專利名稱:應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及獸用疫苗的生產，具體涉及一種應用生物反應器工業化生產動物流感 滅活疫苗的方法。
背景技術：
流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3個型。其中甲型流感病毒多 發于禽類，一些亞型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動物及人類；乙型和丙型流感病 毒則分別見于海豹和豬的感染。禽流感(Al)是由A型流感病毒引起的家禽和野生禽類感 染的高度接觸性傳染病。野禽是禽流感病毒天然宿主，已證實禽流感病毒可以由家禽直接 感染人，引起人類的發病和死亡。豬流感(Si)是由豬流感病毒引起的不同日齡、性別和品 種豬只的一種急性、熱性和高度接觸性的呼吸道傳染病。豬是禽、人、豬流感病毒重組和復 制的“混合器”，豬流感病毒不需重組就有最大限度感染人的能力。因此禽流感和豬流感不 但是能夠造成嚴重的經濟損失的動物疫病，而且具有重要的公共衛生學意義。
當前動物流感滅活疫苗生產主要是雞胚培養繁殖抗原的傳統培養方式。雖然其要 求較低、技術成熟穩定，但原料受季節性制約，如禽流感爆發會對雞胚供應造成威脅，后期 廢物處理污染環境，抗原含卵清蛋白、純度低，免疫后副反應大。
以細胞基質生產動物流感滅活疫苗的生產產量和質量取決于病毒株系、宿主細胞 培養活性及密度、病毒培養條件、以及最終的濃縮、純化和佐劑配制工藝。中國專利公開號 為CN101491672的專利申請，公開了一種雞新城疫-禽流感二聯油乳劑滅活疫苗及其制備 方法；中國專利公開號為CN101607084的專利申請，公開了一種雞新城疫、H9亞型禽流感 二聯滅活疫苗的制備方法；中國專利公開號為CN101607083的專利申請，公開了一種禽流 感四聯滅活疫苗的制備方法；中國專利公開號為CN1010627113A的專利申請，公開了一種 支持病毒生長到高效價的MDCK細胞系和采用該細胞系的生物反應器方法。中國專利公開 號為CN101511385A的專利申請，公開了一種不使用雞蛋制備流感病毒疫苗。中國專利公 開號為CN101094915A的專利申請，公開了一種生產流感疫苗的方法。中國專利公開號為 CN101062411A的專利申請，公開了一種應用生物反應器大規模生產流感疫苗的方法。中國 專利公開號為CN101189326A的專利申請，公開了一種用于病毒增殖的非致瘤性MDCK細胞 系。
以上文獻資料都有不同程度的涉及禽流感疫苗的生產工藝方法或應用生物反應 器進行流感病毒的培養。但是，將特定的生物反應器技術應用到宿主細胞通過逐級放大進 行高密度培養上，并通過接種特定的流感病毒細胞適應株進行病毒培養和收獲，用于制備 疫苗，均未見報道。

發明內容
本發明的目的為克服上述雞胚培養的技術缺陷，提供一種應用生物反應器工業化 生產動物流感滅活疫苗的方法。與其它生產工藝相比，本生產工藝通過應用14L 150L生物反應器和2 25g/L高密度微載體技術，大規模連續灌注培養高密度宿主細胞，收獲病毒 HA效價達到21°以上，經超濾濃縮、純化、配苗，制備優質動物流感滅活疫苗和/或多價苗和
/或多聯苗。
本發明的技術方案為應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法，其特征 在于包括如下步驟(1)將攪拌式生物反應器和Cytodex系列微載體經滅菌后，加入細胞生 長液，接種Vero或MDCK細胞培養；待微載體上的Vero或MDCK細胞形成致密的單層，接種 禽流感病毒，并繼續培養擴增病毒；( 待細胞病變達到80%以上時，收獲病毒液；C3)將上 述收獲的病毒液用100KD或300KD截留分子量的超濾膜包濃縮10 50倍，按滅活劑與病毒 濾液的體積比為1 4000的加入β-丙內酯或按滅活劑與病毒濾液的體積比為1 1000 的質量濃度為37%甲醛溶液進行滅活后，再按佐劑與滅活的病毒液的體積比為1 2加入 納米鋁佐劑，配制成流感滅活疫苗。
所述Vero或MDCK細胞接毒后在無血清培養基中培養，同時，在培養基中添加終濃 度1 8yg/ml的胰酶。
所述微載體的使用濃度為2g/L 25g/L。
流感病毒接種量為0. 1 0. 000IMOI。
所述流感病毒為禽流感病毒或豬流感病毒。
所述的攪拌式生物反應器容積為14L 150L，制苗用細胞經過14L 40L 150L 逐級放大培養后，即通過胰酶將14L生物反應器培養的細胞消化下來，作為種子細胞接種 到40L生物反應器，再將40L反應器內培養的細胞消化下來作為種子細胞接種到150L生物 反應器，如此形成生物反應器之間的逐級放大培養過程，從而避免了單純的用轉瓶培養種 子細胞而容易造成污染和增加勞動強度的缺陷；或直接用14L、40L或150L的攪拌式生物反 應器培養病毒。
攪拌式生物反應器的培養采用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細 胞的密度為0. 5 4個工作體積/天；
所述的攪拌式生物反應器設定參數為pH 6. 5 7. 6、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌速度40 lOOrpm。考慮到細胞培養的最適條件，優選的pH 6. 8 7. 2、細胞培 養階段溫度設定37°C，病毒培養階段溫度設定35°C、溶氧50%、攪拌速度30 lOOrpm。
制苗用細胞為MDCK細胞，原則上只要是適合于培養禽流感病毒的細胞均可以采 用以上方案實施，優選的采用犬腎細胞系(MDCK)、非洲綠猴腎細胞系(Vero)。
本發明具有工藝參數可控性好，細胞密度高，病毒效價高，生產效率高，勞動強度 低等優點。利用本發明生產的動物流感疫苗安全性好，質量穩定可靠，副反應減小，免疫效 力高，對流感野毒攻擊具有較好的免疫保護作用。


圖1為本發明的實施例1的工藝流程圖。
圖加為細胞接種后4h的微載體細胞圖片。
圖2b為細胞接種后3d的微載體細胞圖片。
圖2c為細胞接毒后40h病變的微載體細胞圖片
圖3為本發明的細胞生長曲線。
具體實施方式
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，按照常規實驗方法進行。
實施例1
生物反應器美國NBS公司14L 40L生物反應器；
微載體=Cytodex-I (美國通用電氣醫療集團生命科學部)；
病毒H9N2亞型禽流感病毒ZBl株；
細胞生長液含體積濃度8%血清的DMEM培養基(北京清大天一生物技術有限公 司)；
細胞維持液含1 μ g/ml胰酶的DMEM培養基(北京清大天一生物技術有限公 司)；
細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodex-Ι，水化后， 用pH7. 2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗幾遍，滅菌后加入細胞生長液，接種MDCK細胞，進行培 養。培養的方法參數為pH7. 2、溫度37°C、溶氧50%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時取 樣觀察細胞生長情況，進行細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到1. 5 X 106/ml 時開始灌注，灌注的速度依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個工作體積，以維 持細胞的生長，培養4天，細胞的密度達到6X 106/ml。
微載體培養的放大待14L生物反應器細胞密度達到6X106/ml，將長滿細胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度0. 02% EDTA, pH7. 2的PBS緩沖液清洗細胞 兩次，加入37°C預熱的含質量濃度0. 02% EDTA、質量濃度0. 25%胰酶的胰酶消化液，消化 15min，排出多余的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘余胰酶的消化，啟動容器攪拌使其充 分分散消化的細胞，然后將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反應器，按照上述的培 養方法進行培養。
病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到8X106/ml，更換為細胞維持液，按 照0. 001M0I接種H9N2亞型禽流感病毒；接毒后他開始灌注培養，以維持病毒繁殖必需的 營養物質，待細胞病變達到80%以上時，同時收獲病毒液，測定病毒含量HA效價21(1，將收獲 的病毒液根據需要置于2°C 8°C中，或保存在-20°C。
制備疫苗將上述收獲的病毒液用100KD截留分子量的超濾膜包濃縮10倍，按滅 活劑與病毒濾液的體積比為1 4000的加入β-丙內酯進行滅活后，按佐劑與滅活的病毒 液的體積比為1 2加入的納米鋁佐劑，配制成禽流感滅活疫苗。
實施例2
生物反應器美國NBS公司14L 40L生物反應器
微載體=Cytodex-I (GE生命科學請寫出全稱)
病毒豬流感病毒Hmi亞型
細胞生長液含質量濃度8%血清的Μ199培養基
細胞維持液含1 μ g/ml胰酶的M199培養基
細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodex-Ι，水化后，用pH7. 2的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗幾遍，滅菌后加入細胞生長液，接種Vero細胞，進行培 養。培養的方法參數為pH7. 2、溫度37°C、溶氧50%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時取 樣觀察細胞生長情況，進行細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到1. 5 X 106/ml 時開始灌注，灌注的速度依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個工作體積，以維 持細胞的生長，培養4天，細胞的密度達到6X 106/ml。
微載體培養的放大待14L生物反應器細胞密度達到6X106/ml，將長滿細胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度0. 02% EDTA pH7. 2的PBS緩沖液清洗細胞 兩次，加入37°C預熱的含質量濃度0. 02% EDTA、質量濃度0. 25%胰酶的胰酶消化液，消化 IOmin,排出多余的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘余胰酶的消化，啟動容器攪拌使其充 分分散消化的細胞，然后將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反應器，按照上述的培 養方法進行培養。
病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到7X106/ml，更換為細胞維持液，按 照0. 001M0I接種Hmi豬流感病毒；接毒后M1開始灌注培養，以維持病毒繁殖必需的營養 物質，待細胞病變達到80%以上時，同時收獲病毒液，收獲病毒液，測定病毒含量HA效價 21(1，將收獲的病毒液根據需要置于2°C 8°C中，或保存在-20°C。
制備疫苗將上述收獲的病毒液用100KD截留分子量的超濾膜包濃縮10倍，按滅 活劑與病毒濾液的體積比為1 1000的加入質量濃度為37%甲醛溶液進行滅活后，按佐劑 與滅活的病毒液的體積比為1 2加入的納米鋁佐劑，配制成豬流感滅活疫苗。
權利要求
1.應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟(1) 將攪拌式生物反應器和Cytodex系列微載體經滅菌后，加入細胞生長液，接種Vero或MDCK 細胞培養；待微載體上的Vero或MDCK細胞形成致密的單層，接種流感病毒，并繼續培養擴 增病毒；( 待細胞病變達到80%以上時，收獲病毒液；C3)將上述收獲的病毒液用100KD 或300KD截留分子量的超濾膜包濃縮10 50倍，按滅活劑與病毒濾液的體積比為1 4000 的加入β-丙內酯或按滅活劑與病毒濾液的體積比為1 1000的質量濃度為37%甲醛溶 液進行滅活后，再按佐劑與滅活的病毒液的體積比1 2加入納米鋁佐劑，配制成流感滅活 疫苗。
2.根據權利要求
1所述的應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法，其特征在 于所述的細胞接毒后在無血清培養基中培養，同時，在培養基添加濃度1 8μ g/ml的胰 酶。
3.根據權利要求
1所述的應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法，其特征在 于所述微載體的使用濃度為2g/L 25g/L。
4.根據權利要求
1所述的應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法，其特征在 于流感病毒接種量為0. 1 0. 0001M0L·
5.根據權利要求
1 4之一所述的應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法， 其特征在于所述流感病毒為禽流感病毒或豬流感病毒。
6.根據權利要求
1 4之一所述的應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法， 其特征在于所述的攪拌式生物反應器容積為14L 150L，制苗用細胞經過14L 40L 150L逐級放大培養后，于150L生物反應器培養流感病毒；或直接用14L、40L或150L的攪 拌式生物反應器培養病毒。
7.根據權利要求
1-4之一所述的應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法，其 特征在于攪拌式生物反應器的培養采用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細 胞的密度為0. 5 4個工作體積/天。
8.根據權利要求
1-4之一所述的應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法，其 特征在于所述的攪拌式生物反應器設定參數為pH6. 5 7. 6、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌速度40 lOOrpm。
專利摘要
本發明涉及一種應用生物反應器工業化生產動物流感疫苗的方法，該方法包括如下步驟(1)Vero或MDCK細胞接入經滅菌的含微載體的生物反應器，在含血清培養基中進行培養；(2)將生物反應器內含血清培養基置換為含胰酶的無血清培養基；(3)接種動物流感病毒繼續培養；(4)待細胞病變達到80％以上時，收獲得到細胞培養的流感病毒原液；(5)將流感病毒原液經超濾濃縮、滅活、添加佐劑制得流感滅活疫苗。本發明具有工藝參數可控，細胞密度高，病毒效價高，生產效率高，勞動強度低等優點。本發明生產的流感疫苗安全性好，質量穩定可靠，副反應減小，免疫效力高，對流感野毒攻擊具有較好的免疫保護作用。
文檔編號C12R1/93GKCN102133398SQ201010282155
公開日2011年7月27日 申請日期2010年9月15日
發明者劉漢平, 彭杏, 李偉, 李晶梅, 溫文生, 漆世華, 秦紅剛, 靖志強 申請人:武漢中博生物股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan