專利名稱：用于治療或預防卵巢癌的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及卵巢癌及其轉移的治療性和預防性治療領域。更具體地， 本發明涉及包含與卵巢組織細胞相關的蛋白質或其免疫活性變體的至少一 部分的免疫原性多肽，以及編碼所述多肽的核酸。所述多肽和核酸序列可 用于疫苗和藥物組合物中用于卵巢癌及其轉移的治療性和預防性治療。
背景技術：
卵巢癌在女性最常見類型的癌癥中居第八位。美國癌癥學會估計在
2005年期間在美國將有約22,220個卵巢癌新病例被診斷。在女性中，卵巢 癌占全部癌癥的約3%。因為許多卵巢癌不能在它們發育的早期檢測到， 它們在致死性癌癥中占不成比例的數目，導致女性生殖道癌癥死亡的幾乎 半數，比任何其它生殖器官癌癥的死亡數都要高。年長的女性處于更高的 風險。超過半數的卵巢癌死亡發生在年齡介于55歲至74歲的女性中。大 約25%的卵巢癌死亡發生在年齡介于35歲至54歲的女性中。
對卵巢癌的主要治療有外科手術、化療和放射治療。將這些治療的組 合用于治療卵巢癌。
外科手術是針對患有卵巢癌的女性最常用的初始治療。通常，卵巢、 輸卵管、子宮和子宮頸被切除。外科手術中的分期(以找出癌癥是否已經 擴散)通常包括摘除淋巴結、收集來自隔膜和腹部其它器官的組織樣本、 以及收集腹部液體。如果癌癥已經擴散，外科醫生通常會切除盡可能多的 癌癥。這減少了隨后將不得不通過化療或放射治療進行治療的癌癥的量。
化療是利用藥物殺死癌細胞。可以進行化療以破壞外科手術后仍可能 殘留在機體中的任何癌細胞，以控制腫瘤生長或減輕疾病的癥狀。大多數 用于治療卵巢癌的藥物是經靜脈施用或通過導管直接施用于腹部。
放射治療，也稱放療，包括使用高能射線殺死癌細胞。放射治療僅在 治療區域影響癌細胞。放射線可以來自器械；或者女性接受稱做腹腔內治 療的治療，其中通過導管將放射性直接放入腹部。
確定特殊的療程典型地是基于多種前兆參數和標記物(Fitzgibbons， et al. (2000) Arch. Pathol. Lab. Med. 124:966-978; Hamilton and Piccart (2000) Ann. Oncol. 11:647-663))，包括遺傳誘因標記物BRCA-1和BRCA-2 (Robson (2000) J. Clin. Oncol. 18:113sup-l 18sup)。
盡管許多卵巢癌患者得到了有效治療，但目前的療法全都可能誘導嚴 重的副作用，從而降低生活質量。此外，大約85%的已通過基于鉑和紫杉 醇的化療得到有效治療(包括完全有效)的患者在治療后的2年內復發。
新的治療耙的鑒定是改善卵巢癌患者目前治療所必需的。近來在分子 醫學上的進展已提高了在腫瘤特異性細胞表面抗原方面的興趣，所述抗原 可以用作各種免疫治療策略或小分子策略的靶。
在免疫系統的各元件中，T淋巴細胞可能最善于識別和消除表達外源 性或與腫瘤相關的抗原的細胞。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表達CD8細 胞表面標記并專門誘導靶細胞的裂解，它們經穿孔素/粒酶和/或Fas/Fas-L 途徑與所述靶細胞反應。CTL的抗原的T細胞受體(TCR)結合靶細胞表面 的分子復合物，所述分子復合物通過衍生自經加工的外源性或與腫瘤相關 的抗原的小肽(8-11個)殘基形成，其與主要組織相容性復合體(MHC) I類 分子結合。
另一主要T細胞亞群(輔助性T淋巴細胞(HTL或T輔助細胞))的特 征在于其表達CD4表面標記。T輔助細胞識別略大的肽(8-ll個殘基)，所 述肽也衍生自外源性或與腫瘤相關的抗原但仍屬于MHCII類分子，其僅 由專職抗原呈遞細胞(APC)例如B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突細胞(DC) 表達。
通過APC上的肽/MHC復合物對天然CTL和HTL的TCR剌激的結果 是，CTL成熟為能夠裂解表達對應的肽/MHC I類復合物的(腫瘤)細胞的 效應物殺傷細胞。通過使APC在剌激天然CTL方面更有效以及通過產生 刺激CTL的成熟和增殖的淋巴因子，HTL放大了 CTL應答。T輔助細胞 的這種增強效應在發生免疫應答的次級淋巴器官，以及需要維持CTL應答 直至腫瘤細胞被消除的腫瘤部位均發生。因此，可以預測疫苗應當刺激腫 瘤反應性CTL和HTL以產生有效的抗腫瘤免疫性。
適用于免疫治療癌癥策略的抗原應該是在癌組織中高度表達并理想地 在正常成熟組織中不表達。組織中的表達不是生命所必需的，但是是可接 受的。
迄今，已描述了許多適用于卵巢癌治療中的免疫治療策略的抗原，包
括MUC1、 CT、 SP 17和Her2/neu。
多態性上皮粘液素(MUC1)是一種跨膜蛋白，存在于腺上皮細胞的頂 表面。它在卵巢癌中常常(超過全部卵巢癌的90%)過表達，并典型地呈現 出改變的糖基化模式，產生抗原性不同的分子。MUC1在早期臨床試驗中 用作疫苗靶點(Giewski, et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:1693-701; Scholl， et al. (2000) J. Immunother. 23:570-580)。腫瘤表達的蛋白質在循環中作為腫 瘤標記常常是可檢測的(參見，Bon， et al. (1997) Clin. Chem. 43:585-593)。
一種獨特類型的分化抗原，癌/睪丸(CT)抗原，除在睪丸和某些情況 下在胎盤表達外，在正常組織中不表達。這一事實使得CT抗原成為對癌 癥的特異性免疫免疫療法具有吸引力的靶。大多數CT抗原的功能目前是 未知的。Tammela et al. (Tamella， et al. (2004) Cancer Immunity 4:10-21)證 明SCP-1，在配子發育中具有已知功能的一種CT抗原，在15%的卵巢癌 病例中表達。由于SCP-1在正常組織中的限制表達以及在腫瘤組織中的異 常表達，其被建議可用作卵巢癌的疫苗治療的潛在靶。
用于卵巢癌患者的免疫療法的另一潛在的靶是精子蛋白17 (SP17)。發 現SP17在來自70%的卵巢患者的原發腫瘤細胞中表達。SP17在正常組織 中的限制表達使其成為腫瘤疫苗的理想的耙。 一種重組SP17蛋白與衍生 自單核細胞的樹突細胞和自體外周血單個血細胞聯合使用以產生SP17特 異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。人類白細胞抗原(HLA) I類抗原限制性 SP17特異性CTL在疾病出現時從3位卵巢癌患者的外周血中成功產生。 這些CTL能夠以依賴于SP17的方式裂解自體埃-巴二氏病毒轉化的類淋巴 母細胞。所述CTL還裂解SP17-陽性自體腫瘤細胞，表明在SP17-陽性腫 瘤細胞中SP17被加工并與HLA I類分子聯合呈遞。(Chiriva et al. (2002) Cancer 94(9):2447-2453)。
人表皮生長因子受體2 (Her2/neu)是一種致癌基因，其通過基因擴增 并伴隨另一種(正常)基因產物的增強表達被激活。Her2/neu在20。/。-30。/o的 乳腺癌和卵巢癌患者中過表達。開發基于肽的Her-2/neu疫苗的最初研究
是在大鼠模型中進行的(Disis et al. (1999) Clinical Cancer Research 5:1289-1297)。在用完整的大鼠neu蛋白免疫的動物中沒有觀察到T細胞應答或抗 體應答。通過經標記的對照物，大鼠中對大鼠蛋白的耐受性可以通過 用基于肽的疫苗進行免疫而得以避免。用設計用于引發CD4+ T細胞應答 的"e"肽免疫的大鼠產生了特異于免疫肽和全蛋白的T細胞應答和抗體應 答。
Brossart et al.證明可以用以衍生自Her2/neu或MUC1的肽脈沖的自體 樹突細胞(DC)對晚期乳腺癌和卵巢癌患者進行有效接種。10位患者中有 5位可以在外周血中檢測到肽特異性CD8+細胞毒性T淋巴細胞。據報 道，在一位用MUC-1肽脈沖的樹突細胞進行治療的患者中觀察到MAGE-3和CEA肽特異性的CD8+ T細胞，且用衍生自HER2/neu的肽接種后在 另一患者中觀察到MUC-1特異性T細胞。Brossart et al.提出這表明在治療 的基礎上在這些患者中發生了表位擴展(Brossart et al. (2002) Transfiis Apher Sci. 27(2): 183-186)。
表位擴展是一種公認的自身免疫應答現象，并被認為是CD4+T細胞 介導的自身免疫病中的一種加重因子(exacerbating factor)。該現象已在鼠 復發緩解型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、泰累爾氏鼠腦脊髓炎病毒 誘導的脫髓鞘病和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病中得到證實。已經提 出了顯示表位擴展在CD4+ T細胞介導的自身免疫病中是如何發生的模 型。這一模型得到直接證據的支持，即組織損傷、通過MHC II類肽復合 物在CD4+ T細胞上的TCR連接、CD40-CD40配體間的相互作用以及 CD28介導的共刺激是使表位擴展變得明顯所必需的。存在于位于耙組織 中的專職抗原呈遞細胞(APC)表面的MHC II類分子中的初始自身抗原或 持續性病毒表位被認為引起了特異于該抗原的CD4+ T細胞的活化。該T 細胞活化產生慢性炎癥，導致所述靶組織的損傷。組織碎片隨后被APC吞 噬，所述APC已上調應答于炎癥細胞因子的MHC II類分子和共刺激分子 的表達。這些APC然后能夠激活特異于由所述APC呈遞的次生組織表位 的CD4+T細胞。新激活的T細胞然后輔助進行靶組織的破壞。
由于通過APC呈遞外源性抗原的需要，表位擴展歷史上被認為是獨特 于CD4+T細胞應答的現象。然而，最近的數據己表明通過APC進行交叉 引發(cross-priming)也可以參與誘導CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應
答。特別地，鼠腫瘤模型中的骨髓嵌合體研究已表明腫瘤特異性CTL主要 受限于宿主的MHC而非腫瘤的MHC，表明通過宿主APC的間接呈遞與 腫瘤特異性CTL的產生有關。此外，越來越多的證據表明存在可以將外源 性抗原呈遞給負載于MHC I類分子上的最終的肽的途徑。這一現象為樹突 細胞(DC)進行了最好的描述并提供了一種用以解釋交叉引發過程的細胞 機制。集合起來，這些數據表明在MHC I類-限制型CTL應答的過程中可 能發生表位擴展。因為己知發生MHC I類-限制型腫瘤抗原的再呈遞，因 此假定如果攜帶腫瘤的宿主能夠在CTL引起腫瘤細胞損傷后起始抗單一腫 瘤抗原的CTL應答，則可能經與在CD4+ T細胞介導的自身免疫病中所描 述的機制相類似的機制發生表位擴展。然而，與自身免疫應答過程不同的 是，抗腫瘤應答過程中的CTL表位擴展可能通過使腫瘤細胞變體消除而有 益于宿主，所述腫瘤細胞己喪失所述抗原的表達(抗原陰性腫瘤細胞) (Markiewicz et al.， (2001) International Immunology 13:625-632)。
Markiewicz et al發現用單一腫瘤肽P1A免疫并繼以腫瘤排斥導致抗 P1A腫瘤的CTL活性，這指示表位擴展現象不限于CD4+ T細胞應答。 CTL的群體包括識別非相關抗原PIE的細胞。因為這一表位不包括在疫苗 中并且是一種不存在于正常組織中的突變的肽，因此PIE抗原來源必然是 腫瘤細胞攻擊。
因為許多患者具有不表達前述抗原中的任何一種抗原的卵巢腫瘤，因 此需要揭示出用于免疫療法的其他抗原性靶以處理局限性和轉移性疾病。 因此，本申請提供了用于卵巢癌中的免疫治療措施的分子靶。
透明帶(ZP)形成環繞在發育的和排出的卵母細胞以及植入前胚胎周圍 的胞外糖蛋白基質，并且在閉鎖卵泡中也是可檢測的。ZP誘導精子上的頂 體反應，決定受精的種特異性并防止哺乳動物中的多精入卵。透明帶含有 四種主要的糖蛋白，ZP1、 ZP2、 ZP3和ZP4。在小鼠中進行的體外研究表 明ZP3的o-連接寡糖側鏈與精子與ZP3的初級結合有關，而ZP2促成隨 后持久的ZP結合以及作為次級精子受體的功能。
已經對ZP糖蛋白進行了廣泛研究以開發用于動物和人類的生育力控 制的疫苗。建議的疫苗功能是在雌性對象中誘導有效持續的但為可逆轉水 平的ZP特異性抗體，所述抗體抑制精-卵結合和/或防止ZP的精子穿入。 用抗小鼠ZP2或ZP3的大鼠單克隆抗體對雌性小鼠進行被動免疫導致所述
抗體被定位于卵巢內的卵母細胞以及長效但可逆轉的避孕。用衍生自ZP3 的肽ZP3^-^對雌性小鼠進行主動免疫也導致可逆轉的雖然不完全的避 孕，所述肽包含ZP3特異性避孕抗體識別的B細胞表位。這些ZP3肽也誘 導針對所述ZP3肽的T細胞應答。這些CD4+ ZP3特異性T細胞將自身免 疫性卵巢疾病(AOD)過繼轉移給同系受體(syngeneic recipients)。由于已知 ZP3免疫所想要的避孕效果是由抗體介導的，可接受的避孕用ZP疫苗應 當誘導足夠的抗體應答而不激活ZP3特異性T細胞。實際上，已設計了由 來自牛核糖核酸酶(RNase)的外來T細胞表位和修飾的鼠ZP3^-^B細胞 表位組成的嵌合肽，其引發針對ZP的抗體并具有顯著的避孕效果而不引 起顯著的卵巢炎/AOD。所述牛核糖核酸酶T細胞表位在小鼠中刺激T輔 助細胞(輔助性T淋巴細胞，HTL)應答，因此使得可能存在避孕功效而不 誘導ZP(3)-特異性T細胞功能和T細胞介導的卵巢損傷。
以(自身)ZP抗原進行接種也已被用于研究自身免疫性卵巢疾病 (AOD)。更具體地，已報道了適于研究AOD的動物模型，其中利用ZP抗 原接種誘導自身免疫病。例如，Rhimetal.(Rhimetal. (1992) J.Clin. Invest. 89:28-35)證明在B6AF,小鼠中，用小鼠ZP3328'342肽進行接種誘導了 T細 胞和抗體應答。對截短的ZP3328'342肽的進一步研究證實，T細胞應答足以 誘導卵巢炎，7種這樣的缺少抗體結合位點的肽引發了嚴重的卵巢炎而不 伴隨有抗體應答。這些肽包括一種8個氨基酸的最小的產生卵巢炎的 (oophoritogenic)肽(ZP3孤337)，其與7個氨基酸的抗體結合位點(ZP333"42) 有兩個殘基的重疊。
據Bagavant et al. (Bagavant et al. (1999) Biology of Reproduction 61:635-642)報道，將ZP3肽特異性T細胞轉移進原初受體小鼠導致肉芽腫性卵巢 炎并增強IL-1、 TNF-a和IFN-y的卵巢表達。然而，細胞受體的卵巢功能 是正常的，且所述小鼠保持能育。針對ZP3的抗體不能單獨地引起任何卵 巢病狀。致病性T細胞和ZP抗體一起的共轉移將炎癥靶向發育中的卵泡 導致它們被破壞以及卵巢萎縮的發展。在另一項研究中，Bagavant etal (Bagavant et al. (2002) American Journal of Pathology 160: 141-149)證實靈長 類中的ZP3肽(人ZP332M41、獼猴ZP3^s"和小鼠ZP333Q'342)免疫可以引 發T細胞應答并引發與鼠AOD相類似的卵巢免疫病理學。
國際專利申請WO 2005/026735 (Buschmann et al.)涉及差異表達的腫 瘤特異性免疫原性膜蛋白及其用途，尤其是用于發現至少一種特異性調節 至少一種所述膜蛋白的表達的治療性分子或化合物或用于發現特異性結合 所述膜蛋白的任何一種和/或與其相互作用的治療性分子。所述膜蛋白可以 是SYPL、 STOML2、 RAGA 、 CLNS1A 、 PRNP 、 GNB2L1 、 GNG4 、 ITM2B、 ITM1、 TM9SF2、 TM4SF6、 OPRLI、 LRP4、 GLEPP1、 TLR3和/ 或ZP3。 WO 2005/026735教導給致瘤性靶細胞施用前述的治療性分子或化 合物以調節所述致瘤性靶細胞的增殖、分化和/或細胞遷移。按說明，待治 療的非甾體依賴性癌癥是由于至少一種所述免疫原性膜蛋白的異常的表達 和/或生物活性所致。WO 2005/026735中還簡要地提及， 一種特定病變的 發展，例如可以在上皮組織中發現的致瘤前病變發展成致瘤性病變，可以 通過給對象接種一種足以產生抗體和/或T細胞免疫應答所述膜蛋白而被抑 制。其還特別說明，根據另一個實施方式所述方法包括經載體輸送一種所 述免疫原性膜蛋白以誘導所述免疫應答進而產生抗體保護對象免于疾病， 所述載體指導所述蛋白質的體內表達。因此，WO 2005/026735教導了幾種 利用siRNA、受體拮抗劑或抗體抑制其中的ZP3膜蛋白在致瘤性靶細胞中 的表達和/或生物活性以調節所述靶細胞的增殖、分化和/或遷移的方法。 WO 2005/026735僅公開了 ZP3膜蛋白在某些結腸癌細胞中的表達。沒有 其它對與任何ZP糖蛋白的表達相關的腫瘤的報道。
發明概述
本發明人已經驚奇地發現透明帶糖蛋白提供了用于卵巢癌及其轉移的 治療性和預防性治療中的免疫治療策略的適合的抗原。能夠誘導CD8+和/ 或CD4+ T細胞應答的ZP抗原以及編碼所述抗原的核酸序列可以適當地用 于所述免疫治療策略中。
應答于本發明的方法的患者中的卵巢腫瘤細胞自己可以以顯著量表達 ZP糖蛋白，從而使得它們被初級免疫應答所靶向。然而，不希望受理論的 約束，假定本發明的方法還可以很大程度上依賴于表位擴展現象；用透明 帶抗原進行免疫誘導了針對表達ZP糖蛋白的細胞的T細胞應答，隨后通 過APC將所述含有次級表位的表達ZP的細胞的碎片交叉呈遞給CD8+和/ 或CD4+ T細胞可以誘發針對衍生自不同抗原(即不用于接種的抗原)的表
位的細胞毒性/細胞毒性T細胞免疫應答。表達這些抗原的(腫瘤)細胞將 在這一"次級"免疫應答中被攻擊。在這方面，本發明的方法還可以被視為 其中產生了與自身免疫性卵巢疾病(AOD)相當的或類似的病狀的方法。
WO 01/02000公開了用于動物繁殖的控制、生殖疾病和障礙的治療以 及動物行為管理的免疫原性組合物，其包含衍生自透明帶蛋白的免疫原。 WO 01/02000中所描述和/或提出的所有方法都基于這樣一個發現，即這些 免疫原性組合物可以以引起可逆轉的暫時性不育(免疫避孕)或永久的不可 逆的不育(免疫絕育(immunosterilisation))的方式用于影響這些動物的生殖 系統。WO 01/02000中提出在允許經歷無限制的動情期的兔中，所述方法 可適于預防多種病癥，包括生殖道和這些動物的乳腺的瘤形成。如本領域 中通常知道的那樣，過度的雌激素暴露(例如由經歷無限制的動情期的動 物所致)將促成生殖道和乳腺中的某些雌激素敏感型致瘤性疾病的發生。 如WO 01/02000中解釋的那樣，在試圖減少(過度的)雌激素暴露方面，免 疫絕育和/或免疫避孕可以成為卵巢子宮切除術的有效替代方式。對雌激素 暴露敏感的最常見類型的生殖道致瘤性疾病是子宮內膜癌。卵巢癌一般對 雌激素暴露不敏感。本發明涉及治療和域預防人類的卵巢腫瘤的方法，.包 括用一種多肽來源免疫所述哺乳動物，所述多肽包含MHC I類或MHC II 類限制性天然透明帶T細胞表位或其免疫活性變體；以及適用于所述方法
中的組合物。
下面將對本發明進行更詳細的描述。
發明詳述
本發明的第一個方面涉及通過誘導針對ZP (糖)蛋白的初級免疫應答 用于治療性和/或預防性治療人卵巢癌及其轉移的方法，該方法包括給所述 人施用一種多肽來源的步驟，所述多肽包含能在體內引發T細胞介導的免 疫應答的MHC I類和/或MHC II類限制性天然透明帶T細胞表位或其免疫 活性變體。在本發明的一個特別優選的實施方式中，本發明的方法是一種 用于治療性治療的方法。
這些年來ZP糖蛋白組分的命名很不一致，采用了多個標準(包括表觀 分子量、蛋白質序列長度和序列相同性比較)，從而導致混亂的命名。 Harris et al. ((1994) DNA s叫.96:829-834)提出了一個命名的統一系統，其中對ZP基因按照它們所編碼的蛋白質序列的長度從長至短的順序進行命 名。因為，在那些標準下，小鼠ZP基因被排為ZP2，然后是ZP1再然后 是ZP3，因此引入新系統其中將ZP2變成ZPA， ZP1變成ZPB， ZP3變成 ZPC。更近期，Hughes et al ((1999) BBA-Gene Structure and Expression 1447:303-306)報道已知的小鼠ZP1基因的真實直向同源基因不是ZPB，但 存在一個不同的人ZP1基因。現在被普遍接受的是，存在4種不同的(人) ZP糖蛋白家族，ZP1、 ZP2、 ZP3和ZPB (參見Lefievre et al (2004) Hum. Reprod. 19:1580-1586)。根據這一命名法的ZPB糖蛋白現在也稱作ZP4。 這一命名法例如用于Uniprot/SWISSprot、 ensEMBL、 BLAST (NCBI)、 SOURCE、 SMART、 STRING、 PSORT2、 CDART、 UniGene和SOSUI數 據庫中，全部這些數據庫在Bioinformatic Harvester (//harvester.embl.de) 中均提供。
據此，術語ZP1、 ZP2、 ZP3和ZP4被用于本申請中表示4種ZP糖蛋 白家族，其中ZP2、 ZP3和ZP4分別對應于根據Harris et al提出的命名法 的ZPA、 ZPC和ZPB。更具體地，本申請中所用術語hZPl、 hZP2、 hZP3 和hZP4分別指具有包含SEQ ID NO.l、 SEQ ID N0.2、 SEQ ID NO.3和 SEQIDNO.4的序列的多肽骨架的(糖)蛋白。
在本申請說明書及權利要求書中，動詞"包含(to comprise)"及其動詞
變形形式在其非限制性意義上進行使用，意指包括該詞之后的各項，但不 排除未特別提及的項。此外，通過不定冠詞"a"或"an"限定的組件不排除存 在超出一種所述組件的可能性，除非上下文中明確規定存在一種或僅有一 種所述組件。因此，不定冠詞"a"或"an"通常意指"至少一種"。
本申請所用術語"卵巢癌"指原發性卵巢腫瘤以及可位于機體任何部位 的所述原發性卵巢腫瘤的轉移。根據本發明的方法也可以有利地用作使用 任何傳統方法(包括例如卵巢切除手術、放射治療和/或化療)對患者進行 治療期間或之后的輔助治療。然而，公知許多傳統抗癌治療(例如化療和 放療)可以是高免疫抑制的。因此，對于本領域技術人員而言將很清楚， 當進行所述治療后，本發明的方法的效力可能會更低。本發明提供適用于 治療原發性卵巢癌及其轉移的方法(治療性治療)，以及用于預防在其他治 療方法(例如上面所描述的方法)之后或聯合其他治療方法時卵巢癌的轉移 和/或復發的方法(預防性治療)。 對于本發明的方法而言，待治療的人為女性，優選幼年女性、絕經前 女性或絕經早期女性。在停經后的女性中，大多數卵泡將自卵巢消失。剩
下的卵泡不能表達足夠量的ZP糖蛋白用于開展初級自身免疫應答，使得 通過ZP接種來治療和/或預防卵巢癌的本發明的方法更不可能在所述停經
后的女性(相對幼年、絕經前和絕經早期的女性)中獲得成功。所述雌性哺 乳動物特別優選是幼年或絕經前雌性。
本申請所用術語"表位"指典型地通過肽定義的抗原的一部分，當其存
在于體內生理相關環境中時能夠引發細胞或體液免疫應答。"T細胞表位" 指與MHC分子結合并且當存在于MHC分子中時被T細胞所識別的肽或 其部分。T細胞表位能夠經由在雜二聚聘MHC分子中的直接或間接呈遞 誘導細胞介導的免疫應答。簡言之，MHC分子優先結合稱作"錨"殘基的特 定氨基酸殘基(K. Falk et al.， Nature 351:290-96 (1991))。這一特征允許將I 類和II類MHC識別表位鑒定在任何已知肽序列的范圍內。在本說明書 中，術語"MHC限制性表位"與T細胞表位同義。本申請所用術語"I類 MHC限制性表位"指由細胞毒性T淋巴細胞(也稱作CD8+細胞或CTL)聯 合I類MHC所識別的肽序列。本申請所用術語"II類MHC限制性表位"指 由輔助性T細胞(也稱作CD4+細胞或HTL)所識別的肽。"B細胞表位"是 抗原的一部分，典型地是一種肽，其能夠結合免疫球蛋白的抗原結合位點 并因此能夠刺激體液應答而不存在于MHC分子中。如在前面所解釋的那 樣，可用于本發明中的多肽或編碼所述多肽的核酸包含至少一種T細胞表 位。然而，本發明不排除使用還包含B細胞表位的多肽。本發明的免疫原 性多肽還可以包括多種T細胞表位，以及任選地包括B細胞表位。但在多 肽中存在多種表位時，所述表位可以串聯排列；或者以嵌合或重疊構形存 在，其中兩個或多個表位可共享至少一個氨基酸殘基。
本發明的多肽優選包括一或多種MHC I類結合表位。如本領域技術人 員普遍公知的那樣，包含單個肽表位的抗原將僅對治療一 (小)組表達 MHC等位基因產物的患者有用，所述等位基因產物能夠結合該特定的 肽。己預測，在人類，含HLA-A1、 -A2、 -A3、 -A24和-B7限制性CTL表 位的疫苗將為大多數種族背景的大約80%的個體提供保護。因此，如果本 發明的方法被用以治療人類女性，特別優選本發明的多肽來源包含有效量 的包含一種、更優選兩種、最優選三種選自HLA-A1、 HLA-A2、 HLA-
A3、 HLA-A24和HLA-B7限制性表位的結合I類MHC的天然ZP表位的 一或多種不同的多肽或其同系物，或編碼所述一或多種多肽或其同系物的 一或多種核酸序列。
根據另一個實施方式，本發明的多肽優選包括一或多種MHC II類結 合表位。在人類中，最經常被發現的MHC II類等位基因產物包括HLA-DR1、 -DR3、 -DR4和-DR7。因此，優選本發明的多肽來源包含有效量的 一或多種不同的多肽或其同系物或編碼所述一或多種多肽或其同系物的一 或多種核酸序列，所述一或多種不同的多肽包含一種、更優選兩種、最優 選三種選自HLA-DR1、 HLA-DR3、 HLA-DR4和HLA-DR7限制性表位的 結合II類MHC的天然ZP表位。
在另一個實施方式中，本發明的多肽來源包含有效量的一或多種多 肽、其同系物或編碼所述多肽或其同系物的一或多種核酸序列，如本申請 上面所述，所述一或多種多肽包含一或多種MHC I類結合表位和一或多種 MHCII類結合表位。甚至，更優選地所述來源包含有效量的一或多種不同 的多肽或所述一或多種多肽的同系物或編碼所述多肽或其同系物的一或多 種核酸序列，所述多肽總共基本包括了一種天然ZP糖蛋白中所含的全部 MHC I類和MHC II類結合表位。
在一個實施方式中，本發明的多肽來源包含有效量的一或多種不同的 免疫原性多肽或所述一或多種多肽的同系物或編碼它們的一或多種核酸序 列，所述一或多種不同的多肽總共包含天然ZP糖蛋白中所含的至少 50°/o、更優選至少70%、更優選至少80%、更優選至少90%和最優選至少 95%的MHC I類和MHC II類限制性結合表位。
在一個優選的實施方式中，本發明的多肽來源包含有效量的免疫原性 多肽或所述多肽的同系物或編碼所述多肽或其同系物的核酸序列，所述多 肽包含天然ZP糖蛋白的完整氨基酸骨架的至少50%、更優選至少70%、 更優選至少80%、更優選至少90%和最優選至少95%。
在另一個特別優選的實施方式中，多肽來源包含有效量的天然ZP糖 蛋白的多種不同的重疊多肽片段或所述多肽的同系物或編碼所述多肽或其 同系物的一或多種核酸序列，所述不同的重疊多肽片段的長度介于18-60 個氨基酸并總共包含所述天然ZP糖蛋白的完整氨基酸骨架的至少50%、 更優選至少70%、更優選至少80%、更優選至少卯°/。和最優選至少95%。
典型地，不同的連續16-80個氨基酸多肽片段之間的氨基酸重疊為至少7 個氨基酸、優選至少8個、更優選至少9個和最優選至少10個氨基酸。
對最常見的MHC I類和II類等位基因的MHC結合基序已有記載。這 些基序詳細列舉了用作用于特定的MHC I類和II類等位基因的MHC結合 錨的氨基酸殘基。考慮了所述MHC結合錨以及肽的氨基酸序列的復雜的 基于計算機的算法被用于預測并定量所述肽/MHC的相互作用的結合親和 力。因此，從輸入透明帶(糖)蛋白的己知氨基酸序列開始，這些算法列出 了全部潛在的T-細胞表位，每個表位帶有其相應的預測性的結合評分。公 知的用于這些目的的生物信息學工具包括HLA_BIND、 SYFPEITHI、 NetMHC和TEPITOPE 2000 (參見參考文獻1-6)。或者，本領域技術人員 能夠利用標準實驗試驗性地確定出HTL和CTL結合表位(Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience 2004》
在某些情況下，已觀察到相同的肽可以結合幾種MHC I類和II類等 位基因產物。在一個實施方式中，尤其優選在本發明的方法中使用這種 "濫交(promiscuous)"MHC結合肽。
根據本發明的方法的施用給人的"多肽來源"可以包含蛋白質、所述蛋 白質的消化產物和/或其片段，其可以以純化形式存在或可以包含在(優選 生物來源的)粗制組合物中，例如原核或真核細胞系的裂解產物、超聲處 理產物或固定產物。或者，所述免疫原性多肽來源可以包含化學合成的 (多)肽或體外酶促產生的多肽，其可以以純化形式存在或可以包含在粗制 組合物中。所述多肽來源也可以是來自RNA或DNA模板的編碼所述多肽 的核酸。所述RNA或DNA分子可以是"裸露"DNA，優選包含于小泡或脂 質體中，或可以包含于載體中。所述載體可以是本領域中已知的任何(重 組)DNA或RNA載體，優選是質粒，在所述質粒中編碼潛伏抗原的基因 被可操縱地連接至賦予所編碼的信使的表達和翻譯的調控序列。所述載體 還可以是任何DNA或RNA病毒，例如但不限于腺病毒、腺伴隨病毒 (AAV)、反轉錄病毒、慢病毒、改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)或雞痘病 毒，或者任何其它能夠賦予宿主表達包含潛伏表位的多肽的能力的病毒載 體。DNA載體可以是非整合的(例如附加型復制載體)或者可以是通過隨 機整合或通過同源重組整合在宿主基因組中的載體。可以適當地用于本發 明的、摻入人ZP2 cDNA的質粒的構建的例子可以在Martinez et al.的出版
物((1996) Journal of Reproduction and Fertility Supplement 50:35-41)中找
到，該文獻通過引用并入本發明。
任選地含于載體(例如病毒或質粒)中的包含編碼根據本發明的多肽的 基因的DNA分子可以整合在宿主的基因組中。在本發明的一個優選的實 施方式中，這樣的宿主可以是一種微生物。優選地，這樣的重組微生物是 能夠將根據本發明的多肽或其片段輸送至宿主的分枝桿菌，例如結核分枝 桿菌或牛分枝桿菌以及最優選地是牛分枝桿菌卡介苗(BCG)。重組BCG 和用于重組的方法是本領域中已知的，例如在WO2004094469中所記載 的。可以將這種重組微生物配制成重組活疫苗和/或減毒活疫苗，如在 Jacobs et al. 1987, Nature, 327(6122):532-5)中所記載的那樣。所述載體也可 以包含在細菌來源的宿主中，例如但不限于活的減毒的和/或重組志賀氏菌 或沙門氏菌。
在一個實施方式中，本發明提供了一種用于在人類女性中誘導針對天 然透明帶糖蛋白的初級免疫應答的方法，其中所述方法包括給所述人施用 一種多肽來源或編碼所述免疫原性多肽的核酸序列的步驟，所述肽包含I 類MHC-和/或II類MHC-限制性天然透明帶T細胞表位或其免疫活性變 體，其中所述多肽來源包含有效量的選自透明帶糖蛋白、其同系物和所述 多肽和其同系物的免疫活性片段。根據本發明的一個優選實施方式，所述 透明帶蛋白選自ZP1蛋白、ZP2蛋白、ZP3蛋白和ZP4蛋白，更優選ZP2 蛋白和ZP3蛋白，最優選ZP2蛋白。
術語"其免疫活性片段"在本領域中將通常被理解為是指包含至少一個 表位的多肽抗原的片段，這意味著該片段至少包含來自所述多肽抗原的序 列的4、 5、 6、 7或8個連續的氨基酸。根據本發明，所述片段至少包含T 細胞表位。因此，根據本發明的"免疫活性片段"包含來自ZP蛋白抗原或 其同系物或類似物的序列的至少8、 9、 10、 11、 12、 13或14個連續的氨 基酸。更優選地，所述片段同時包含CTL和T輔助細胞表位。然而，更優 選地，所述片段是一種需要通過抗原呈遞細胞加工的肽，即所述片段具有 至少約18個氨基酸的長度，所述18個氨基酸不一定是來自所述多肽抗原 的連續序列。
本申請所用術語"其同系物"指由于小的修飾而不同于天然存在的多肽 的多肽，但其保留了天然存在形式的基本的多肽和側鏈結構。這種改變包
括但不限于 一或幾條氨基酸側鏈的改變、 一或幾個氨基酸的改變(包括 缺失(例如所述肽的截短形式)、插入和/或取代)、 一或幾個原子的立體化 學的改變、和/或小的衍生化(包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙
酰化、豆蔻酰化、異戊烯化、palmitation、氨基化和/或添加糖基化磷脂酰 肌醇)。在本申請中，同系物或類似物相對于天然存在的多肽具有增強的或 基本相似的功能性。典型地，當例如通過利用缺省參數的GAP或 BESTFIT程序進行最佳比對時，天然存在的多肽與其同系物享有至少某一 百分比的序列相同性。GAP利用Needleman和Wunsch的全局比對算法， 對兩條序列在其全長上進行比對，使匹配數最大化并使缺口數最小化。通 常，使用GAP缺省參數，其中缺口產生罰分=8，缺口延長罰分=2。對 于蛋白質而言，缺省得分矩陣為Blosum62 (Henikoff & Henikoff， 1992， PNAS 89， 915-919)。用于百分比序列相同性的序列比對和得分可以通過計 算機測序確定，例如GCG Wisconsin Package (版本10.3，可獲自Accelrys Inc., 9685 Scranton Road， San Diego, CA 92121-3752, USA)。或者，百分比 相似性或相同性可以通過搜索數據庫(例如FASTA、 BLAST等)確定。
在本申請中，同系物被理解為包含與前面提及的天然存在的ZP多肽 具有至少70%、優選至少80%、更優選至少90%、更優選至少95%、更優 選至少98%、以及最優選至少99%的氨基酸序列相同性并仍然至少能夠引 發可由此獲得的免疫應答的免疫原性多肽。在本申請中，同系物或類似物 可以包含取代、插入、缺失、額外的N-或C-末端氨基酸、和/或額外的化 學部分(例如碳水化合物)以增加穩定性、溶解性和免疫原性。
根據本發明的一個優選實施方式，上面所定義的本發明的免疫原性多 肽是糖基化的。不希望受到理論的束縛，假定通過這些多肽的糖基化，其 免疫原性被提高。因此，根據本發明的一個優選實施方式，如本申請中前 面所定義的前述免疫原性多肽是糖基化的，其具有的碳水化合物含量占糖 蛋白或糖基化多肽的總量的從10wt。/。至80wt%。更優選地，所述碳水化合 物含量從15wt。/。至70wt。/c)，更優選從20wt。/。至60wt%。在另一個實施方式 中，所述糖基化免疫原性多肽包含與對應的被治療的人的透明帶糖蛋白 (或其片段)的糖基化模式相類似的糖基化模式。假定這更進一步提高了所 述多肽的免疫原性。因此，優選所述免疫原性多肽包含與對應的人ZP糖 蛋白或其片段的的糖基化模式相類似的糖基化模式。 根據一個特別優選的實施方式，多肽來源包含有效量的選自人透明帶 蛋白的免疫原性多肽、其同系物和這些蛋白及其同系物的免疫活性片段、
或編碼所述免疫原性多肽的核酸序列。優選地，所述人透明帶蛋白(hZP 蛋白)選自hZPl蛋白、hZP2蛋白、hZP3蛋白和hZP4蛋白。根據一個更優 選的實施方式，所述蛋白選自hZP2蛋白和hZP3蛋白，更優選所述蛋白是 hZP2蛋白。
根據一個特別優選的實施方式，本發明的免疫方法包括施用免疫活性 多肽片段來源，所述多肽片段選自如前面所定義的透明帶蛋白片段和/或其 同系物，所述多肽片段包含顯性CTL和/或HTL表位且所述片段具有介于 18個氨基酸和45個氨基酸之間的長度。如WO 02/070006中所描述的那 樣，已觀察到具有介于18個氨基酸和45個氨基酸之間的長度的肽提供了 更佳的免疫原性特性。優選地，肽可以化學合成且任選地可以(部分)重疊 和/或也可以與其它分子、肽或蛋白質連接。如PCT/NL03/00929和Welters et al. (Vaccine. 2004 Dec 2; 23(3):305-11)中那樣，也可以將肽融合形成合成 的蛋白質。還可以優選給所述肽的氨基或羧基末端添加化學部分或額外的 (修飾的或D-)氨基酸以增加所述肽的穩定性和/或降低其生物降解性。為 了提高免疫原性，可以例如通過脂化或糖基化結合免疫刺激部分。為了增 強所述肽的溶解性，可以添加荷電氨基酸或極性氨基酸以增強溶解性并增 加體內的穩定性。
為了免疫的目的，前述的根據本發明的免疫原性多肽也可以與蛋白質 融合，所述蛋白例如是但不限于破傷風毒素/類毒素、白喉毒素/類毒素或 其它載體分子。根據本發明的多肽也可以優選與熱激蛋白融合，例如在(參 考文獻Rapp UK and Kaufhiann SH, Int Immunol. 2004 Apr; 16(4):597-605; Zugel U, Infect Immun. 2001 Jim; 69(6):4164-7)中所描述的作為免疫顯性肽 的載體的重組內源性(鼠)gp96 (GRP94)，或與Hsp70的融合蛋白(Triebel etal; W09954464)。
可以將本發明的免疫原性(多)肽的單個氨基酸殘基通過肽鍵或模擬肽 鍵(peptide bond mimetic)摻入所述肽中。本發明的擬肽鍵包括本領域技術 人員公知的肽骨架修飾。這種修飾包括酰胺態氮、a-碳、羰基酰胺、酰胺 鍵的完全取代、延長、缺失或骨架交聯等修飾。通常參見Spatola， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids， Peptides and Proteins, Vol. VII
(Weinstein ed., 1983)。幾種肽骨架修飾是已知的，包括v [CH2S] 、 \|/ [CH2NH]、 \j/ [CSNH2]、 \)/ [NHCO〗、\|/ [COCH2]和\}/ [(E)或(Z) CH-CH]。 上面所使用的命名法遵循前面Spatola的建議。在本申請中，ij/指沒有酰胺 鍵。取代酰胺基團的結構于括號中詳細說明。
氨基酸模擬物也可以摻入所述多肽中。本申請所使用的"氨基酸模擬 物"是不同于天然存在的氨基酸的部分，其在構象和功能上用作本發明的 多肽中的氨基酸的替代物。如果不妨礙所述肽引發抗天然ZP T細胞表位 的免疫應答的能力，這樣的部分用作氨基酸殘基的替代物。氨基酸模擬物 可以包括非蛋白氨基酸，例如P-、 y-、 s-氨基酸，p-、 Y-、 s-亞氨基酸(例 如哌啶_4_羧酸)以及許多L-a-氨基酸的衍生物。許多適當的氨基酸模擬物 是本領域技術人員已知的，它們包括環己基丙氨酸、3-環己基丙酸、L-金 剛烷丙氨酸、金剛垸乙酸及類似物。Morgan and Gai加r， (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252討論了適用于本發明的肽的肽模擬物。
根據一個優選的實施方式，本發明的方法包括施用包含一或多種如上 面所定義的本發明的免疫原性多肽和至少一種賦形劑的組合物。賦形劑是 帶J藥領域中已知的，可以例如在教科書(Remmington's pharmaceutical sciences, Mack Publishing, 1995)中找到。佐劑可以包含疫苗接種領域中任 何已知的佐劑，并可以利用教科書(例如Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 2004)進行選擇。
佐劑在本申請中意欲包括當與抗原聯合使用對人或動物進行免疫時，
刺激免疫系統從而激發、增強或促進抗所述抗原的免疫應答(優選不產生 針對佐劑本身的特異性免疫應答)的任何物質或化合物。與在相同條件但 缺少佐劑的條件下產生的抗所述抗原的免疫應答相比，優選的佐劑使抗給 定抗原的免疫應答增強至少1.5、 2、 2.5、 5、 10或20倍。用于在一組動物 或人中測定通過佐劑產生的抗給定抗原的免疫應答相對于對應的對照組的 統計學平均增強的檢測是本領域中可利用的。所述佐劑優選能夠增強抗至 少兩種不同抗原的免疫應答。本發明的佐劑將通常是人的外源化合物，從 而排除了人的內源性免疫剌激性化合物(例如白介素、千擾素和其它激 素)。
許多佐劑是本領域技術人員所公知的。適當的佐劑包括，例如弗氏不 完全佐劑、明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰
胺(thr-MDP)、 N-乙酰-去-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(CGP 11637，稱作 nor-MDP)、 N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚 酰-sn-甘油基-3-羥基-磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835 A，稱作MTP-PE)、 DDA (2 二甲基二十八烷基溴化銨)、polyIC， Poly-A-poly-U、 RIBFM、 GERBIFM、 Pam3TM、 CarbopoITM、 SpecolTM、 TitermaxTM、破傷風類毒 素、白喉類毒素、腦膜炎球菌外膜蛋白、白喉蛋白CRM197。優選的佐劑 包含被存在于抗原呈遞細胞上的Toll-樣受體(TCR)識別的配體。各種被 TCR識別的配體是本領域中已知的，包括例如脂肽(參見例如WO 04/110486)、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸質、脂阿拉伯甘露糖、(來自支原 體或螺旋菌的)脂蛋白、雙鏈RNA(聚I:C)、非甲基化DNA、鞭毛蛋白、 含CpG的DNA和咪唑喹啉以及這些配體的具有化學修飾的衍生物。
本發明的用于免疫的方法可以進一步包括施用(優選共同施用)CD40 結合分子以增強CTL應答并從而增強本發明的方法及組合物的治療效果。 CD40結合分子的應用在WO 99/61065中被描述，該文獻通過引用并入本 發明。所述CD40結合分子優選是一種抗體或其片段或CD40配體或其變 體，并可以獨立地添加或可以含于根據本發明的組合物中。對于治療性應 用而言，以足以誘導針對天然ZP糖蛋白和表達ZP糖蛋白的組織細胞的初 級自身免疫應答的量，將本發明的免疫原性多肽或編碼它們的核酸序列或 包含這些多肽或編碼它們的核酸序列的本發明的組合物施用給患有卵巢腫 瘤及其可能存在的轉移的患者或接受了其它治療卵巢腫瘤的方法(例如前 面所述的傳統方法)的患者。足以實現該目的的量被定義為"治療-"或"預 防-有效劑量"。所述有效劑量將取決于多種因子(包括患者的健康狀況或總 體狀態)。因此，可以通過經過訓練的醫療人員確定和調節劑量制度以提供 最佳的治療和預防效果。
在本發明的方法中，典型地將一或多種免疫原性多肽以約lpg/kg患者 體重或更高的劑量施用至少1次。通常劑量超過10pg/kg。根據本發明， 所述劑量優選在從lpg/kg至于lmg/kg的范圍。
根據一個優選的實施方式，典型的劑量制度包括l-1000ng/kg、更優選 10-500pg/kg、甚至更優選10-150pg/kg的劑量， 一周施用一次、兩次或三 次，共施用一周、兩周、三周、四周或五周。根據一個優選的實施方式， 施用10-100pg/kg， 一周一次，共一周或兩周。
優選地，本發明的方法包括經腸胃外或口服途徑(優選腸胃外途徑)施 用本發明的免疫原性多肽和包含它們的組合物。在本發明的另一特別優選 的實施方式中，本發明的方法包括陰道施用本發明的免疫原性多肽和包含 它們的組合物。
本發明的另一實施方式包括給來自患者血液的單個核細胞(尤其是自
其分離的DC)離體施用包含本發明的免疫原性多肽的組合物。可以使用促 進DC的收獲的藥物，例如Progenipoietin.TM. (Monsanto, St. Louis, Mo.)或 GM-CSF/IL-4。用肽脈沖所述DC并進行洗滌以除去未結合的肽后，將所 述DC再灌注入所述患者。在這一實施方式中，提供了包含肽脈沖的DC 的組合物，所述DC將HLA分子中被脈沖的肽表位呈遞到它們的表面。 應用離體的肽脈沖的DC誘導免疫應答的方法是本領域技術人員所公知 的。
本發明的另一方面涉及一種藥物制劑，其包含本申請前面所定義的作 為活性成分的本發明的多肽來源。更具體地，藥物制劑包含作為活性成分 的一或多種前述的免疫原性多肽，所述免疫原性多肽選自ZP蛋白、其同 系物和所述ZP蛋白的片段及其同系物，或如苯申請前面所定義的基因治
療載體o
根據第一個實施方式，提供了一種藥物制劑，其包含一或多種本發明 的免疫原性多肽。所述多肽在所述藥物組合物中的濃度可以變化很大，即
從低于按重量計的約0.1% (通常為約按重量計的至少1%)至差不多按重量 計的20%或更高。
優選地，所述組合物除活性成分外至少包含一種藥學上可接受的載 體。該藥學上的載體可以是適于輸送所述免疫原性多肽或基因治療載體給 患者的任何相容的、非毒性物質。例如，對于多肽而言，可以將滅菌水、 醇、脂肪、蠟質和惰性固體用作載體。藥學上可接受的佐劑、緩沖劑、分 散劑及類似物也可以摻入所述藥物組合物中。
根據一個特別優選的實施方式，本發明的藥物組合物包含一種如在本 申請前面更詳細地定義的佐劑。用于摻入本發明的組合物中的佐劑優選選 自被抗原呈遞細胞上存在的Toll樣受體(TLR)所識別的一組配體，包括脂 肽(參見例如WO 04/110486)、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸質(liopteichoic acids)、脂阿拉伯甘露糖、(來自支原體或螺旋菌的)脂蛋白、雙鏈RNA(聚I:C)、非甲基化DNA、鞭毛蛋白、含CpG的DNA和咪唑喹啉以及這些配 體的具有化學修飾的衍生物。本領域技術人員將能夠確定這些待摻入本發 明的藥物制劑以賦予它們足夠的免疫原性的佐劑中的任何一種的確切的 量。根據另一個優選的實施方式，本發明的藥物制劑可以包含一或多種用 以增強如本申請中前面所解釋的CTL免疫性的額外成分。根據一個特別優 選的實施方式，本發明的藥物制劑包含CD40結合分子。
制備包含多肽的藥物組合物的方法在US 5,789,543和US 6,207,718中 有記載。優選的形式取決于希望的施用和治療性應用的模式。
對于基因治療而言，可以將包含編碼本申請前面所定義的免疫原性多 肽的核酸序列的載體(例如質粒、噬粒、噬菌體、粘粒、病毒、反轉錄病 毒、附加體或轉位因子)摻入藥物組合物中。基因治療載體可以通過例如 靜脈注射、局部施用(參見US 5,328,470)或通過立體定向注射(參見例如 Chen et al， /WJS 91:3054-3057， 1994)輸送給對象。所述基因治療載體的藥 物組合物可以包括于可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或者可以包括其 中埋入了基因輸送載體的緩慢釋放基質。或者，在可以從重組細胞(例如 反轉錄病毒載體)產生完整基因輸送載體的情況下，所述藥物制劑可以包 括一或多種產生所述基因輸送系統的細胞。
本發明的免疫原性多肽優選腸道外施用。用于腸道外施用的制劑的多 肽必須是無菌的。在凍干和重建之前或隨后，可以通過無菌過濾膜過濾容 易地實現滅菌。根據已知的方法，用于施用所述肽的腸道外途徑例如是通 過靜脈注射或灌注、腹膜內、肌內、動脈內、皮下或病變內途徑。通過灌 注或通過大丸劑注射連續施用所述多肽。典型的用于靜脈內灌注的組合物 可以被制成含有10-50ml無菌的0.9% NaCl或5%葡萄糖(任選地補充20% 的白蛋白溶液)和介于10pg和50mg (優選介于50嗎和10mg)的所述多 肽。典型的用于肌內注射的藥物組合物可以被制成含有例如l-10ml無菌緩 沖液和介于IO嗎和50mg (優選介于50昭和10mg)的本發明的多肽。用于 制備可腸道外施用的組合物的方法在本領域中是公知的，并在多種來源中 有詳細記載，包括例如Remington's Pharmaceutical Science (15th ed.， Mack Publishing, Eastern, PA， 1980)(對于全部目的，通過引用以其整體并入本發 明)。
對于口服施用，所述活性成分可以以固體劑量形式(例如膠囊、片劑 和粉劑)或液體劑量形式(例如酏劑、糖漿和懸浮劑)被施用。可以將活性 組分與無活性成分及粉末狀載體(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀 粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂 及類似物) 一起封裝在明膠膠囊中。可進行添加以提供所需的顏色、味 道、穩定性、緩沖能力、分散性或者其他已知所需特性的額外的無活性成 分的例子有氧化鐵紅、硅膠、十二烷基硫酸鈉、二氧化鈦、可食用白墨及 類似物。類似的稀釋劑可以用于制備壓制片劑。片劑和膠囊均可以制成緩 釋產品以用于在數小時的時期內持續釋放藥物。壓制片劑可以是糖包被的 或膜包被的以掩蓋任何令人不愉快的味道并保護所述片劑免遭空氣破壞， 或者是腸溶包衣的以選擇性地在胃腸道中裂解。用于口服施用的液體劑量 形式可以含有色素和調味劑以增加患者接受度。
多種陰道藥物輸送系統是本領域中己知的。適當的系統包括乳膏、泡 沫劑、片劑、凝膠、液體劑量形式、栓劑和陰道栓劑。包含與水接觸后能 夠膨脹并擴散到粘膜表面上的弱交聯聚合物的粘膜吸附性凝膠和水凝膠已 被用于通過先前的陰道途徑進行肽和蛋白質的接種。已提出了用于肽和蛋 白質藥物的陰道輸送的微球體的應用。包括賦形劑的陰道施用的劑量形式 的更詳細的規格及制備所述劑量形式的實際方法對本領域人員而言是己知
的或將是顯而易見的。例如，Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed.， Mack Publishing, Eastern, PA， 1980)。
用于本發明的免疫原性多肽可以使用重組技術制備，其中在適當的宿 主細胞中表達編碼感興趣的多肽的核苷酸序列(例如在Ausubel et al.， "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-Interscience， New York (1987)和Sambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York中所描述的宿主細胞，所述 文獻均通過引用以其整體并入本發明)。還參見Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488 (記載了定點誘變)以及Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734或Wells, J.A., et al, (1985) Gene 34:315 (記載了盒式突變)。
利用桿狀病毒制備重組人ZPA和ZPB的例子可以在前述的Martinez et al.的出版物((1996) Journal of Reproduction and Fertility Supplement 50:35-41)中找到。
利用細菌(大腸桿菌)、酵母細胞(巴斯德畢赤酵母)、昆蟲細胞(苜蓿 銀紋夜蛾多核型多角體病毒 (Autographa califomica multiple nuclear polyhedrosis virus))和中國倉鼠卵巢細胞(CHO)作為表達系統制備重組人 ZPA和ZPB的例子在Harris et al.的出版物((1999) Protein Expression and Purification 16:298-307)中被公開，該出版物通過引用并入本申請。
因此，本發明的一個方面涉及包含如本申請前面所定義的編碼本發明 的免疫原性多肽的核酸分子。優選地，所述載體是復制型載體，其包含確 保所述載體在所述載體的適當的宿主中的增殖的復制起點(或自主復制序 列)。或者，所述載體能例如通過同源重組或別的方式整合到宿主細胞的 基因組中。特別優選的載體是表達載體，其中編碼如上定義的多肽的核苷 酸序列被可操縱地相連接于能夠指導所述編碼序列在用于所述載體的宿主 細胞中的表達的啟動子。
本申請所用術語"啟動子"指功能為控制一或多個基因的轉錄的核酸片 段，其位于相對于所述基因的轉錄起始位點的轉錄方向的上游，并通過用 于依賴于DNA的RNA聚合酶的結合位點、轉錄起始位點和任何其它的 DNA序列(包括但不限于轉錄因子結合位點、抑制或活化蛋白結合位點) 以及本領域技術人員己知的直接或間接調控從所述啟動子轉錄的量的任何 其它的核苷酸序列的存在進行結構上的確認。"組成型"啟動子是在最佳生 理和發育條件下具有活性的啟動子。"誘導型"啟動子是根據生理或發育條 件而被調控的啟動子。"組織特異性"啟動子僅在特定類型的分化細胞/組織 中有活性。
如在Ausubel et al.， "Current Protocols in Molecular Biology", Greene
(2001， supra)(均通過引用以其整體并入本發明)中所記載的那樣，表達載 體使得可以利用重組技術制備如上定義的免疫原性多肽，其中在適當的細 胞(例如培養細胞或多細胞生物體的細胞)中表達編碼感興趣的多肽的核苷 酸序列。還參見Kunkel (1985) Proc, Natl. Acad. Sci. 82:488 (記載了定點誘
變)以及Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734或Wells, J.A.， et al. (1985) Gene 34:315 (記載了盒式誘變)。
典型地，將編碼所需多肽的核酸用于表達載體中。短語"表達載體"通 常指能夠影響基因在與所述序列相容的宿主中的表達的核苷酸序列。這些 表達載體典型地至少包括適當的啟動子序列和任選地轉錄終止信號。在本 申請中，也可以使用有效表達所需的或有用的額外的因子。將編碼多肽的 DNA摻入能夠導入體外細胞培養物并在其中表達的DNA構建體中。具體 地，DNA構建體適于在原核宿主(例如細菌如大腸桿菌)中進行復制，或 者能夠被導入培養的哺乳動物、植物、昆蟲(例如Sf9)、酵母、真菌或其 它真核細胞系中。
制備用于導入特定宿主中的DNA構建體典型地包括被所述宿主識別 的復制系統、編碼所需多肽的DNA節段、以及與所述編碼多肽的節段可 操縱地連接的轉錄和翻譯起始和終止調控序列。當DNA節段與另一 DNA 節段功能性相關時，它們被"可操縱地連接"。例如，如果啟動子或增強子 刺激序列的轉錄，其被可操縱地連接至編碼序列。如果信號序列的DNA 作為參與多肽分泌的前體蛋白被表達，所述信號序列的DNA被可操縱地 連接至編碼所述多肽的DNA。通常，被可操縱地連接的DNA序列是連續 的，且在信號序列的情形中是連續的并處于讀框中(in reading phase)。然 而，增強子無需與其控制轉錄的編碼序列是連續的。通過在方便的限制性 位點或在其替代插入的接頭或連接子處的連接實現相連。
適當的啟動子序列的選擇通常取決于選擇用于表達所述DNA節段的 宿主細胞。適當的啟動子序列的例子包括本領域中公知的原核和真核啟動 子(參見，例如Sambrook and Russell, 2001， supra)。所述轉錄調控序列典型 地包括被所述宿主所識別的異源增強子或啟動子。適當的啟動子的選擇取 決于所述宿主，但是啟動子(例如trp、 lac和噬菌體啟動子、tRNA啟動子 和糖酵解酶啟動子)是已知和可利用的(參見，例如Sambrook and Russell, 2001, supra)。表達載體包括復制系統，可以應用轉錄與翻譯調控序列以及 用于編碼節段的多肽的插入位點。細胞系和表達載體的有效組合的例子在 Sambrook and Russell (2001, supra)以及Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36中有記載。例如，適當的表達載體可以在酵母例如釀酒酵母、昆蟲細胞 例如Sf9細胞、哺乳動物細胞例如CHO細胞和細菌細胞例如大腸桿菌中表
達。由于原核細胞不具有糖基化所必需的細胞器官，通過原核細胞產生的 多肽將不具有碳水化合物側鏈。真核細胞不具有糖基化手段，但酵母細胞 將提供與哺乳動物細胞不同的糖基化模式。因此，優選使用提供最"天然 的"糖基化模式的表達系統。最優選哺乳動物細胞。因為假定具有與對應 的人透明帶糖蛋白的糖基化模式相類似的糖基化模式的根據本發明的抗原 能夠增強免疫原性，可以優選使用具有與人的糖基化手段相類似的糖基化
手段的細胞系。適當的細胞系包括CHO細胞(參見例如US 5,272,070)，尤 其是人卵巢或卵泡細胞系(參見WO 99/42581)。
突變蛋白的體外誘變和表達在Ausubel et al. (1987， supra)和Sambrook and Russell (2001， supra)中有廣泛記載。還參見Kunkel (1985， supra;記載 了定點誘變)和Roberts et al. (1987, supra;記載了盒式誘變)。
用于制備本發明的免疫原性多肽的另一方法是應用體外轉錄/翻譯系 統。將編碼多肽的DNA克隆到上述的表達載體中。然后在體外轉錄和表 達所述表達載體。翻譯產物可以直接使用或首先進行純化。盡管由于微粒 體的固有存在可以發生一些翻譯后修飾，體外翻譯產生的多肽典型地不含 有體內合成的多肽上存在的翻譯后的修飾。通過體外翻譯合成多肽的方法 通過例如Berger & Kimmel, Methods in Enzymology， Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego， CA, 1987 (通 過引用以其整體并入本發明)。
因此，本發明的另一方面涉及包含如上述的載體的宿主。所述宿主細 胞可以是如上面指出的原核或真核宿主細胞。所述宿主細胞可以是適于在 液體中或在固體培養基上培養的宿主細胞。或者，所述宿主細胞是多細胞 生物體例如轉基因植物或動物(優選非人動物)的一部分的細胞。
另一方面，本發明涉及用于制備上面所定義的本發明免疫原性多肽的 方法。所述方法包括在有助于多肽的表達的條件下培養上面所定義的宿主 細胞的步驟。任選地，所述方法包括回收所述多肽。可以例如通過標準的 蛋白質純化技術(包括本領域中本身已知的多種層析方法)從所述培養基中 回收所述多肽。
本發明的另一方面涉及一種轉基因動物，在其體細胞和生殖細胞中包 含如上面所定義的載體。所述轉基因動物優選是一種非人動物。用于產生 轉基因動物的方法例如在WO 01/57079及其引用的參考文獻中有記載。這
種轉基因動物可以用于制備如上面所定義的多肽的方法中，所述方法包括 從包含所述載體的轉基因動物或其雌性后代回收體液的步驟，其中所述體
液含有所述多肽；以及任選地從所述體液回收所述多肽。這種方法在WO 01/57079及其引用的參考文獻中也有記載。所述含有多肽的體液優選地是 血液，更優選是乳。
本發明的另一方面涉及一種轉基因植物，在其細胞中包含如上面所定 義的載體。用于產生轉基因植物的方法例如在US 6,359,196及其引用的參 考文獻中有記載。所述轉基因植物可以用于制備如上面所定義的多肽的方 法中，所述方法包括回收在其細胞中包含所述載體的轉基因植物的一部分 或這種轉基因植物的后代的一部分的步驟，其中所述植物部分含有所述多 肽；以及任選地從所述植物部分回收所述多肽。這種方法在US 6,359,196 及其引用的參考文獻中也有記載。
本發明在以下實施例中被進一步說明，所述實施例不以任何方式限制 本發明的范圍。
實施例 實施例l
攜帶小鼠抑制素a亞單位啟動子/猿病毒T-抗原融合基因的雌性轉基 因小鼠在它們的卵巢中自卵泡膜細胞產生了腫瘤。這些腫瘤發生100%的 外顯率和轉移。這些雌性小鼠具有正常動情周期。
對于該研究，使用已利用Harris et al. ((1999) Protein Expression and Purification 16:298-307)描述的方法制備的表達rhZP2的CHO。
在發生卵巢癌(其大約發生在4月齡)之前，在40只雌性轉基因小鼠 中進行該研究用重組人透明帶2蛋白(rhZP2)免疫一組20只小鼠。其它 兩組(每組10只雌性小鼠)包含對照組和假治療組。用rhZP2免疫的小鼠 rhZP2發生在顯微鏡下可見的卵巢炎。尸體解剖時未在用rhZP2接種的小 鼠中發現腫瘤。所有對照組動物和假治療的小鼠發生侵入性卵巢腫瘤且在 全部小鼠中可見到轉移。尸體解剖后，對卵巢稱重作為腫瘤負荷的度量。 對照組和假治療的小鼠產生巨大的腫瘤負荷，涉及卵巢重量增加20-40 倍。用rhZP2免疫的組由于卵巢炎卵巢重量僅顯示出小的增加。
實施例2
攜帶小鼠抑制素a亞單位啟動子/猿病毒T-抗原融合基因的雌性轉基 因小鼠在它們的卵巢中自卵泡膜細胞產生了腫瘤。這些腫瘤發生100%的 外顯率和轉移。這些雌性小鼠具有正常動情周期。
對于該研究，使用已利用Harris et al. ((1999) Protein Expression and Purification 16:298-307)描述的方法制備的表達rhZP2的CHO。
在發生卵巢癌(其大約發生在4月齡)之后，在40只雌性轉基因小鼠 中進行該研究。在研究開始時，全部小鼠患有卵巢腫瘤和轉移。用重組人 透明帶2蛋白(rhZP2)免疫一組20只小鼠。其它兩組(每組IO只雌性小鼠) 包含對照組和假治療組。用rhZP2免疫的小鼠產生在顯微鏡下可見的卵巢 炎。
免疫后，對照組小鼠和假治療的小鼠全部死于卵巢腫瘤及轉移。尸體 解剖時，用rhZP2免疫的小鼠顯示出沒有卵巢腫瘤或小的卵巢腫瘤。
參考文獻
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權利要求
1.包含I類MHC和/或II類MHC限制性天然透明帶T細胞表位或其免疫活性變體的多肽來源用于制備用于治療性和/或預防性治療人卵巢癌和/或其轉移的方法中的藥物的用途。
2. 根據權利要求1的用途，其中的治療方法是一種治療性治療的方法。
3. 根據權利要求1或2的用途，其中所述多肽來源包含有效量的免疫 原性多肽或編碼所述免疫原性多肽的核酸序列，所述免疫原性多肽選自透 明帶蛋白、其同系物和所述蛋白及其同系物的免疫活性片段。
4. 根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述多肽來源包含有效量 的免疫原性多肽或編碼所述免疫原性多肽的核酸序列，所述免疫原性多肽 選自hZPl、 hZP2、 hZP3、 hZP4，其同系物和所述蛋白及其同系物的免疫 活性片段。
5. 根據權利要求4的用途，其中所述免疫原性多肽選自hZP2、其同系 物和所述蛋白及其同系物的免疫活性片段。
6. 根據權利要求1-5中任一項的用途，其中所述多肽來源包含有效量 的免疫原性多肽片段或編碼所述多肽片段的核酸序列，所述多肽片段選自 天然透明帶蛋白片段和/或其同系物，所述片段的長度介于18個氨基酸和 45個氨基酸之間。
7. 根據權利要求1-5中任一項的用途，其中所述多肽來源包含有效量 的一或多種不同的免疫原性多肽、所述一或多種免疫原性多肽的同系物或 編碼所述多肽或其同系物的一或多種核酸序列，所述一或多種免疫原性多 肽總共包含天然ZP糖蛋白中所含的MHC I類和MHC II類限制性結合表 位的至少50%、更優選至少70%。
8. 根據權利要求1-5中任一項的用途，其中所述多肽來源包含有效量 的免疫原性多肽、所述免疫原性多肽的同系物或編碼所述多肽或其同系物 的核酸序列，所述免疫原性多肽包含天然ZP糖蛋白的完整氨基酸骨架的 至少50%、更優選至少70%。
9. 根據權利要求1-5中任一項的用途，其中所述多肽來源包含有效量 的天然ZP糖蛋白的多種不同的重疊多肽片段、所述多肽片段的同系物或 編碼所述多肽片段或其同系物的一或多種核酸序列，所述不同的重疊多肽片段的長度介于18-60個氨基酸并總共包含所述天然ZP糖蛋白的完整氨基 酸骨架的至少50%、更優選至少70%。
10. 根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述多肽包含與對應的 天然ZP糖蛋白或其片段的糖基化模式相類似的糖基化模式。
11. 根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述方法包括施用、優 選共同施用至少一種佐劑。
12. 根據前述權利要求中任一項的用途，其中所述人是幼年女性或絕 經前女性。
13. 藥物組合物，其包含如權利要求1-10中任一項所定義的多肽來源。
14. 根據權利要求13的藥物組合物，其包含佐劑。
15. 根據權利要求13或14的藥物組合物，其中所述免疫原性多肽是 hZP2、其同系物、或所述蛋白或其同系物的免疫活性片段。
全文摘要
本發明涉及卵巢癌及其轉移的治療性和預防性治療。更具體地，本發明涉及包含與卵巢組織細胞相關的蛋白質或其免疫活性變體的至少一部分的免疫原性多肽，編碼所述多肽的核酸及其在免疫治療方法中的應用。所述免疫原性多肽通過透明帶(ZP)糖蛋白提供。能夠誘導CD8⁺和/或CD4⁺T細胞應答的ZP糖蛋白及其片段以及編碼它們的核酸序列可以適當地用于本發明的免疫治療策略中。
文檔編號A61P35/04GK101365473SQ200680051184
公開日2009年2月11日 申請日期2006年11月16日 優先權日2005年11月16日
發明者B·H·J·T·科林格, V·莫妮克 申請人:潘塔希生物科學股份有限公司