專利名稱:應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法
技術領域：
本發明屬于獸用生物制品技術領域：
，具體涉及一種應用生物反應器工業化生產偽 狂犬病疫苗的方法。
背景技術：
豬偽狂犬病(Pseudorabies，Pr)，是由皰疹病毒科豬皰疹病毒I型偽狂犬病毒引 起的傳染病。我國將其列為二類動物疫病。偽狂犬病已呈世界流行，在我國也廣泛存在，許 多規模化養豬場均使用偽狂犬病疫苗來預防和控制該病。
目前偽狂犬病疫苗的生產主要是采用傳統的轉瓶工藝，即偽狂犬病毒接種已形成 單層的細胞，培養后一次性收獲病毒液。但是每個轉瓶均是獨立的細胞培養單元，每瓶細胞 的質量、病毒產量和滴度都不同，導致疫苗批間差異大，而且操作勞動強度大，生產效率低， 隱性污染引起的高內毒素等缺點，已經越來越不適應當前疫苗大規模生產的要求。
專利公開號為CN101695573A的專利申請，公開了一種應用利用傳代細胞源生產 偽狂犬病活疫苗的方法，其傳代細胞為ST細胞、PK-15和IBRS-2細胞，生產工藝為轉瓶工 藝；專利公開號為CN101695572 A的專利申請，公開了一種應用生物反應器生產偽狂犬活 疫苗的方法，其生物反應器為TideCell固定床微載體生物反應器。但是利用攪拌式生物反 應器，采用逐級放大的倒罐式操作技術，進行細胞的高密度培養以制備疫苗，未見報道。
發明內容
本發明的目的為了克服偽狂犬病疫苗現有生產工藝的缺陷，提供了一種應用生物 反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，其優點是設備占地面積小、生產規模大；培養速度 快、生產效率高；生產機械化，易于自動控制；培養設備密閉，不易污染；副產物少，疫苗的 副反應小；生產的病毒液效價高，與傳統的轉瓶工藝相比，收獲的病毒液滴度提高了 0. 5 1. 5個IogTCID5ciAil，疫苗質量穩定。
本發明的技術方案為
—種應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，其特征在于包括如下步 驟(1)用微載體培養制苗用細胞將微載體和生物反應器經滅菌后，接種制苗用細胞，進 行培養，待微載體上的細胞形成致密的單層，接種偽狂犬病毒，并繼續培養，使病毒繁殖，所 述的制苗用細胞為對偽狂犬病病毒毒株敏感的細胞，且為豬睪丸細胞系(ST)、豬腎細胞系 (PK-15)細胞或乳倉鼠腎細胞(BHK-21) ； (2)每天按時取樣觀察細胞病變情況，待細胞病變 達到80%以上時，停止培養，收獲病毒液制得偽狂犬病活疫苗；或將收獲的病毒液滅活后 制成滅活疫苗。
病毒的接種量為0. 001 IMOI。
所述的生物反應器設定參數為pH 6. 5 7. 8、溫度33 37°C、溶氧30 80%、 攪拌速度30 lOOrpm。考慮到細胞培養的最適條件，優選的pH 7. 0 7. 4、細胞培養階段 溫度設定37°C，病毒培養階段溫度設定35°C、溶氧50%、攪拌速度30 lOOrpm。[0010]所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2 25g/L。
所述的生物反應器為攪拌式生物反應器。
所述的生物反應器容積為14 150L。制苗用細胞可采用14L 40L或14L 40L 150L逐級放大的培養模式，即通過胰酶將14L生物反應器培養的細胞消化下來，作為 種子細胞接種到40L的生物反應器，再將40L的反應器內培養的細胞消化下來作為種子細 胞接種到150L生物反應器，如此形成生物反應器之間的逐級放大培養過程，從而避免了單 純的用轉瓶培養種子細胞而容易造成污染和增加勞動強度的缺陷；或，直接用14L、40L或 150L生物反應器培養病毒。
所述的生物反應器的培養采用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細 胞的密度以每天0. 5 4個工作體積。
偽狂犬病毒可以是制苗用的強毒株，用來制備滅活苗；也可以是制苗用弱毒株，制 備弱毒活疫苗。
本發明采用生物反應器微載體培養技術進行細胞的高密度培養，生產偽狂犬病 疫苗，與傳統的轉瓶生產工藝相比，自動化控制程度高，生產可實時監控；節省人力，降低 成本；生產用地少，規模易于擴大；生產的病毒滴度高，批間差異小，產品質量穩定，副反應


圖Ia為細胞接種后池的微載體細胞圖片。
圖Ib為細胞接種后5d的微載體細胞圖片。
圖Ic為細胞接毒后病變的微載體細胞圖片。
圖2為細胞生長曲線。
具體實施方式
以下是本發明一個具體的實施方案，以進一步的闡述本發明，但不能解釋為限制 本發明的范圍。
實施例一生物反應器美國NBS公司14L和40L生物反應器，生物反應器設定參 數為pH 7. 2、溫度37°C、溶氧50%、攪拌速度30 IOOrpm ；
微載體通用電氣醫療集團生命科學部Cytodexl ；
偽狂犬病毒Bartha_K61株；
細胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公 司)；
病毒維持液含體積濃度為小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公 司)；
細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodex-Ι，水化后， 用pH7. 4的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗幾遍，滅菌，接種ST細胞，進行培養；每天定時取樣觀察 細胞生長情況，進行細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到1. 5 X 106/ml時，開始 灌注，灌注的速度依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個工作體積，以維持細胞 的生長，培養4d，細胞的密度達到6 X 106/ml。[0027]微載體培養的放大待14L生物反應器細胞的密度達到6X 106/ml，將長滿細胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度為0. 02% EDTA的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液PBS 緩沖液清洗細胞兩次，加入37°C預熱的含質量濃度為0. 02% EDTA、質量濃度為0. 25%胰酶 的胰酶消化液，消化lOmin，排出多余的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘余胰酶的消化， 啟動容器攪拌使其充分分散消化的細胞，然后將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反 應器，按照上述的培養方法進行培養。
病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到7X 106/ml，排出細胞生長液并更換 成病毒維持液，按照0. 05M0I接種偽狂犬病毒；接毒后他開始灌注培養，以維持病毒繁殖所 必需的營養物質，同時收獲病毒液，待細胞病變達到80%以上時，停止培養，測定病毒含量 為9. 41ogTCID5(1/ml，將收獲的病毒液置于2 8°C中，或保存在_20°C。
制備疫苗將上述收獲的病毒液按病毒液與凍干保護劑的體積比為1 2加入質 量濃度為5%蔗糖脫脂乳凍干保護劑，制備成凍干活疫苗。
實施例二 生物反應器美國NBS公司14L和40L生物反應器，生物反應器設定參 數為pH 7. 2、溫度37°C、溶氧50%、攪拌速度30 IOOrpm ；
微載體=Cytodexl (通用電氣醫療集團生命科學部)；
偽狂犬病毒鄂A強毒株
細胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM/F12(北京清大天一生物技術有 限公司)；
病毒維持液含體積濃度為小牛血清的DMEM/F12(北京清大天一生物技術有 限公司)；
細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodexl，水化后， 用pH7. 4的磷酸鹽緩沖液PBS淘洗幾遍，滅菌，接種ST細胞，進行培養；每天定時取樣觀察 細胞生長情況，進行細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到1. 5 X 106/ml時，開始 灌注，灌注的速度依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個工作體積，以維持細胞 的生長，培養4d，細胞的密度達到6 X 106/ml。
微載體培養的放大待14L生物反應器細胞的密度達到6X 106/ml，將長滿細胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度0. 02% EDTA的pH7. 2的磷酸鹽緩沖液PBS緩 沖液清洗細胞兩次，加入37°C預熱的含質量濃度0. 02% EDTA、質量濃度0. 25%胰酶的胰酶 消化液，消化8min，排出多余的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘余胰酶的消化，啟動容器 攪拌使其充分分散消化的細胞，然后將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反應器，按 照上述的培養方法進行培養。
病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到7X 106/ml，排出細胞生長液并更換 成病毒維持液，按照0. 05M0I接種偽狂犬病毒；接毒后他開始灌注培養，以維持病毒繁殖所 必需的營養物質，同時收獲病毒液，待細胞病變達到80%以上時，結束培養，測定病毒含量 為9. 01ogTCID5(1/ml，將收獲的病毒液置于2 8°C中，或保存在_20°C。
制備疫苗將上述收獲的病毒液滅活后，按抗原和油佐劑1 1比例加入油佐劑， 乳化配制成滅活疫苗。油佐劑的配制為94% (V/V)白油、6% (V/V) ^Span-80,2% (g/V) 硬脂酸鋁。
權利要求
1.一種應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)用微載體培養制苗用細胞將微載體和生物反應器經滅菌后，接種制苗用細胞，進行 培養，待微載體上的細胞形成致密的單層，接種偽狂犬病毒，并繼續培養，使病毒繁殖，所 述的制苗用細胞為對偽狂犬病病毒毒株敏感的細胞，且為豬睪丸細胞系(ST)、豬腎細胞系 (PK-15)或乳倉鼠腎細胞系(BHK-21) ； (2)待細胞病變達到80%以上時，停止培養，收獲病 毒液制得偽狂犬病活疫苗；或將收獲的病毒液滅活后制成滅活疫苗。
2.根據權利要求
1所述應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，其特征在 于病毒的接種量為0. 001 IMOI。
3.根據權利要求
1所述應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，其特征在 于所述的生物反應器設定參數為pH 6. 5 7. 8、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌速 度 30 lOOrpm。
4.根據權利要求
1 3之一所述應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，其 特征在于所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2 25g/L。
5.根據權利要求
1 4之一所述應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，其 特征在于所述的生物反應器為攪拌式生物反應器。
6.根據權利要求
1 5之一所述的應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法， 其特征在于所述的生物反應器容積為14 150L ；或，制苗用細胞經過14L 40L或14L 40L 150L逐級放大培養后，于40L或150L生物反應器培養偽狂犬病毒；或，直接用14L、 40L或150L的生物反應器培養病毒。
7.根據權利要求
1 6之一所述應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，其 特征在于所述的生物反應器的培養采用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細 胞的密度為每天0. 5 4個工作體積。
專利摘要
本發明涉及一種應用生物反應器工業化生產偽狂犬病疫苗的方法，包括如下步驟(1)將微載體和生物反應器經滅菌后，接種制苗用細胞，進行培養，待微載體上的細胞形成致密的單層，接種偽狂犬病毒，并繼續培養，使病毒繁殖；(2)待細胞病變達到80％以上時，停止培養，收獲病毒液制得偽狂犬病疫苗。本發明采用生物反應器微載體培養技術進行細胞的高密度培養，生產偽狂犬病疫苗，與傳統的轉瓶生產工藝相比，自動化控制程度高，生產可實時監控；節省人力，降低成本；生產用地少，規模易于擴大；生產的病毒滴度高，批間差異小，產品質量穩定，副反應小。
文檔編號C12R1/93GKCN102038946SQ201010282142
公開日2011年5月4日 申請日期2010年9月15日
發明者劉漢平, 李偉, 溫文生, 漆世華, 王楨楨, 秦紅剛, 肖敏 申請人:武漢中博生物股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan