本發明涉及營養保健醫療領域，特別是涉及一種plga納米復合物及其制備方法。

背景技術：

白藜蘆醇(resveratrol，rv)，化學名稱為(e)-3，5，4-三羥基二苯乙烯，主要來源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，天然的白藜蘆醇在很多植物中存在，是植物為了抵御病菌入侵而產生的一種抗毒型物質。白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結和血管舒張，保持血液暢通，可預防癌癥的發生及發展，具有抗動脈粥樣硬化和冠心病，缺血性心臟病，高血脂的防治作用。1998年美國艾爾·敏德爾編撰《抗衰老圣典》時，將白藜蘆醇列為“100種最熱門有效抗衰老物質”之一。2012年來自美國國立衛生研究院，中山大學藥學院，荷蘭格羅寧根大學醫學中心等處的研究人員發表在cell上的文章，詳細解析了白藜蘆醇促進人體健康的分子機理，提出白藜蘆醇并不如以往認為的那樣，是直接作用于與衰老相關的蛋白，而是通過抑制調節能量代謝的磷酸二酯酶。rv是非黃酮類的多酚化合物，難溶于水，雖然具有很好的生物活性，但由于水溶性差，生物利用度低，使其臨床應用受到了極大限制。

plga(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)由兩種單體-乳酸和羥基乙酸隨機聚合而成，已通過美國fda認證，并且作為藥用輔料收錄進美國藥典，其具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應用于制藥、醫用工程材料領域等。plga的降解產物是乳酸和羥基乙酸，同時也是人代謝途徑的副產物，因此具有良好的生物安全性。同時，通過調整單體比，可以改變plga的降解時間，這種方法已廣泛應用于生物醫學領域中。市售的治療晚期前列腺癌的luprondepot即是用plga充當藥物載體。

盡管大量研究報道，plga的納米復合物可以很好提高藥效，還是有些研究指出，plga作為藥物載體不能得到很好的治療效果，他們將其歸因于plga納米或微米復合材料的生物相容性缺陷。

技術實現要素：

基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明的目的之一在于提供一種plga納米復合物的制備方法。

本發明采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga，poly(lactic-co-glycolicacid))納米粒子作為白藜蘆醇的載體，首先合成了plga包載白藜蘆醇納米級的復合物來改善白藜蘆醇的水溶性和生物相容性。本發明應用納米給藥系統的原理改進劑型，克服現有技術中白藜蘆醇水溶性差，生物利用度低的缺陷，同時還能提高藥效，提高藥物靶向性。另外，本發明還引入了生物功能性材料-殼聚糖，聚乙二醇和ph敏感材料eudragitl100-55，來功能化修飾plga包載的白藜蘆醇納米復合物，而使本發明所得功能化修飾包載白藜蘆醇的plga納米復合物(例如rv-plga-pegnps)具有更好的生物相容性，機體吸收率，從而提高其藥效和靶向性，同時在抗炎中也有較好的效果。

解決上述技術問題的具體技術方案如下：

一種功能化修飾包載白藜蘆醇的plga納米復合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將plga和白藜蘆醇溶于二氯甲烷中，得到plga和白藜蘆醇濃度分別為1～50mg/ml和1～100mg/ml的二氯甲烷溶液，作為油相；

(2)將聚乙烯醇(pva)溶于水中，得濃度為0.1～5％的聚乙烯醇溶液，作為外水相；

(3)在所述油相或外水相中加入濃度為0.5～50mg/ml的功能化修飾材料溶液，得油相1或外水相1；當所述功能化修飾材料溶液為加入所述油相時，所述功能化修飾材料為eudragitl100-55；當所述功能化修飾材料溶液為加入所述外水相時，所述功能化修飾材料為殼聚糖(chitosan)，聚乙二醇(peg)中的至少一種；

(4)將所述油相1加入所述外水相中或將所述油相加入所述外水相1中，超聲乳化，磁力攪拌去除有機溶劑。

上述油相、外水相、功能化修飾材料溶液之間的體積比優選為1：5：1。

上述步驟(4)中所述的超聲乳化時間為10～3000秒。進一步優選為20～2000秒。再進一步優選為40～400秒。另外，步驟(4)中所述的超聲的功率為60～100w。

在其中一些實施例中，所述二氯甲烷溶液中plga的濃度為10～50mg/ml，白藜蘆醇的濃度為1～10mg/ml；所述聚乙烯醇溶液的濃度為0.5～5％；所述的功能化修飾材料溶液的濃度為0.5～30mg/ml。上述聚乙烯醇溶液的濃度更進一步的優選為1～5％。

在其中一些實施例中，所述功能化修飾材料為殼聚糖，所述功能化修飾材料溶液為所述殼聚糖溶于0.1％(v/v)的冰醋酸溶液中得到的濃度為1～10mg/ml的殼聚糖溶液。

在其中一些實施例中，所述殼聚糖溶液的濃度為1～5mg/ml。

在其中一些實施例中，當所述功能化修飾材料為eudragitl100-55，所述功能化修飾材料溶液為所述eudragitl100-55溶于水中，并用naoh調節ph為8.5～11.0所得到的濃度為10～50mg/ml的eudragitl100-55水溶液。

在其中一些實施例中，所述eudragitl100-55水溶液的濃度為10～30mg/ml。

在其中一些實施例中，當所述功能化修飾材料為聚乙二醇，所述功能化修飾材料溶液為所述聚乙二醇溶于水中得到的濃度為5～10mg/ml的聚乙二醇溶液。

所述聚乙二醇優選分子量范圍為2000～5000的聚乙二醇。

上述功能化修飾材料優選聚乙二醇和聚殼糖。

在其中一些實施例中，所述制備方法還包括步驟(5)純化：離心，超純水多次洗滌；還包括步驟(6)冷凍干燥。

在其中一些實施例中，所述步驟(4)的溫度條件為-4℃～30℃，所述步驟(5)的溫度條件為-4℃～0℃。

本發明的另一目的在于提供一種上述制備方法制得的plga納米復合物。

本發明相較現有技術具有以下優點和有益效果：

本發明經發明人大量的研究和實驗，得出：plga作為藥物載體，以白藜蘆醇，pva和殼聚糖，聚乙二醇，eudragitl100-55等功能化修飾材料為原料，并控制體系中各原料的濃度進行反應，所制得的plga功能化修飾的納米復合物粒徑分布均勻(在100-2000nm之間)、水溶性好、穩定性佳，還具有良好的抗癌、抗炎、養顏抗衰及免疫調節等生物活性，水溶性顯著優于白藜蘆醇，這提高了白藜蘆醇的生物利用率，故該復合物在食品保健以及醫療衛生領域有著潛在的應用前景；另外，所述制備方法還具有簡便易行，適宜工業化生產的優點。

附圖說明

圖1為實施例2所制得的plga納米復合物的表征示意圖：(a)為plga納米復合物的原子力顯微鏡成像，(b)為plga納米復合物的掃描電鏡成像；

圖2為實施例2所制得的plga納米復合物的細胞吸收示意圖:(a)不同濃度的包載有熒光探針香豆素-6的實施例2所制得的plga納米復合物在相同共培養時間下的熒光強度，(b)相同濃度的包載有熒光探針香豆素-6的實施例2所制得的plga納米復合物在不同共培養時間下的熒光強度；

圖3為實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物對lps構建的肺損傷小鼠模型的治療效果圖；

圖4為實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物對lps構建的肺損傷小鼠模型的治療后，肺組織中eba的表達的定量檢測；

圖5為實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物對肺損傷小鼠模型的肺組織中髓過氧化物酶(mpo)表達的影響示意圖；

圖6為實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物對肺損傷小鼠模型的肺組織中炎癥因子表達的影響示意圖。

具體實施方式

以下通過實施例進一步說明本發明。

本發明實施例中所用原料均為市售普通產品，其中：

eudragitl100-55購自德國rohm公司。

聚乙烯醇購自美國sigma公司。

聚乙二醇(分子量為4000)購自美國sigma公司。

白藜蘆醇購自美國sigma公司。

殼聚糖購自美國sigma公司。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)購自美國sigma公司。

實施例1

一種plga納米復合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將60mgplga和20mg白藜蘆醇溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；

(2)溶解制備濃度為1％(w/v)聚乙烯醇(pva)溶液作為外水相，在外水相中加入殼聚糖溶液，聚殼糖溶液與外水相的體積比為1:5，得外水相1；上述聚殼糖溶液為將聚殼糖溶于體積百分比為0.1％的冰醋酸溶液中所得到的濃度為5mg/ml的殼聚糖溶液；

(3)取步驟(1)所得油相加入步驟(2)所得的外水相1中，上述油相、外水相(聚乙烯醇溶液)、聚殼糖溶液之間的體積比為1:5：1；

(4)將所得乳液磁力攪拌12小時去除有機溶劑(在其他實施例中可為4～12小時，達到去除有機溶劑的效果即可)，溫度條件為18℃～22℃；

(5)純化：高速離心，超純水多次洗滌，溫度條件為-4℃～0℃；

(6)冷凍干燥后，即得。

實施例2

一種plga納米復合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將60mgplga和20mg白藜蘆醇溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；

(2)溶解制備濃度為1％(w/v)聚乙烯醇(pva)溶液作為外水相，在外水相中同時加入聚乙二醇(分子量為4000)溶液，聚乙二醇溶液與外水相的體積比為1:5，得外水相1；上述聚乙二醇溶液為將聚乙二醇溶于水中所得到的濃度為10mg/ml的聚乙二醇溶液；

(3)取步驟(1)所得油相加入步驟(2)所得的外水相1中，上述油相、外水相(聚乙烯醇溶液)、聚乙二醇溶液之間的體積比為1:5：1；

(4)將所得乳液磁力攪拌12小時去除有機溶劑(在其他實施例中可為4～12小時，達到去除有機溶劑的效果即可)，溫度條件為18℃～22℃；

(5)純化：高速離心，超純水多次洗滌，溫度條件為-4℃～0℃；

(6)冷凍干燥后，即得。

實施例3

一種plga納米復合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將60mgplga和20mg白藜蘆醇溶于5ml二氯甲烷中，得到油相，同時在油相中加入功能化修飾材料eudragitl100-55溶液，得油相1；eudragitl100-55溶液與油相的體積比為1:1，上述eudragitl100-55溶液為將eudragitl100-55溶于水中，并用naoh調節ph為8.5～11.0(使eudragitl100-55完全溶解)，所得到的濃度為30mg/ml的eudragitl100-55溶液；

(2)溶解制備濃度為1％(w/v)聚乙烯醇(pva)溶液作為外水相；

(3)取步驟(1)所得油相1加入外水相中，油相、外水相(聚乙烯醇溶液)、eudragitl100-55溶液之間的體積比為1:5：1；

(4)將所得乳液磁力攪拌12小時去除有機溶劑(在其他實施例中可為4～12小時，達到去除有機溶劑的效果即可)，溫度條件為18℃～22℃；

(5)純化：高速離心，超純水多次洗滌，溫度條件為-4℃～0℃；

(6)冷凍干燥后，即得。

對比例1

一種plga納米復合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)將60mgplga和20mg白藜蘆醇溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；

(2)溶解制備濃度為1％(w/v)的聚乙烯醇(pva)溶液作為外水相；

(3)將5ml油相加入25ml外水相(1％pva的水溶液)中，超聲乳化得到乳液；

(4)將所得乳液磁力攪拌12小時去除有機溶劑(在其他實施例中可為4～12小時，達到去除有機溶劑的效果即可)，溫度條件為18℃～22℃；

(5)純化：高速離心，超純水多次洗滌，溫度條件為-4℃～0℃；

(6)冷凍干燥后，即得。

實驗例1

一、實驗目的

本實驗分析測定實施例1～3以及對比例1所制得的不同修飾的plga納米復合物的粒徑，電位及藥物包載量。

二、實驗方法

采用納米粒度儀分析測定實施例1～3以及對比例1所制得的不同修飾的plga納米復合物的粒徑和zeta電位。采用掃描電鏡和原子力顯微鏡對實施例1～3以及對比例1所制得的不同修飾的plga納米復合物進行成像。采用紫外分光光度計對實施例1～3以及對比例1所制得的不同修飾的plga納米復合物中白藜蘆醇的包載量及包覆率進行定量定性檢測

三、實驗結果

實驗結果參見圖1以及表1。

圖1為實施例2所得plga納米復合物(rv/peg/plga納米復合物)的表征示意圖，其中plga納米復合物的形貌為圓形，實施例1以及實施例3、對比例1所得plga納米復合物形貌與實施例2類似。

表1實施例1～3以及對比例1制得的四種plga納米復合物的粒徑分布，表面電位，以及白藜蘆醇的載藥率和包載率的測量結果

結果顯示，實施例3修飾eudragitl100-55的包載rv的plga納米復合物粒徑最大，載藥率和藥物包載率都比較低，而修飾殼聚糖(實施例1)和聚乙二醇(peg)(實施例2)的納米復合物具有相對較高的藥物包載率和載藥率，同時，表面zeta電位顯示，這兩種納米復合物也比較穩定。但是，修飾殼聚糖的納米顆粒粒徑相對較大，800納米左右，而修飾peg的只有200納米左右，同時，修飾殼聚糖的納米復合物表面帶正電荷，修飾peg的納米復合物表面帶負電荷，不同的電性決定了兩種復合物有不同的生物學性質和功能。

實驗例2

一、實驗目的

本實驗分析測定實施例2所制得的plga納米復合物(rv/peg/plga納米復合物)的生物相容性。為了表征plga納米復合物的生物相容性，將熒光染料香豆素6(cucanavalin6)包裹于plga納米復合物內，并于細胞共培養，通過檢測被細胞吸附的plga納米復合物的平均熒光強度來(meanfluorescenceintensity)來檢測plga納米復合物與細胞的生物相容。

二、實驗方法

采用人靜脈上皮細胞株huvecs與實施例2所制得的plga納米復合物在共培養(培養條件為37℃，5％co2)。為了測定plga納米復合物被細胞吸收，在實施例2所制得的plga納米復合物中包載了熒光探針香豆素-6。通過探測進入細胞的plga納米復合物的熒光強度來檢測納米復合物與細胞的生物相容性。

三、實驗結果

如圖2a，采用不同濃度(單位為ug/ml)的實施例2所制得的plga納米復合物水溶液與臍靜脈血管內皮細胞(huvecs)共培養2個小時后，進行細胞熒光強度檢測發現，細胞對實施例2所制得的plga納米復合物的吸收呈現劑量依賴性。采用相同劑量的實施例2所制得的plga納米復合物(1微克每毫升)與細胞共培養不同時間時，細胞對實施例2所制得的plga納米復合物的吸收呈現劑量依賴性(如圖2b)。

實施例1、3所得plga納米復合物具有與實施例2類似的生物相容性。

實驗例3

一、實驗目的

本實驗分析測定實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物對肺損傷小鼠模型的肺血管通透性的影響。

二、實驗方法

采用伊文氏藍(evansbluealbum，簡稱eba)眼底靜脈注射，檢測實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物對lps構建的肺損傷小鼠模型的治療效果。選取10周齡小鼠，腹腔注射一定濃度的lps構造小鼠肺損傷模型，六小時后腹腔注射實施例1～3、對比例1所制得的plga納米復合物，24小時后，通過伊文思藍(evanblue，eb)染色檢測肺血管滲透的程度。該檢測的原理是，eb在血循環中與白蛋白結合形成伊文思藍白蛋白復合物，正常血管內膜面有內皮細胞屏障，該復合物不能透過。內皮損傷后，eb隨血管內的蛋白成分進入組織間隙，使其染成藍色。本實驗另設置pbs對照組(沒有經過損傷處理的正常健康老鼠同等注射磷酸緩沖鹽溶液)，lps對照組(沒有治療的肺損傷小鼠模型)以及rv對照組(用白藜蘆醇(resveratrol，rv)原藥對肺損傷小鼠模型的治療效果)。

三、實驗結果

eba在白光下呈藍色，肺組織越藍，說明血管滲漏越嚴重，即肺損傷越嚴重。如圖3結果顯示，實施例1～3制備的plga納米復合物特別是實施例2所得的plga納米復合物(rv/peg/plga納米復合物)可以顯著修復肺損傷引起的血管滲透性增加，跟白藜蘆醇原藥相比具有更好的特性。

圖4為對實施例1～3以及對比例1制備的plga納米復合物對lps構建的肺損傷小鼠模型的治療后，肺組織中eba的表達的定量檢測。如圖4所示，實施例所制得的plga納米復合物治療組能明顯降低內毒素lps引起的肺組織內的血管滲漏，與肺損傷模型(lps組)組對比，有明顯統計學差異(p<0.05)，其中，實施例2制備的納米復合物治療組效果最為顯著(p<0.001)。

實施例4

一、實驗目的

本實驗分析測定實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物對肺損傷小鼠模型肺組織中髓過氧化物酶(mpo)及炎癥因子(tnf-α,il-1β,il-6)表達的影響。

二、實驗方法

選取10周齡小鼠，腹腔注射lps，六小時后腹腔注射實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物，24小時后安樂處死小鼠，取肺組織，通過定量pcr檢測mpo及炎癥因子的表達。本實驗另設置pbs對照組(沒有經過損傷處理的正常健康老鼠同等注射磷酸緩沖鹽溶液)，lps對照組(沒有治療的肺損傷小鼠模型)以及rv對照組(用白藜蘆醇(resveratrol，rv)原藥對肺損傷小鼠模型的治療效果)。

三、實驗結果

圖5為實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物對肺損傷引起的肺組織內髓過氧化物酶(mpo)的影響。如圖5所示，實施例所制得的納米復合物治療組能明顯降低肺組織內mpo的表達，與肺損傷模型(lps組)組對比，有明顯統計學差異(p<0.05)，其中，實施例2制備的納米復合物治療組效果最為顯著(p<0.001)。

圖6為實施例1～3以及對比例1所制得的plga納米復合物所制得的plga的納米復合物對肺損傷小鼠模型的肺組織中炎癥因子(tnf-α,il-1β,il-6)表達的影響示意圖。如圖6所示，實施例1～3制得的plga納米復合物對肺損傷引起的炎癥因子表達下降的幅度顯著。與肺損傷模型(lps組)組對比，有明顯統計學差異(p<0.05)，其中，實施例2所得的plga納米復合物(rv/peg/plga納米復合物)對肺損傷引起的炎癥因子表達下降的幅度最為顯著(p<0.001)。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。