的預期稀釋度(圖7)，提供對高轉換效率的另外支持。
[0121]此類高轉換 效率表明集落選擇在細胞重編程以生成piPS細胞的過程中可能是不需要的，并且克隆擴增在PiPSC擴增過程中可能是不需要的。近期報告指示通過使用不同多能性標記的流式細胞術，人ESC在相似無飼養者條件下的長期培養僅含85-94%hESC群體。這個結果類似于此處報道的轉換效率，表明PiPSC法生成接近純的piPSC群體。
[0122]使用集落挑選和全皿傳代執行實驗。首先，挑選單個邊緣清晰的集落(圖8A)，并且置于無飼養者條件內。注意到這個單個集落經過幾天開始喪失其清晰邊緣，并且細胞展開成單層。這也由Rodin等人注意到:當在相似的無飼養者條件下置于小塊中時，純hESC展開成單層。一旦細胞達到匯合，就將它們移出且傳代到新皿內。第二天形成許多邊緣清晰的集落，并且PiPSC通常遷移出集落(綠色箭頭)，而一些集落維持清晰邊緣(白色箭頭)(圖SB)。這些遷移細胞形成單層細胞，其可以充當用于剩余集落的飼養細胞。使用0ct4和Nanog抗體執行邊緣清晰的集落(圖8C1和8C3)和單層細胞(圖8C2和8C4)的免疫染色。數據明確指示兩類細胞都是陽性染色的，表明集落和單層細胞都是PiPSC。用全皿傳代重復相同程序，并且觀察到相同結果。對于全皿傳代，數據指示80-90%的細胞對于六種多能性標記具有陽性免疫染色(圖6C)，表明在這些條件下在兩種傳代方法之間無差異。
[0123]piPSC的表征。使用全皿傳代，所生成的人piPSC已在無飼養者培養條件下穩定且同質擴增超過30代共6個月(圖9)。它們形成其形態與hESC無法區分的集落。這些piPSC集落占優勢地表達ESC標記，包括ALP、0ct4、Nanog、SSEA4、Rexl和Tral-60(圖10)。作為對照，使用起始HNF執行相同免疫染色，顯示陰性結果(右，圖10)。定量逆轉錄PCR( qRT-PCR)分析證實與HNF的基因表達相比較，在第5次傳代時在piPSC中顯著增強的多能性基因的內源基因表達，包括Oct4、SoX2、Nanog (圖11A)。注意到這些主要多能性調節物的基因表達展示在第一次傳代時(第6天)的較少增強，但在第5次傳代時(第22天)的較大增強，指示在細胞重編程后多能性發展的時間依賴性。為了驗證多能性蛋白質表達，執行PiPSC的蛋白質印跡，并且與起始HNF細胞相比較。結果指示對于四種多能性標記包括Sox2、0ct4、Nanog和Rexl的piPSC的顯著蛋白質表達。Sox2、0ct4和Nanog是三種主要多能性調節物，并且Rex-1是晚期多能性標記。相比之下，起始HNF細胞未展示這四種多能性標記的蛋白質表達。作為對照，看家蛋白質肌動蛋白展不在piPSC和HNF之間相等的蛋白質表達水平(圖11C)。Nanog基因的DNA甲基化分析揭示Nanog的啟動子區在piPSC中顯著脫甲基化，而相同區域在親本HNF細胞中致密甲基化(圖11D)。這個結果提供生成的piPSC展示這個主要多能性調節物的啟動子的后生調節的進一步證據，表明在生成的PiPSC中合適的后生細胞重編程。在生成的PiPSC和親本HNF之間不存在核型變化(圖11B)，指示在親本HNF和子代PiPSC之間無重大染色體變化。
[0124]體外和體內分化。為了檢查所生成的piPSC的發育潛力，執行體外分化和體內畸胎瘤形成。使用懸浮培養法在1-2天內形成擬胚體(EB)。這些EB在體外容易地分化成三個主要胚層，包括外胚層衍生物(表達Nastin和Pax6的細胞)、中胚層衍生物(表達結蛋白和Brachyury的細胞和成熟跳動心肌細胞)和內胚層衍生物(表達AFP的細胞)，如通過免疫染色證實的(圖12，上)。適當的陰性對照已對于使用親本HNF的免疫染色執行，顯示陰性免疫染色。當EB在導致神經譜系的專門培養基中培養時，這些EB在1-2周將其形態容易地改變成神經細胞的典型形態，包括神經元、星形細胞和少突膠質細胞。免疫細胞化學分析證實對于Tujl (圖12，下A)、GFAP (圖12，下B、C)和01 (圖12，下D)陽性的這些神經細胞類型的存在。還在早期時間觀察到神經干細胞(NSC)，如通過用Sox2 (圖12，下F)和巢蛋白(圖2，下G)的陽性染色證實的。
[0125]當piPSC移植到裸鼠的腎囊內時，在6周內觀察到畸胎瘤形成(圖13A和B)。得自全皿傳代的第三次傳代的PiPSC用于移植。在移植前，使用具有六種多能性標記的免疫染色表征這些PiPSC。再次，有意制備單層PiPSC用于免疫染色(圖13C)。結果指示基本上每一個細胞都展示對于所有六種多能性標記的陽性染色。將約200，000個piPSC移植到裸鼠的左腎囊內。在植入后三到四周時，在小鼠的左脅腹區中觀察到結樣形成。在六周時處死小鼠。組織載玻片的組織學數據指示這些畸胎瘤含有來自所有三個主要胚層的組織，包括神經組織和表皮組織(外胚層)、橫紋肌和軟骨(中胚層)、和腸樣上皮組織(內胚層)(圖14)，證實生成的PiPSC在體內顯示出多能性。這個結果進一步提供高轉換效率的體內驗證，因為用全皿傳代擴增所生成的PiPSC能夠有效生成畸胎瘤。
[0126]近來，將Yamanaka的四種重編程因子替換為其為主要多能性調節物的Sox2、0ct4和Nanog，以生成piPS細胞。我們的數據再次指示87±3%的極高轉換效率(表3)。這種新重編程蛋白質混合物 消除Yamanaka的因子中的致癌蛋白質Klf4和c_Myc,生成的piPS細胞將具有更高的質量且使腫瘤生成降到最低。
[0127]討論
[0128]本文公開的piPSC方案應用現有技術QQ-蛋白質遞送技術，其解決與目前的iPSC技術相關的技術挑戰。首先，QQ-試劑與遞送的蛋白質非共價結合，并且偽裝它們使其不受細胞內蛋白酶降解，確保遞送的蛋白質維持其天然形式和代謝穩定性。最重要的是，QQ-遞送的蛋白質具有基于其序列定位信號特異定位于靶向的細胞內區室的能力。這些特點允許遞送的蛋白質與內源蛋白質無法區分，細胞機制如同它們是內源對等物一樣起作用，證實QQ-蛋白質遞送技術的生理學關聯性。
[0129]使用QQ-蛋白質遞送，在1.5小時內將細菌表達的重組重編程蛋白質直接遞送到HNF的核內(圖3)，允許省略低效的體外蛋白質重折疊步驟。細胞內蛋白質折疊機制直接重折疊QQ-遞送的重編程蛋白質，使得這種PiPSC方案成為快速、簡單和廉價的程序。QQ-蛋白質遞送能夠將四種重編程蛋白質有效遞送到基本上每一個HNF的核內，表明由HNF生成piPSC的可能的聞轉換效率。數據進一步指不細胞重編程可以在QQ-蛋白質遞送的24小時開始，并且在48-72小時過程中良好維持，并且在QQ-蛋白質遞送后5天內完成(圖4)。這顯著加速PiPSC生成的程序，證實QQ-蛋白質遞送技術的允許能力。
[0130]為了以高轉換效率生成piPSC，必須有效實現人體細胞的發育基因沉默和多能性基因激活。這要求重編程蛋白質有效遞送到核內，用于與不同基因的不同啟動子和阻遏區相互作用。QQ-蛋白質遞送滿足這個需求，并且將重編程蛋白質靶向遞送到幾乎每一個HNF的核內，導致來自起始HNF85 ±4%的piPSC轉換效率。這生成接近純的piPSC群體，其類似于在相似無飼養者條件下在hESC的長期自我更新過程中的純hESC群體。此類高轉換效率消除在細胞重編程和克隆擴增過程中的集落選擇。開發全皿傳代，生成均勻的單層PiPSC群體，其對于減少長期自我更新過程中的分化是關鍵的。同質單層PiPSC的使用還提供更可控制的條件用于設計分化條件，當它們置于專門譜系誘導培養基中時，具有驅動分化成專門譜系細胞的更同質群體的重大優點。
[0131 ] 生成的piPSC是人ESC樣細胞，展示顯著增強的多能性基因表達，包括三種主要多能性調節物Sox2、0ct4和Nanog (圖11A)。這三種主要多能性調節物還展示主要蛋白質表達(圖11C)。生成的piPSC展示在體外和體內成為三個主要胚層的分化潛力(圖12和14)。事實上，這些piPSC能夠有效分化成神經譜系,具有神經元、星形細胞和少突膠質細胞的典型形態(圖12，下)。Jaenisch的實驗室近期證實通過四種轉錄因子的重編程是連續隨機過程，其中幾乎所有小鼠供體細胞在連續生長和轉錄因子表達后基本上都產生iPSC。然而，這種方法需要8周以生成iPSC，伴隨p53/p21途徑的抑制或Lin28的過表達。本文公開的PiPSC技術證實無需操作任何下游途徑的高轉換效率。這具有生成的piPSC用于未來安全人臨床應用的重大優點。
[0132]在使用多種遺傳方法中的近期進展已解決目前的iPSC技術的一些挑戰。這包括非整合腺病毒、瞬時轉染以遞送重編程基因、PiggyBac轉座系統、Cre可切除病毒和基于oriP/EBNAl的附加型表達系統。研究還證實本發明可以替換和/或進一步減少細胞重編程所需的轉錄因子數目。然而，這些方法僅提供低轉換效率，并且還遺傳改變細胞，迫使生成的iPSC用于安全人臨床應用的重大生物安全問題。目前，僅兩篇報道公開具有極低轉換效率用于小鼠和人細胞的蛋白質誘導的細胞重編程。本文公開的PiPSC技術提供生成人PiPSC的有效和快速方法。這種技術直接遞送細菌表達的蛋白質用于細胞重編程，使得這種方法簡單和廉價。這種PiPSC技術的非隨機性質使得能夠可靠和準確的機械研究細胞重編程。重要的是，這種PiPSC技術顯著加速以高效率生成患者特異性piPSC的整個過程，允許快速生成一組疾病特異性PiPSC作為原材料用于生成用于個別患者的人疾病的替代模型，以獲得疾病病理生理學的有價值的了解，以開發新預后生物標記且確保受累細胞類型的連續供應用于藥物篩選和開發。
[0133]已產生關于使用目前的iPSC方法生成的iPSC質量的重大關注。結果指示在生成的iPSC和人ESC之間的后生變化中的輕微模式差異。不是復原至胚胎樣狀態，接近iPSC中的染色體尖端和中心的甲基化模式類似iPSC已由其衍生的成體組織中的那些。為了解決這個問題，必須開發有效的細胞重編程方法，其完全復原起始體細胞的后生時鐘以回到ESC樣狀態。此外，大多數目前的iPSC/piPSC方法使用可能增加突變率的癌基因。近期報道的數據證實預先存在的以及在重編程過程中和重編程后發生的新突變促成在目前的hiPSC系中發現的高突變負荷。在細胞重編程過程中的選擇、集落挑選和后續克隆擴增可能是促成因素。事實上，如果重編程效率增強至這樣的水平，使得不需要集落挑選和克隆擴增，則所得到的hiPSC可以潛在不含突變。本文公開的piPSC技術提供了此類高重編程效率。此外，可能需要新重編程蛋白質例如DNA脫甲基酶或甲基胞嘧啶雙加氧酶，以完全復原起始體細胞的后生時鐘，本文公開的這種PiPSC技術可以用于以高流通量方式篩選這些新重編程因子。最后，因為避免在重編程和集落挑選/克隆擴增過程中繁重的集落選擇，其可以生成不含突變的人PiPSC，所以這提供顯著增強生成的piPSC的質量用于未來安全人臨床應用的細胞重編程技術(圖15-17)。
[0134]本申請自始至終，作者和年份和通過編號的專利參考多種出版物包括美國專利。關于出版物的完全引用在下文列出。這些出版物和專利的公開內容整體通過引用并入本申請，以便更充分地描述本發明所屬領域的狀態。
[0135]本發明已以舉例說明性方式進行描述，并且應當理解本文已使用的技術預期具有描述性而不是限制性言語的性質。
[0136]顯而易見的是，根據上文教導，本發明的許多修飾和變化是可能的。因此，應當理解在本發明的范圍內，本發明可`以以除具體描述外的其他方式實踐。
【權利要求】
1.一種通過下述生成蛋白質誘導的多能干細胞的方法: 使用QQ-蛋白質轉導技術將細菌表達的重編程蛋白質遞送到起始體細胞的核內； 重復幾次細胞重編程循環用于產生重編程蛋白質誘導的多能干細胞； 將所述重編程的細胞移動到無飼養者培養基內用于擴增；和 擴增且傳代全皿中的所述重編程的細胞用于生成同質PiPS細胞。
2.根據權利要求1的方法，其進一步包括使用細菌表達系統產生重編程蛋白質。
3.根據權利要求2的方法，其進一步包括使用QQ-試劑修飾所述重編程蛋白質。
4.根據權利要求3的方法，其進一步包括在所述修飾步驟前，用小分子熒光探針體外標記所述重編程蛋白質的步驟。
5.根據權利要求4的方法，其進一步包括監控QQ-蛋白質遞送進入所述起始體細胞的核內的效率。
6.根據權利要求1的方法，其提供一般的蛋白質誘導的細胞重編程方法，用于經由轉分化由健康和患病動物和人體細胞生成PiPS細胞、特定成體干細胞、特定祖細胞和不同體細胞類型。當生成特定成體干細胞、特定祖細胞和不同體細胞類型時，必須使用不同蛋白質混合物。
7.根據權利要求1的PiPSC方法，用于在允許直接使用所述細菌表達的細胞重編程蛋白質用于動物和人體細胞的細胞重編程中使用，以生成PiPS細胞。
8.根據權利要求1的·PiPSC方法，其中所述重編程步驟包括使用選自基本上由下述組成的Yamanaka因子或SON因子的不同重編程蛋白質混合物:四種重編程蛋白質(0ct4/Sox2/Klf4/c_Myc)、三種重編程蛋白質(0ct4/Sox2/Klf4 或 Sox2/0ct4/Nanog)、兩種重編程蛋白質(0ct4/Sox2或0ct4/Nanog)、和僅一種重編程蛋白質(0ct4或Nanog)。
9.使用根據權利要求1的方法形成的PiPSC細胞。
10.使用根據權利要求1的方法形成的PiPSC細胞，其中所述piPS細胞可以在體外和體內有效分化成三個主要胚層細胞用于畸胎瘤形成。
11.根據權利要求9的PiPSC細胞，其中所述細胞衍生自選自基本上由下述組成的細胞:來自不同健康動物的細胞和人體細胞，包括但不限于小鼠原代成纖維細胞、成體小鼠成纖維細胞、人新生兒成纖維細胞、人原代成體成纖維細胞、人成體角化細胞和人羊水。
12.根據權利要求9的piPSC細胞，其中所述細胞衍生自選自基本上由下述組成的細胞:患病動物和人體細胞，包括但不限于:來自ALS小鼠的小鼠原代成纖維細胞、大鼠腫瘤細胞例如9L-神經膠質瘤細胞、小鼠轉移性乳腺癌細胞例如4T1-細胞、人乳腺癌細胞系例如MDA-MB-231、人腦瘤細胞系例如U87和U251-神經膠質瘤細胞、人原代4期GBM細胞、具有apoE3和apoE4基因型的來自阿爾茨海默患者的人原代成纖維細胞。
13.根據權利要求9的piPSC細胞，用于在選自基本上由下述組成但不限于下述的人臨床應用中使用:再生醫學和細胞替代療法，來自具有遺傳病癥的個別患者的iPS細胞庫的生成，基于來自個別患者的PiPS細胞的疾病模型和藥物的功效和毒性測試，所述藥物包括但不限于小分子藥物、蛋白質藥物、DNA藥物、RNA藥物、碳水化合物藥物和基于脂質的藥物。
14.根據權利要求9的piPSC細胞，用于在治療選自基本上由下述組成但不限于下述的疾病中使用:癌癥、心臟病、中風、糖尿病、肥胖、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化、心肌梗塞、肌營養不良、CMT-1A、脊髓損傷、外傷性腦損傷、學習缺陷、缺牙、傷口愈合、骨髓移植、骨關節炎、類風濕性關節炎、脫發、失明、耳聾、克羅恩氏病和遺傳疾病及其他相似 疾病。
【文檔編號】C12N5/071GK103826459SQ201280032517
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年5月2日 優先權日:2011年5月2日
【發明者】J·王, Q·李 申請人:韋恩州立大學