專利名稱：一種大電導鈣激活鉀通道阻斷劑－Martentoxin及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體的說，本發明描述了一種天然活性多肽——大電導鈣激活鉀通道阻斷劑Martentoxin，它的氨基酸序列，編碼該活性多肽的核苷酸序列，Martentoxin與大鼠腦突觸體膜鉀通道標本結合與競爭的藥理特性，以及Martentoxin阻斷大鼠腎上腺嗜鉻細胞大電導鈣激活鉀通道的效應，本發明還涉及該活性多肽的純化，克隆Martentoxin基因的方法，利用大分子相互作用實時分析系統研究Martentoxin同大鼠腦突觸體膜鉀通道標本結合與競爭的方法，利用全細胞膜片鉗研究Martentoxin與大鼠腎上腺嗜鉻細胞大電導鈣激活鉀通道作用的方法。
背景技術：
幾乎各種器官的所有細胞中，都存在有鉀通道[Genome.Biol.1，REVIEWS0004(2000)]。除了幾個顯著的共同特征，這些鉀通道在結構和功能上都有著很大的變異。其主要功能為控制鉀離子流，細胞體積，激素及遞質的釋放，靜息電位和神經、肌肉的興奮性。已有多種化學配體用來研究鉀通道的調控機制；其中，高親和力的天然毒素作為十分有價值的工具物被用來鑒定通道的藥理和電生理信號轉導。直到現在，已有一大類同源的神經毒素多肽被分離和鑒定。這些天然多肽通過在胞外堵塞入口小孔，抑制了離子通過鉀通道的流動[Annu.Rev.Neurosci.20，91-123(1997)]。
在過去的30年中，關于蝎毒素的大量研究表明，其中一類能夠特異地影響各種離子通道活性并改變其功能特性[Handbook ofneurotoxicology(Chang，L.W.& Dyer，R.S.，eds)Marcel Dekker Inc.，New York.683-716(1995)]。它們多數已被驗明是特異阻斷鉀通道的短鏈多肽，通常由28-42個氨基酸組成，分子內含有3到4個二硫鍵[J.Bioenerg.Biomembr.23，615-46(1991)]。這些阻斷劑和鉀通道孔道的相互作用已被用來研究鉀通道的結構和功能。由于鉀通道的多樣性，已引起了對蝎毒素研究的廣泛關注，并期望發現更高選擇性的通道配體物質。同時，根據靶鉀通道亞型和結構特性的不同，鉀通道阻斷劑的分類越來越復雜a)作用于大電導鈣激活鉀通道(BKCa)和/或Kvl.3通道的毒素，如iberiotoxin(IbTX)和charybdotoxin(ChTX)，其特點為在N末端有一個多聚谷氨酰胺，它們的序列同源性為60-70％[J.Biol.Chem.265，11083-11090(1990)；J.Biol.Chem.265，15564-15571(1990)]；b)作用于中電導鈣激活鉀通道(IKCa)和電壓依賴型鉀通道(Kv)的毒素，如kaliotoxin(KTX)和agitoxin(AgTX)，它們之間有78-89％的同源性[J.Biol.Chem.267，1640-1647(1992)；Biochemistry 33，6834-6839(1994)]；c)作用于電壓依賴型鉀通道(Kv)的毒素，如noxiustoxin(NTX)，margatoxin(MgTX)和CllTXl，它們有64-79％的同源性[Carlsberg Res.Commun.47，285-289(1982)；J.Biol.Chem.268，18866-18874(1993)；Biochem.J.304，51-56(1994)]；d)另一類作用于電壓依賴型鉀通道(Kv)的毒素，如maurotoxin(MTX)，Pi1，Pi2和Pi3，它們之間的序列同源性為54-64％且都有4對二硫鍵[Eur.J.Biochem.242，491-498(1996)；J.Membr.Biol.152，49-56(1996)]。e)高親和力地(IC50＜1nM)與apamin敏感的小電導鈣激活鉀通道(SKCa)結合的毒素，如P05[FEBSLett.320，189-192(1993)]。
東亞鉗蝎Buthus martensi Karsch(BmK)廣泛分布于中國淮河以北至蒙古和朝鮮地區。目前已從東亞鉗蝎粗毒中分離和鑒定了數種特異作用于鈉通道的長鏈調制劑，它們被分別命名為BmK I，BmK II，BmK IT，BmK IT2，BmKAS，BmK AS-1和BmK abT[Toxicon 34，987-1001(1996)；Toxicon 37，519-536(1999)；FEBS lett.479，136-140(2000)；Neuropharmacology.3，352-357(2001)]，7個特異作用于鉀通道的短鏈阻斷劑，它們被分別命名為BmTX1，BmTX2，BmKTX，BmP01，BmP02，BmP03和BmP05[Biochemistry 36，13473-13482(1997)；Eur.J.Biochem.245，457-464(1997)；Regulatory Peptides.1-3，85-92(2000)]。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種純化的大電導鈣激活鉀通道阻斷劑Martentoxin。
本發明的另一目的是提供編碼Martentoxin活性多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供從東亞鉗蝎粗毒中純化Martentoxin的方法。
本發明的另一目的是提供從東亞鉗蝎基因庫中克隆Martentoxin基因的方法。
本發明的進一步目的在于提供一個利用Martentoxin作為研究鉀通道組成、電和生物化學特性以及與鉀通道相關的生理和病理現象的便利而有用工具的方法。
本發明涉及一種分離的多肽，經分子篩凝膠過濾、離子交換柱層析和高效液相色譜，從東亞鉗蝎粗毒中分離純化的活性多肽，由該多肽蛋白測序部分氨基酸序列<210.>1，設計引物克隆出Martentoxin的全序列，推導出成熟的Martentoxin由37個氨基酸<210>2組成，其分子量經質譜鑒定為4060道爾頓，其等電點經IEF Standards測定為9.5。
利用VNTIsuite 5.5 biosoftware(Informax，USA)進行序列分析比較發現，Martentoxin的氨基酸序列<210>2與已知的大多數短鏈鉀通道配體毒素多肽(包括ChTx類，KTx類，NTx類)的序列同源性為39％-50％，與另兩個毒素多肽TmTX和Lqh15-1的序列同源性較高，分別為73％和75％。
本發明還涉及了一種從東亞鉗蝎基因庫中克隆的多核苷酸，即編碼具有<210>2氨基酸序列的多核苷酸，該多核苷酸序列是具有<210>7的核苷酸序列，通過序列分析比較發現，<210>7的核苷酸序列與已知的短鏈鉀通道配體毒素多肽(包括ChTx類，KTx類，NTx類)的編碼核苷酸序列在結構上有明顯差異，即<210>7在編碼區上游存在一個其它相關核苷酸序列不存在的內含子序列——內含子1(參圖2b)。
本發明還涉及了一系列Martentoxin的功能特性，包括利用生物大分子相互作用實時分析系統(BIAcore)鑒定了Martentoxin與大鼠腦突觸體結合的動力學特征及Martentoxin與幾個已知鉀通道配體(ChTx，apamin，TSN，BmP03)結合大鼠腦突觸體鉀通道的競爭關系；利用膜片鉗全細胞記錄觀察了Martentoxin阻斷大鼠腎上腺嗜鉻細胞全細胞大電導鈣激活鉀電流的電生理特性等。
綜合BIAcore和膜片鉗的結果，發現Martentoxin對大電導鈣激活鉀通道具有極強的阻斷性和高度的選擇性，與常用實驗室工具藥ChTx的作用一致；利用BIAcore測定的數據還表明，Martentoxin與大鼠腦突觸體結合的解離時間速率比ChTx高，由此可知，Martentoxin與大電導鈣激活鉀通道的結合更加牢固。
本發明的活性多肽可以通過分子凝膠過濾，離子交換柱層析和高效液相色譜，從東亞鉗蝎粗毒中分離提純，也可以通過基因克隆表達的方法生產這種多肽。
從東亞鉗蝎粗毒中分離提純該多肽是這樣完成的首先，將東亞鉗蝎粗毒溶解于1-4摩爾/升醋酸溶液中，0-10攝氏度10000-15000rpm高速離心10-20分鐘，取上清液于凝膠柱中進行分子篩柱層析分離。繼之，利用離子交換柱層析和高效反相色譜進行反復純化，直至最后得到一個單峰，該單一的蛋白質組分就是本發明的Martentoxin。
毒素的純度和分子量經電噴霧質譜儀進行鑒定，分子量為4060道爾頓，并用蛋白質測序儀進行Edman自動降解測序，測得該多肽的氨基酸序列。用IEF Standards測定毒素的等電點為9.5經由上述鑒定后，確定了該多肽的序列和性質，據此，可以通過基因克隆的方法克隆本發明的多肽。利用TRIZOL試劑和Wizard DNA純化試劑盒，從東亞鉗蝎的毒腺中提取Martentoxin的總RNA和總基因DNA。將提取的總RNA反轉錄為cDNA，在3′RACE中作為模板。根據天然毒素N末端的部分殘基序列，設計引物，將天然東亞鉗蝎毒素的cDNA擴增。在3’RACE決定的部分序列的基礎上，設計和合成反義引物。擴增的PCR片段被純化并直接連接到pGEM-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α。重組質粒用T7引物在ABI PRISM 377 DNA序列儀中自動測序。
在確定了Martentoxin及其編碼基因結構特征的基礎上，進一步利用BIAcore技術鑒定它與大鼠腦突觸體膜鉀通道的結合及競爭特性。以成年雄性Wistar大鼠制備腦突觸體膜。突觸體膜的濃度以牛血清白蛋白(BSA)作為標準蛋白，采用Bio-Rad蛋白分析法進行蛋白濃度測定。配體—受體相互作用和競爭結合分析在Pharmacia公司的BIAcore上進行。以N-ethyl-N-dimethyl aminepropyl)-carbdiimide和N-hydroxysuccimide溶液活化實驗中使用的CM5芯片。Martentoxin溶解于醋酸鈉后固定于芯片上。BIAcore動力學結合分析流程如下首先，不同濃度的腦突觸體膜流經被固定的Martentoxin，然后，以一定濃度的腦突觸體膜為對照，將Apamin，BmP03，ChTX，Toosendanin(川楝素TSN)與大鼠腦突觸體膜孵育，然后流經固定有Martentoxin的芯片。結合和解離常數用BIA Evaluation 1.0和2.0軟件包分析。
在鑒定了Martentoxin與鉀通道的結合及競爭特性后，運用全細胞膜片鉗方法進一步確定Martentoxin對大鼠腎上腺嗜鉻細胞大電導鈣激活鉀通道的阻斷效應。將成年Wistar大鼠腎上腺嗜鉻細胞經酶解得到單細胞，這些細胞在CO2培養箱中用DMEM經1-4天的培養，用于實驗。運用制真菌素打孔電壓鉗技術，電壓門控膜電流在全細胞電壓鉗條件下得以記錄。通過多通道微灌注系統記錄，對照/沖洗用液和毒素吹打在細胞上。NG108-15細胞在35毫米塑料培養皿中進行培養。從成年大鼠的背根神經節中分離得到背根神經元。利用全細胞電壓鉗記錄NG108-15細胞和背根神經元的全細胞鉀電流，通過重力加藥系統給予正常外液和毒素。
本發明有著如下的效果本發明提供了純化的Martentoxin。
本發明同時還提供了可得到高純度Martentoxin的純化方法。
本發明提供了Martentoxin的氨基酸序列。通過序列分析比較發現，該多肽氨基酸序列<210>2與已知的大多數短鏈鉀通道配體毒素多肽(包括ChTx類，KTx類，NTx類)的序列同源性為39％-50％，與兩個毒素多肽TmTX和Lqh15-1的序列同源性較高，分別為73％和75％。可以依據本發明確定的Martentoxin的氨基酸序列，化學合成或基因重組Martentoxin及其類似多肽。
本發明提供了Martentoxin完整的cDNA序列，與其它鉀通道配體毒素多肽的cDNA序列比較，有嶄新的發現。解析Martentoxin的基因譜，發現其分子中有兩個內含子，一個(91bp)與其它所有已知蝎毒素多肽一樣，座落在靠近信號肽的C-端區，另一個(83bp)卻與眾不同地座落在5’UTR區。由于增加一個內含子可以顯著性地改變編碼區的拓撲結構，從而影響基因轉錄的方式和效率，因此Martentoxin的編碼基因是一個新型的短鏈蝎毒素基因，屬于短鏈蝎毒素基因庫中一個新型的組群。
本發明提供了得到Martentoxin完整的cDNA序列的克隆方法，并提供了通過基因工程表達Martentoxin的基礎。
本發明在鑒定的Martentoxin及其編碼基因結構和特征的基礎上，進一步提供了Martentoxin作用于鉀通道標本的功能特性如下本發明提供了Martentoxin與大鼠腦突觸體膜鉀通道標本結合的解離常數為4.72±1.54×10-10摩爾/升，說明Martentoxin與腦型鉀通道具有極強的親和性和強烈的作用。
本發明提供了Martentoxin與大鼠腦突觸體膜鉀通道標本結合的動力學參數。Martentoxin與大鼠腦突觸體膜的結合速率常數約為1.67×104摩爾/升-1秒-1，與一個已被商品化的特異作用于鉀通道的短鏈蝎毒素多肽charybdotoxin(約為7.5×108摩爾/升-1秒-1)相比，Martentoxin可快速地與大鼠腦突觸體膜鉀通道標本結合；Martentoxin與大鼠腦突觸體膜的解離速率常數約為5.50×106秒-1，與charybdotoxin(約為1.95×10-2秒-1)相比，Martentoxin與大鼠腦突觸體膜鉀通道標本解離非常慢。以上數據說明Martentoxin對鉀通道的結合作用強于charybdotoxin。
本發明提供了Martentoxin對大鼠腎上腺嗜鉻細胞大電導鈣激活鉀通道的阻斷作用。100納摩爾/升Martentoxin具有與等量charybdotoxin相同的藥理功效，即可有效地壓抑大鼠腎上腺嗜鉻細胞約70％的大電導鈣激活的鉀電流，且其阻遏效應是可逆的。由此可見，Martentoxin是一種強烈的大電導鈣激活鉀通道的阻斷劑。
本發明提供了Martentoxin對大電導鈣激活鉀通道的選擇性作用。在Martentoxin與大鼠腦突觸體鉀通道標本的結合競爭實驗中，50微摩爾/升charybdotoxin可以抑制45.59％的Martentoxin結合，同樣濃度的apamin(歐洲短鏈蜂毒素小肽，特異作用于小電導鈣激活鉀通道)和BmP03(另一個來自同種蝎毒的短鏈肽類毒素，可選擇性地阻遏一種電壓門控鉀通道—短暫外向鉀通道)則只有輕微的抑制，分別為6.72％和15.49％。
另一方面，在膜片鉗全細胞記錄中，100納摩爾/升Martentoxin具有與等量charybdotoxin相同的藥理功效，即可有效地壓抑大鼠腎上腺嗜鉻細胞約70％的大電導鈣激活的鉀電流，但即使在給藥劑量高達300納摩爾/升的條件下，Martentoxin僅可分別壓抑NG 108-15細胞和大鼠背根神經約10％的電壓門控鉀電流。以上數據清楚表明，Martentoxin是一種選擇性作用于大電導鈣激活鉀通道的阻斷劑。
因此，本發明的Martentoxin是一個新型的功能特異的大電導鈣激活鉀通道阻斷劑。可作為實驗用大電導鈣激活鉀通道的選擇性阻斷劑。可為探討鉀通道的組成、電和生物化學信號特征增添新的有力探針工具物。可作為調節和治療鉀通道相關生理和病理現象的潛在調制劑或藥品。Martentoxin的氨基酸序列和核苷酸序列可作為化學合成以及基因重組工程表達該類多肽的基礎。


圖1a為BmK粗毒的分子篩圖譜。將500毫克BmK粗毒Sephadex G-50凝膠柱(2.5×120厘米)層析分離。層析柱經平衡并由0.05摩爾/升、pH 7.5的鹽酸洗脫。洗脫的流速為12毫升/小時，5毫升/管。
圖1b為組分F-4的離子交換層析圖。取200毫克圖1(a)的F-4組分在CM Sephadex C-50凝膠柱(2×100厘米)上的離子交換層析。層析柱經平衡并分別由0.01摩爾/升、0.05摩爾/升、0.1摩爾/升、0.25摩爾/升和0.5摩爾/升的NH4HCO3緩沖液洗脫。流速為30毫升/小時，5毫升/管。
圖1c為組分F-4-7的HPLC圖譜。用0.1％TFA和60％7睛進行梯度洗脫，25℃條件下1毫升/分鐘。
圖1d為組分F-4-7-0(Martentoxin)的質譜鑒定和等電點測定圖(電泳圖)。左邊為Martentoxin的質譜鑒定圖，右邊為等電點測定圖。等電點測定圖中的條帶1為Martentoxin，條帶2是標樣a)細胞色素c；b)扁豆凝集素；c)人血紅蛋白C；d)人血紅蛋白A；e)馬肌血球素；f)人碳酸酐酶；g)牛碳酸酐酶；h)β-乳球蛋白B；I)藻青蛋白。
圖2a為Martentoxin的全基因序列圖，圖2b為Martentoxin的基因編碼圖。由Martentoxin cDNA推測得其前體氨基酸序列。N-末端的26個殘基是通過Edman降解測定得。外顯子和內含子分別用大寫和小寫表示。成熟多肽用粗體標明。P1、P2為3’RACE，5’RACE的引物，P3，P4為Martentoxin基因擴增的引物。P1、P2、P3和P4一側的箭頭表示作用的方向，P1和P2下面標有下劃線的為與P1和P2引物相匹配的核苷酸片段，P3、P4下面標有打點標記的為與P3、P4引物相匹配的核苷酸片段，aataa(下用兩條線表明)可能為多肽的Poly(A)信號。Sp單鏈；MP成熟多肽。
圖3為Martentoxin與其它蝎毒素鉀通道阻斷劑的氨基酸序列同源性比較圖。如圖，這些序列是根據它們共有的六個半胱氨酸(粗體字母)來比對的，為了優化比對，我們引入了空位。其中AgTX1(agitoxins)、ChTX(charybdotoxin)、Lqh15-1純化自Leiurusquinquest-riatusvar Hebraeus；BmTx1、BmTx2、BmKTx純化自Buthus martensi Karsch；CllTX1純化自Centmroides limpidus lirmpidus；
NTX(noxiustoxin)純化自Centruroides noxiusHoffmann；LbTX(limbatotoxin)純化自Centruroides limbatus；IbTX(iberiotoxin)、TmTX(tamulotoxin)純化自Buthus tamulus；KTX(kaliotoxin)純化自Androctonus mauretanicus mauretanicus；MgTX(margatoxin)純化自Centruroides margaritatus.
圖4為Martentoxin與大鼠腦突觸體膜鉀通道標本結合的BIAcore分析圖。Martentoxin被固定在CM5芯片上，一系列濃度的突觸體膜(38.1-131微克/毫升)流經Martentoxin。芯片用0.1N的NaOH再生，能夠保持95％以上的Martentoxin結合活性。
圖5a為Martentoxin(M)與TSN(A)，ChTX(B)，Apamin(C)和BmP03(D)對大鼠腦突觸體膜結合競爭圖，圖中I為結合相，II為解離相；圖5b為圖5a解離相的放大圖；圖5c為TSN(A)，ChTX(B)，Apamin(C)和BmP03(D)對Martentoxin(M)大鼠腦突觸體膜鉀通道標本結合的抑制百分比圖。在37℃條件下，相同濃度(0.5×10-6摩爾/升)的川楝素TSN(A)、ChTX(B)、Apamin(C)、和BmP03(D)與新鮮制備的突觸體膜溫育30分鐘。然后混合物流經固定在芯片上的Martentoxin。芯片用0.1納摩爾/升的NaOH再生。
圖6為為TSN，ChTX，Apamin和BmP03對Martentoxin大鼠腦突觸體膜鉀通道標本結合的抑制—劑量圖。濃度范圍從5納摩爾/升到50微摩爾/升。隨著濃度增加，TSN和ChTX顯示出抑制飽和。它們的半飽和濃度IC50分別為約10納摩爾/升和20納摩爾/升。
圖7a為在大鼠腎上腺嗜鉻細胞(RACCs)上記錄大電導鈣激活鉀通道(Bkca)的方法圖。根據圖7a下方的刺激模式，將從同一個細胞上記錄到的兩條曲線放在一起。由于在0毫伏的前置電壓下，沒有鈣離子內流，BK通道幾乎全部失活，所以0 Ca2+電流主要是電壓門控鉀電流。I(10毫摩爾/升Ca2+)和I(0 Ca2+)的差值就是純的BK電流(n＝15)。
圖7b為Martentoxin和ChTX對RACCs上Bkca通道效應比較圖電流—電壓曲線的作用圖。在建立了全細胞打孔電壓鉗(入路電阻＜20兆歐)，就施加圖7a中的刺激模式，同時交替施加對照液，Martentoxin(左圖)或ChTX(右圖).數據表明100納摩爾/升Martentoxin和100納摩爾/升ChTX，均幾乎完全抑制BK(n＝8)。
圖8為Martentoxin和ChTX對RACCs上Bkca電流—電壓曲線的作用圖。
圖8a從-80到80毫伏，通過一串以20毫伏遞增的刺激誘導出膜電流。圖8a的左圖為，正常2毫摩爾/升Ca2+外液；圖8(a)的中圖為，施加100納摩爾/升Martentoxin；圖8a的右圖為，外液含0 Ca2+和0.1毫摩爾/升EGTA。
圖8b為圖8a的外向峰電流和膜電位的關系圖。“N”型的電流-電壓曲線是典型的BKCa電流特征，原因在于激活了電壓門控鈣電流。注意“N型”被Martentoxin強烈抑制。當0 Ca2+外液施加時，N-型也消失了。這些數據提示Martentoxin抑制BKCa電流。
具體實施例方式
下面用實施例詳細描述本發明。在下列實施例中，利用各種生物化學手段，將Martentoxin從東亞鉗蝎粗毒中分離純化并鑒定其生化特性。然后利用其氨基酸序列特征，從東亞鉗蝎基因庫中克隆出編碼Martentoxin的基因并分析其構成特性。利用實時生物分子相互作用分析技術，鑒定了Martentoxin與大鼠腦突觸體膜的藥理結合特性，并進一步分析了Martentoxin和多種已知鉀通道配體的競爭結合關系。利用全細胞電壓鉗方法，分別觀察了Martentoxin對大鼠腎上腺嗜鉻細胞大電導鈣激活鉀電流，神經瘤細胞株NG108-15細胞和DRG神經元電壓門控鉀電流的遏制效應。這些實施例從生化特征，基因組構，藥理結合及細胞電生理特性出發，全面而充分地展示了Martentoxin是一個新型的具有獨特結構與功能特征的鉀通道阻斷劑，可為探討鉀通道的組成、電和生物化學信號特征增添新的有力探針工具物。
這些實施例僅僅是例示，而不以任何形式限制本發明。在不違背本發明的基本精神和原則的前提下，對本發明的任何等同替代、改動或改進都將落入本發明待批權利要求的范圍內。
實施例1 Martentoxin的純化和鑒定約0.2克BmK粗毒(購自中國江蘇蘇州—養蝎場)溶解于1毫升2摩爾/升的醋酸溶液中，4℃溫度下以12500rpm轉速離心25分鐘。取上清液上樣于Sephadex G-50凝膠柱(2.5×120厘米)進行柱層析分離后，得到至少5個組分(參見圖1a)。其中的組分F-4通過DEAE-Sephadex A-50層析柱，可進一步分為5個亞組分(參見圖1b)。亞組分F-4-7用高效反相色譜(美國Waters公司510型)進行純化，最后，得到亞組分F-4-7-0(參見圖1c)，該多肽被命名為Martentoxin。HPLC柱為Cosmosil C8柱(4.6×150毫米，日本Nakarai公司)。
毒素的純度和分子量經電噴霧質譜儀(美國Finnigan Corporation)進行鑒定，其質譜圖(參見圖1d左邊部分)為高純度的單一峰，質譜鑒定其精確分子量為4060Da。
用蛋白質測序儀(Model 477A，Applied BioSystems，USA)進行Edman自動降解測序。經蛋白質測序儀測定得到天然Martentoxin從N-末端到第26位的部分殘基序列，其中第8、13和17位應為Cys殘基(參見圖2a)。
用IEF Standards(Bio-Rad)測定毒素的等電點。IEF標樣由9種天然蛋白質組成藻青蛋白(Phycocyanin，pI為4.45，4.65，4.75)，β-乳球蛋白B(β-Lactoglobulin B，pI為5.10)，牛碳酸酐酶(Bovine carbonic anhydrase，pI為6.00)，人碳酸酐酶(Human carbonic anhydrase，pI為6.50)，馬肌血球素(Equine myoglobin，pI為7.00)，人血紅蛋白A(Human hemoglobin A，pI為7.10)，人血紅蛋白C(Human hemoglobin C，pI為7.50)，扁豆凝集素(Lentil lectin，pI為7.8，8.0，8.2)和細胞色素c(Cytochrome c，pI為9.6)。5微升標樣和毒素的混和液用于凝膠電泳。凝膠用Coomassie藍R-250染料染色。測得Martentoxin的等電點為9.5(參見圖1d的右邊部分)。
本施例中的溶解時，醋酸的濃度可在1-4摩爾/升選擇，旋轉的反應溫度可在0-10攝氏度，轉速可在10000-15000rpm，反應時間可在10-30分鐘之間選擇。
實施例2 Martentoxin的基因克隆和基因編碼結構基因克隆利用TRIZOL試劑(Promega，USA)和Wizard DNA純化試劑盒(Promega，USA)，Martentoxin的總RNA和總基因DNA從蝎子的毒腺中提取。
用Superscript II reverse transcriptase(GIBCO BRL，USA)和一般的Oligo(dT)適配子引物[5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’]擴增，將5微克的總RNA反轉錄為cDNA。
合成的cDNA在3′RACE中作為模板。根據天然毒素的N末端1-6個殘基序列(FGLIDV)，設計了引物1(<210>3)。利用引物1和適配子引物[5′-ATTGAAGCTTACG CGTCGACTA TATT-3′]，擴增天然毒素的cDNA，該PCR擴增在PE-2400(PERKIN ELMER，USA)上進行。
在3’RACE決定的部分序列的基礎上，設計和合成反義引物。Martentoxin的基因特異的引物2(<210>4)與<210>2的第30-34個堿基(QNNQC)相對應。前一步驟中合成的cDNA用Glassmax柱(G IBCO BRL USA)分離，通過終端的脫氧核苷酸轉移酶在3’端加上同聚核苷酸dC尾，被加上dc尾的cDNA利用引物2和一個錨定引物[5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’]被首次擴增。為了得到更多的特定cDNA，第一次PCR擴增產物被稀釋，并利用引物2和一個普遍擴增引物[5’-GGGCACGCGTCGACTAGTAC-3’]，第一次PCR擴增的產物被作為第二次擴增的模板。
根據決定了的Martentoxin的cDNA的5’UTR和3’UTR序列設計的引物，對Martentoxin的基因DNA進行擴增。向前的P3引物(<210>5)對應著5’UTR序列，向后的P4引物(<210>6)對應著3’UTR序列。擴增的PCR片段被純化并直接連接到pGEM-T載體(Promega，USA)上，轉化大腸桿菌DH5α。重組的質粒被純化并用T7引物在ABI PRISM 377 DNA序列儀(PERKIN ELMER，USA)中自動測序。
利用5’RACE和3’RACE的方法得到Martentoxin的全cDNA序列，開放閱讀框含有177bp，編碼一個包括22個殘基的信號肽序列和37個殘基的成熟肽的59個氨基酸殘基的Martentoxin前體。多聚腺氨酸信號(AATAAA)定位于終止密碼子下游的35bp處。利用對應于cDNA的5’UTR區域和3’UTR區域的P3和P4引物做PCR擴增，直接得到Martentoxin的基因組DNA序列。最后，得到包含有Martentoxin cDNA的三個相同的克隆。在基因組DNA中包含有兩個內含子一個定位于起始密碼子(TGA)上游區域從-104堿基到-22堿基處，共有83bp。另一個位于信號肽C末端的Ser后面，共有91bp長。
Martentoxin與其它鉀通道阻斷劑的序列比較利用VNTIsuite 5.5biosoftware(Informax，USA)進行序列比較。Martentoxin與其他包含有來自于同一毒腺中的毒素BmTX1，BmTX2和BmKTX的ChTX和KTX組的序列相似性為35-50％，和TmTX和Lqh15-1兩個毒素有很高的序列相似性73％和75.5％。
實施例3 Martemoxin與腦突觸體的藥理結合及競爭特性首先，選用5-8周齡，250-350克的成年雄性Wistar大鼠，按照賈凌云等描述的方法(賈凌云等，Neuroreport 16，3359-3362，1999)制備腦突觸體，突觸體膜懸浮液包括(均為毫摩爾/升)氯化膽堿，140；氯化鈣，1.8；氯化鉀，5.4；硫酸鎂，0.8；D-葡萄糖，10；HEPES-Tris，25，pH值用Tris調至7.4并即刻用于Biosensor分析。流程中所有的緩沖液都含有下列蛋白酶抑制劑PMSF(50微克/毫升l，Wako Company，Japan)，pepstatin A(1微摩爾/升，Sigma)，iodoaceta-mide(1毫摩爾/升，Wako Company，Japan)和1，10-phenanthroline(1毫摩爾/升，DojindoCompany，Japan)。突觸體膜的濃度以BSA作為標準蛋白，采用Bio-Rad蛋白分析法進行蛋白濃度測定。
然后將樣品固定和BIACORE分析(賈凌云等，Neuroreport 16，3359-3362，1999)。將400毫摩爾/升的N-ethyl-N-dimethyl aminepropyl)-carbdiimide和100毫摩爾/升的N-hydroxysuccimide(Pharmacia)以1∶1(體積/體積)混勻，取40微升混合液用以活化實驗中使用的CM5芯片。同時，將Martentoxin溶解于10毫摩爾/升酸鈉中，終濃度為200微克/毫升，以6微升/分鐘的速度注射30微升，固定于芯片上。沒有反應的芯片基團將被50微升，1摩爾/升ethanolamine hydrochloride(pH 8.0，Pharmacia)所關閉而失活。固定在芯片上的Martentoxin與大鼠腦突觸體膜的結合信號記錄為共振單位(RU)，該單位直接與結合在芯片上的量成比例。
前述固定在芯片表面上的Martentoxin有350RU。通過注射一系列不同濃度(38.1-131微克/毫升)的大鼠腦突觸體膜，流經被固定的Martentoxin，得到了Martentoxin結合動力學。配體—受體相互作用和競爭結合分析在Pharmacia公司的BIAcore上進行。大鼠腦突觸體膜能快速地與固化在芯片上的Martentoxin結合，并呈濃度依賴性。流經的緩沖液使得我們可以監控固定在芯片上的Martentoxin與大鼠腦突觸體膜的一級解離。Martentoxin結合的動力學如圖4所示。結合和解離速率分別為1.67×104摩/升-1秒-1and5.50×10-6秒-1(表1)，這些數據說明Martentoxin對鉀通道的親和性遠高于ChTX。
表1生物傳感實時分析Martentoxin與大鼠腦突觸體膜結合動力學平衡常數


以一定濃度的腦突觸體膜為對照(98.7微克/毫升)，與Apamm(Sigma)，BmP03，ChTX(Sigma)和Toosendanin(TSN)(它們的濃度均為0.5微摩/升)在37℃條件下孵育30分鐘，然后流經固定有Martentoxin(M)的芯片。結合和解離常數用BIA Evaluation 1.0和2.0軟件包分析。圖5顯示了川楝素(TSN)，ChTX，Apamin和BmP03與Martentoxin在大鼠腦突觸體膜上競爭結合的流程圖及其抑制百分比。結果表明，以同量的大鼠腦突觸體膜(98.7微克/毫升)作為對照，Martentoxin對大鼠腦突觸體膜的結合能夠被TSN和ChTX顯著抑制百分比分別為57.95％和38.62％，而對于Apamin和BmP03，與對照相比，分別只有12.49％和5.25％的Martentoxin結合被抑制。
TSN，ChTX，Apamin和BmP03(從5納摩/升到50微摩/升)對Martentoxin與大鼠腦突觸體膜結合的抑制(圖6)表明，TSN和ChTX對其結合的抑制是濃度依賴性的，且該抑制效應在TSN和ChTX達到50微摩/升的時候出現飽和(抑制百分比分別為64.35％和45.59％)，TSN和ChTX的IC50分別為10納摩/升和20納摩/升。即使在高達50μM濃度下，BmP03對Martentoxin與大鼠腦突觸體膜結合的抑制也很小，抑制百分比僅為6.72％。然而，在0.5，5.0和50μM的濃度范圍內，Apamin對Martentoxin與大鼠腦突觸體膜結合的抑制效應卻表現為是一個鐘形曲線，分別有12.49，26.43and15.49％的Martentoxin結合被抑制。由于ChTX是大電導鈣激活鉀通道的阻斷劑，而TSN是廣譜的鉀通道阻斷劑，所以它們對Martentoxin的強烈抑制說明Martentoxin是鉀通道，特別是大電導鈣激活鉀通道的強烈的阻斷劑；另一方面，Apamin是小電導鈣激活鉀通道的阻斷劑，BmP03是一種電壓門控鉀通道的阻斷劑，Martentoxin被ChTx強烈抑制，而只被Apamin和BmP03少量抑制，說明Martentoxin對BKca的阻斷是選擇性的。
實施例4 Martentoxin對全細胞鉀電流的阻遏作用電生理記錄成年Wistar大鼠(250-300g)RACC細胞按如前所述方法培養，經40分鐘酶解得到單細胞，這些細胞在CO2培養箱中用DMEM經1-4天的培養，用于實驗。運用制真菌素打孔電壓鉗技術，電壓門控膜電流在全細胞電壓鉗條件下得以記錄。實驗設備為Axon 200B(Axon Instruments，Foster City，CA)或者PC-2B(INBIO Inc.，中國，武漢)等運用pClamp8數據獲得技術的電壓鉗放大器。數據分析軟件是Igor software(AveMatrix，LackOswego，OR)。標準外液中包括(毫摩/升)125 NaCl，2.8KCl，2CaCl2，1 MgCl2，10HEPES，pH值調至7.4。
液的配方同上，而在[10 Ca2+]液中，10毫摩/升Ca2+代替了NaCl。吸管的標準內液包括(毫摩/升)45 KCl，8 NaCl，1MgCl2，10HEPES，nystatin 250ug/ml，pH值調至7.2。所有用液的配方都與洗液相似，除了前者含有特異的藥物。通過RCP-2B多通道微灌注系統(INBIOInc.，中國，武漢)記錄，對照/沖洗用液和毒素吹打在細胞上，在7個通道中有一個快速的電轉換時間(＜100毫秒)。尖布直徑100微米的吹管置于離細胞120微米處。通過電導測試的結果，純水用作灌注液，在運行速度設定為100微升/分鐘或更快的條件下，保證RCP-2B使細胞周圍的溶液能100％的接近給定條件。
37℃條件下，5％CO2和95％空氣的濕潤空氣中，NG108-15細胞在35毫米塑料培養皿中進行培養。電極溶液包括(毫摩/升)KCl，150；MgCl2，0.8；N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid(HEPES)，10；ethyleneglycolbis(β-aminoethyl ether)-N，N，N’，N’-tetraacetic acid(EGTA)，10；pH值用2毫摩/升的NaOH.調至7.2。
背根神經元從成年大鼠(120±12g)的背根神經節(DRG)中急性分離得到細胞。電極溶液包括(毫摩/升)KCl，140；MgCl2，2；HEPES，10；EGTA，10；ATP 4；pH值用2毫摩/升的NaOH.調至7.4。
NG108-15細胞和DRG神經元的電壓鉗記錄在室溫條件下進行(20-25℃)。全細胞鉀電流用玻璃微管記錄，當充滿內液時，電阻達2-5兆歐。由400毫秒的測試脈沖從-70毫伏的鉗制電壓激發的膜電流用EPC-9(HEKAelektronik，Germany)放大器測量。記錄在2.9千赫下過濾，數據整理并保存在電腦中。
Martentoxin的電生理效應大鼠RACC細胞中BKCa電流的膜片箝記錄過程如圖7所示。依賴Ca2+的外向電流的記錄利用打孔全細胞模式，用液分別為10毫摩/升和0 Ca2+。0 Ca2+和10毫摩/升Ca2+記錄的時間間隔為1分鐘。在80毫伏激發的外向電流先于100和0毫伏去極化。在含有10毫摩/升Ca2+的溶液中電流比在含有0 Ca2+的溶液中大，是因為在0毫伏去極化的時候，有通過電壓依賴Ca2+通道的電流，在緊接著的80毫伏去極化過程中激活了BKCa。在0毫摩/升-Ca2+液中，剩余的外向電流是不依賴于Ca2+的鉀電流。在10毫摩/升Ca2+液中，被激活的電流全部是單純的BKCa電流，是在100毫秒去極化脈沖前通過Ca2+通道的Ca2+流活化的(圖7a)。因此，BKCa電流可以用10毫摩/升Ca2+程序來記錄。
圖7b顯示的是以ChTX為對照，Martentoxin對BKCa的作用。左側顯示的是100納摩/升Martentoxin作用于RACC之前、之中和之后激活的外向電流。Martentoxin曲線為施藥5分鐘后，而沖洗曲線是在用空白液沖洗后10分鐘記錄的。右側顯示的是100納摩/升ChTX作用于另一RACC之前、之中和之后激活的外向電流。ChTX曲線為施藥7分鐘后，而沖洗曲線是在用空白液沖洗后10分鐘記錄的。圖7顯示了Martentoxin具有同ChTX同樣強烈地直接阻斷Bkca的作用。
如圖8所示，100納摩/升Martentoxin可阻斷全部鉀電流的60％(均值為57±3％，n＝9)，或者70％的Ca2+依賴BKCa電流(假定10％的電流不是Ca2+依賴的，而是電壓依賴的)。與此形成對照的是，100納摩爾/升ChTX阻斷了全部鉀電流的80％(均值為74±3％，n＝8)，或者90％的BKCa電流。因此，Martentoxin有著ChTX77％的功能。
圖8a闡明了RACC中，Martentoxin(100納摩/升)對去極化脈沖活化的電流影響。為了便于對照，同一個細胞的電流分別在含Ca2+(左側，對照)和缺Ca2+(右側)條件下激活。圖8b繪出了外向電流。當用液含有2毫摩/升Ca2+，電流—電壓曲線呈現一個顯著的N形，而當Ca2+被除去的時候，多數的外向電流消失了，而且電流—電壓曲線中的N形也被消除了。因此，曲線中的N形代表著Ca2+依賴的鉀電流。Martentoxin可以阻斷約60％的N形電流(n＝9)。為了測定SKCa通道對BKCa可能的影響，采用了圖7a所示的流程。實驗中，200納摩/升濃度的apamin存在下，加入Martentoxin吹入緩沖液中。然而，結果發現，有或無apamin(n＝6)對于電流—電壓曲線沒有明顯的變化，這提示在圖7和8中Martentoxin所阻斷的多數Ca2+敏感電流是BKCa電流。這與在圖7a中得到的結論是一致的，即SKCa只占很少的一部分。
另外一個方面，通過全細胞記錄定性分析了Martentoxin對背根神經節和NG108-15細胞上Kv電流的抑制作用。結果發現在高達300納摩/升的Martentoxin下，僅有約10％的電壓門控鉀電流被抑制。說明Martentoxin對BKca地作用是選擇性的。
從上述實驗可知，Martentoxin是一個具有獨特結構和功能的鉀通道阻斷劑，是一個性能較優的鉀通道阻斷劑，同時也是一個可用于研究鉀通道組成、電和生物化學信號特征的探針工具物。
序列表<110>吉，永華<120>一種大電導鈣激活鉀通道阻斷劑-Martentoxin及其制備方法和用途<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>26<212>PRT<213>Buthus martensi Karsch<214>東亞鉗蝎<400>1Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr1 5 10 15Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln20 25<210>2<211>37<212>PRT<213>Buthus martensi Karsch<214>東亞鉗蝎<400>2Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr1 5 10 15Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn20 25 30Gln Cys Arg Cys Tyr35<210>3<211>26<212>DNA<213>Buthus martensi Karsch<214>東亞鉗蝎<220><221>misc_feature<222>(13，17，25)<223>y＝c或t<220><221>misc_feature<222>(16，19)<223>n＝a或g或c或t<220><221>misc_feature<222>(22)<223>h＝a或c或t<400>3acgatgactt ttyggnytna thgayg 26<210>4<211>20<212>DNA<213>Buthus martensi Karsch<214>東亞鉗蝎<400>4ccccgcacat tgattattct 20<210>5<211>20<212>DNA<213>Buthus martensi Karsch<214>東亞鉗蝎<400>5ctacattttt ccatacaagt 20<210>6<211>20<212>DNA<213>Buthus martensi Karsch<214>東亞鉗蝎<400>6ttcacacatc atttatttta 20<210>7<211>435<212>DNA<213>Buthus martensi Karsch<214>東亞鉗蝎<400>7catttttcca tacaagtata aagtcaagta agttgacaat acaatatata attataattt 60aaaattttgt ctaattttat taatttgttt catttgtgta atttataaag ctgttttcaa 120ttgtggagaa aatgaaaatt ttttctattc ttttggtagc tctcattatc tgttcaataa 180gtaagtttca cgttatcttt tcaatttttt tcttttattt gcatgatatg atagtacagt 240atatagataa caaatacata attatatcta ggcatttgta ctgaggcatt tggactcata 300gacgtaaaat gttttgcatc tagtgaatgt tggacagctt gcaaaaaagt aacaggatcg 360ggacaaggaa agtgccagaa taatcaatgt cgatgctact gattaatctt cctaaggttt 420aaaataaatg atgta 43權利要求
1.一種活性多肽——Martentoxin，其特征在于，它是包含有<210>2所示的氨基酸序列的多肽，它的分子量為4060道爾頓，等電點為9.5。
2.一種多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸包含編碼具有<210>2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸序列包含有<210>7中289-399位的序列或<210>7中1-435位的序列。
4.一種從東亞鉗蝎粗毒中制備Martentoxin的方法，其特征在于，將東亞鉗蝎粗毒溶解于1-4摩爾/升醋酸溶液中，0-10攝氏度10000-15000rpm高速離心10-30分鐘，取上清液于凝膠柱中進行分子篩柱層析分離，至少得到5個組分，再利用離子交換柱層析和高效反相色譜進行反復純化，直至最后得到一個單峰，即得到Martentoxin。
5.一種基因克隆制備Martentoxin的全cDNA的方法，其特征在于，利用TRIZOL試劑和Wizard DNA純化試劑盒，從東亞鉗蝎的毒腺中提取Martentoxin的總RNA和總基因DNA，將提取的總RNA反轉錄為cDNA，在3′RACE中作為模，根據天然毒素N末端的部分殘基序列，設計引物，將天然東亞鉗蝎毒素的cDNA擴增，在3’RACE決定的部分序列的基礎上，設計和合成反義引物，擴增的PCR片段被純化并直接連接到pGEM-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α，即得到Martentoxin的全cDNA。
6.一種Martentoxin的用途，其特征在于，可將Martentoxin用作大電導鈣激活鉀通道的阻斷劑。
7.如權利要求6所述的Martentoxin的用途，其特征在于，所述的大電導鈣激活鉀通道為大鼠腎上腺的嗜鉻細胞的大電導鈣激活鉀通道。
全文摘要
本發明公開了一種大電導鈣激活鉀通道阻斷劑——Martentoxin及其制備方法和用途。本發明的Martentoxin是由37個氨基酸組成的單鏈多肽,它的分子量為4060道爾頓,等電點為9.5。本發明還提供了運用分子篩凝膠過濾、離子交換柱層析和高效液相色譜等進行提純該多肽的方法。還提供了基因克隆該多肽的方法。本發明的多肽是一個優良的鉀通道阻斷劑。
文檔編號C07H21/00GK1344745SQ01131909
公開日2002年4月17日 申請日期2001年10月12日 優先權日2001年10月12日
發明者吉永華, 李亞軍, 葉建國, 王維璽, 譚智勇, 何琳琳, 周專 申請人:吉永華