專利名稱：Pdcd4重組表達載體在制備治療卵巢癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種PDCD4重組表達載體的應用，尤其涉及一種PDCD4重組表達載體在制 備治療卵巢癌藥物中的應用。
技術背景卵巢癌是最常見的三大婦科惡性腫瘤之一，其死亡率居婦科惡性腫瘤之首。目前臨 床主要采取手術切除和聯合化療，但總體療效不理想。這是因為卵巢癌缺乏完善的早期 診斷方法，70%的患者就診時已屬晚期而無法進行手術；再加上目前在臨床上應用的傳 統抗癌藥物大都屬于細胞毒性藥物，其臨床療效的高低往往取決于癌癥細胞對藥物的敏 感性。傳統抗癌藥物存在著治療窗相對較窄，對實體瘤效果較差，不良反應大，長期用 藥后易出現耐藥性的缺點，所以傳統方法難以治愈，60%的患者最終將復發和轉移。晚 期卵巢癌的5年生存率仍低于30%。隨著分子生物學、免疫學和病毒學的發展，基因治療 已成為逐漸成為現實。通過對致瘤基因的抑制或缺陷基因的修復，基因治療已成為卵巢 癌繼手術、化療和放療之后的第四種治療模式，日益受到人們的重視。實現腫瘤基因治療的關鍵是要使用高效安全的基因導入系統。用于基因治療的載體 系統可分為病毒性載體和非病毒性載體兩類。目前常用的病毒載體包括逆轉錄病毒載 體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等，腺病毒、慢病毒 載體都能轉導非分裂期細胞，二者在基因治療中都具有廣泛的應用前景。腺病毒載體是 一種非常有效的轉基因載體，具有高效率、高滴度、低致病性及不整合入宿主細胞染色 體等優點。然而，第一、二代腺病毒載體仍有許多不足之處，如包裝容量小、細胞毒性 大、免疫原性強及表達時相短等。因此，在第一、第二代腺病毒載體的基礎上發展了第 三代腺病毒載體，又稱輔助病毒依賴型腺病毒(helper-d印endent adenovirus)或空殼 載體(gutless vector),既保留了傳統腺病毒載體的優點，又具有安全、長效、高容 量等特點，表現出在人類基因治療中的特殊優勢及良好前景。空殼載體不僅保留了傳統 腺病毒載體基因轉載效率高的優點，還進一步提高了安全性，擴大了基因的轉載容量， 并且大幅延長了目的基因的表達時間，具有其它轉基因載體所無法比擬的優越性。第三 代腺病毒載體不僅繼承了傳統腺病毒載體的優點，還有其獨特優勢(l)由于其不表達 腺病毒自身蛋白，顯著降低了細胞毒性與免疫原性，安全性更好，表達目的基因的時間 更長；(2)轉載容量大大提高，達到36kb，可同時表達多個基因及一些能控制基因表達 的調控因子；(3)由輔助病毒決定載體的血清型，采用不同的輔助病毒就可包裝出不同 血清型的空殼載體。第三代腺病毒載體能夠克服傳統腺病毒載體的基因泄漏表達及包裝 容量有限等缺點，可反復應用于臨床治療。由于上述優點，腺病毒載體已成為當前基因 治療中基因轉移載體研究的熱點,人們對它寄予了攻克和治愈腫瘤的厚望。實現腫瘤基因治療的另一關鍵是要選擇合適的目的基因。與其他腫瘤一樣，卵巢癌 的發生是與細胞增殖分化有關的癌基因、抑癌基因多階段相互作用的結果，目前已發現 K-ras、 c-myc、 c-erb2(Her-2/neu)等癌基因和P53、 P16、 BCRA1等抑癌基因與卵巢癌密切相關。P53基因是目前研究最深入的抑癌基因，30-8096的卵巢癌病人存在P53突變。野生型的P53蛋白(wtP53)好比"分子警察"，監視著細胞基因組的完整性，如果DNA受損，則 wtP53通過轉錄調控機制使細胞分裂停滯于Gl期，以便使細胞有足夠的時間修復損傷； 若修復失敗，則啟動程序性死亡而引發細胞自盡，即細胞凋亡。若wtP53功能喪失，則 導致基因異常有癌變傾向的細胞生長而引發腫瘤。此外，原癌基因c-myc的表達也受p53的抑制。因此當p53基因突變，c-myc過度表達 時易出現腫瘤。目前研制的p53基因治療藥物大都是通過各種方式將正常的野生型p53基 因導入腫瘤細胞，替換突變基因，利用野生型基因誘導細胞凋亡的作用來抑制腫瘤細胞' 的生長。將野生型p53基因轉導入腫瘤細胞的載體包括病毒載體和非病毒載體兩種，前 者又包括腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒相關病毒載體和單純皰疹病毒載體等， 后者主要以脂質體，特別是陽離子脂質體載體為主。2003年10月16日，我國食品藥品監 督管理局(SFDA)正式頒給深圳賽百諾基因技術有限公司研制的重組人p53基因腺病毒 注射液(商品名為今又生) 一類新藥證書，批準其用于實體癌，特別是頭頸部癌的基因 治療，這一事實意味著世界上第一種p53基因治療藥物在中國誕生，標志著我國在基因 治療癌癥臨床和基因藥物產業化方面正在加快追趕世界先進水平的步伐。國外目前也有 兩種以腺病毒為載體的p53基因治療藥物正處于臨床試驗后期階段。Introgen Therapeutics公司正在美國和歐洲開展有關Advexin (INGN201)治療頭頸部癌、卵巢癌 的m期臨床試驗，治療肺癌的II期臨床試驗，以及治療其他5種癌癥的I期臨床試驗。 在頭頸部癌臨床試驗中，瘤內單獨注射Advexin可使47X的受試者病情穩定或改善。此外， 瘤內注射Advexin結合放療可明顯改善局限性肺癌患者的l年和2年生存率。先靈葆雅研 制的腺病毒型p53基因治療藥物SCH58500聯合其他化療藥物治療晚期卵巢癌的in期臨床 試驗也正在進行當中，目前發現，多次注射SCH58500的患者的生存率要明顯長于單次給 藥患者。PDCD4是1995年Shibahara等在小鼠體內發現的與細胞凋亡有關的基因。此后Goke A 等和0nishi Y等又先后在大鼠及人類中發現該基因的存在。已知人PDCD4基因定位于 10q24, cDNA全長約3.5kb,其中編碼區約1.4kb。 PDCD4編碼蛋白約469氨基酸，在PDCD4 的氨基側有兩個重要的a螺旋結構區一MA3， PDCD4通過該功能域與真核細胞翻譯起始因 子elF4A發生結合，從而抑制核糖體復合物的形成和蛋白質的合成，促進細胞凋亡；另 外，PDCD4還有多個與其活化有關的蛋白激酶的磷酸化位點。Northern blot分析小鼠 的正常組織發現PDCD4的分布在肝臟表達最高，其次是睪丸、肺、腦、腎及脾，而在骨 骼肌和心臟中表達較低。在大多數正常組織細胞中，PDCD4蛋白主要位于細胞核中，當 細胞周圍環境發生改變，例如營養條件下降或細胞發生惡性增殖時，它可以通過核輸出 信號(NES)轉移到細胞漿中。近來在小鼠實驗模型中PDCD4被確定為新的抑癌基因來自小鼠實驗模型的研究結 果證明PDCD4對腫瘤具有明顯抑制作用，是一種新的抑癌基因。主要證據有(1)來自 小鼠表皮細胞JB6模型轉化試驗的結果提示PDCD4是一種抑癌基因；JB6細胞有兩種，一 種是對腫瘤誘導劑敏感、易向腫瘤細胞轉化的細胞(P+);另一種是不易受腫瘤誘導劑影 響、不易向腫瘤細胞轉化的細胞(P—)。差異顯示結果證實PDCD4在JB6P—細胞中高表達， 而在JB6P+細胞系是低表達的。在穩定轉染PDCM的JB6P+細胞系中，PDCD4的過表達可抑 制細胞的惡性轉化；(2) PDCD4轉基因小鼠模型的研究也證明PDCD4是一種抑癌基因Jansen AP等在PDCD4轉基因小鼠模型中發現，PDCD4的表達不僅抑制了表皮乳頭狀瘤的 形成，而且降低了表皮乳頭狀瘤向皮膚癌的惡性轉化和皮膚癌的發生率；(3)來自PDCD4 基因敲除小鼠的研究結果從另一方面證明了PDCD4確實是一種抑癌基因。HilliardA等 進一步發現敲除PDCD4基因后，84W小鼠產生惡性B細胞淋巴瘤。與其他腫瘤抑制基因相類似，PDCD4在人類某些腫瘤細胞系以及腫瘤標本中存在著 明顯的表達缺失Jansen AP等檢測了 60種來自腎臟、肺臟、結腸、乳腺以及神經膠 質細胞的腫瘤細胞系屮PDCD4的表達情況，結果顯示在mRNA和蛋白水平PDCD4均有表 達較低或缺失，但是PDCD4在蛋白水平表達的缺失率明顯高于RNA水平，證實人PDCD4 也是一種抑癌基因。有資料顯示肺癌中PDCD4缺失率高達83呢。而且PDCD4缺失與腫瘤 的分化程度降低以及預后效果不良密切相關；在胰腺癌中亦發現癌組織中的PDCD4表達 與癌旁組織相比明顯降低，而且PDCD4的低表達與腫瘤的分化程度密切相關。目前研究顯示，PDCD4的抑癌機制主要有以下幾方面(1) PDCD4通過抑制腫瘤細 胞翻譯過程中起始復合物的形成來抑制腫瘤的生長。研究顯示PDCD4蛋白能直接與 elF4A相互作用，從而阻斷elF4A與elF4G結合，進而阻斷翻譯的順利進行。(2) Hsin-ShengYang等的結果顯示PDCD4可通過下調絲裂原活化的蛋白激酶1 (MAPK4K1) 的表達，阻斷c-Jun的活化，從而抑制AP-1依賴的轉錄活性，進而抑制結腸癌細胞的 轉移。(3) Jin H等利用咪唑丙烯酸(UAC)修飾的聚氨基葡糖/PDCD4基因復合物氣霧 吸入治療K-ras裸鼠肺癌模型，結果顯示UAC/PDCD4復合物可促進肺癌細胞的凋亡；還 可抑制腫瘤血管生成。綜上所述，PDCD4作為一種新發現的抑癌基因具有抑制腫瘤生長，抑制其惡性表型 的作用，這些結果提示PDCD4在卵巢癌中也可能發揮重要作用，具有潛在的臨床應用價 值。發明內容針對目前制備治療卵巢癌基因藥物的不足，本發明的目的是提供一種PDCD4重組表 達載體在制備治療卵巢癌藥物中的應用。具體地說是利用新型抑癌基因PDCD4對卵巢癌 細胞生長抑制的特點，通過構建獲得PDCD4重組表達載體，進而制備治療卵巢癌的藥物， 充分利用其自身抑癌基因的特點，使PDCD4在卵巢癌細胞中高效表達，實現治療卵巢癌 的目的。本發明所述PDCD4重組表達載體在制備治療卵巢癌藥物中的應用。其中所述PDCD4重組表達載體是PDCM基因與病毒性載體或非病毒性載體構建的重組表達載體；進一步優選PDCD4重組表達載體是PDCD4基因與病毒性載體構建的重組表達載體。上述PDCD4基因包含人PDCD4基因cDNA全長編碼序列；所述病毒性載體優選是腺病毒 或慢病毒，其中病毒性載體中最優選使用的是腺病毒；所述非病毒性載體優選是質粒。本發明的技術方案是基于申請人的前期研究，在前期研究中，申請人首先利用 RT-PCR技術檢測了來源于人槳液性乳頭狀囊腺癌的卵巢癌上皮細胞系SK0V3中PDCD4 mRNA的表達，并利用免疫組化技術檢測了43例漿液性囊腺癌組織中PDCD4的表達，結果 發現卵巢癌細胞系中PDCD4的表達明顯下調，卵巢癌組織中50-60% PDCD4表達下調或缺 失，且與腫瘤分化程度和預后密切相關。在此基礎上，申請人通過構建PDCD4重組病毒轉染腫瘤細胞后使其高表達PDCD4后，通過腫瘤細胞生長曲線、集落形成率、成瘤率等 的檢測及體內腫瘤生長速率的動態觀察等，不僅進一步證實PDCD4對腫瘤的抑制作用， 而且為應用PDCD4治療腫瘤及其藥物開發提供強有力的實驗依據，具有重大的理論價值 和良好的應用前景。本發明所述PDCD4重組表達載體在制備治療卵巢癌藥物中的應用及效果驗證，具體 方法是(1) 根據目的基因相關信息(序列，序列號等)，構建含有外源基因的重組表達載體；(2) 對于測序正確的重組質粒，提取和純化高質量的不含內毒素的重組質粒； 例如以正常人血細胞mRNA為模板，合成含有PDCD4的質粒載體或以其為模板通過PCR獲得目的基因，將目的基因定向克隆至病毒穿梭質粒構建陽性重組PDCD4，篩選陽 性克隆，測序正確后，提純和純化高質量的不含內毒素的PDCD4重組病毒載體(3) 使用高效重組載體和病毒包裝質粒共轉染293T細胞，進行病毒包裝擴增，獲 得重組病毒顆粒；(4) 收集病毒液；濃縮、純化病毒液；(5) 用高純度的病毒液感染腫瘤細胞，以腫瘤生物學研究指標檢測腫瘤細胞的生 存情況；(6) 通過定量PCR精確測定病毒滴度(高精確滴定方法)和Western分析實驗結果；(7) 用高滴度的病毒液感染宿主細胞；檢測基因功能以及使用藥物進行穩定轉染 細胞株的篩選。上述腫瘤生物學研究指標主要包括腫瘤細胞的生長曲線、腫瘤細胞集落形成能力以 及成瘤能力等。試驗證實通常狀況下，篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩定性。 本發明應用新型抑癌基因PDCD4重組表達載體治療卵巢癌，經試驗證明使用PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞能夠明顯抑制卵巢癌細胞的生長。所產生的積極效果是(1)通過抑制卵巢癌細胞的生長周期抑制細胞生長(見圖l、圖2)、集落形成能力(見圖3)和腫瘤細胞的成瘤能力，對動物模型體內的卵巢癌也同樣具有良好的抑制效果(見圖4); (2)重組病毒的獲得使其治療腫瘤的療效更佳，不僅可以使PDCD4在腫瘤細胞內高效表達，而且有利于更好地發揮其自身抑癌基因的特點， 提高患者的生存率和生存質量，從而改善其預后。提示PDCD4重組病毒制備治療卵巢癌 的基因藥物在臨床中的應用將是一種值得關注的治療方案，對于其藥物開發提供強有力 的實驗依據，具有重大的理論價值和良好的應用前景。本發明的研究表明使用PDCD4重組表達載體轉染腫瘤細胞，不僅能夠高效轉導腫瘤 細胞,而且在體內能實現目的基因穩定的長期表達,且反復應用不易引起免疫反應，提高 了基因治療的有效性及安全性。病毒在宿主細胞內，能以病毒RNA為模板在自身反轉錄酶 (RT)的作用下合成cDNA，再以此cDNA為模板合成雙鏈DNA，經環化后通過病毒整合酶(IN) 作用整合在宿主細胞的染色體上并長期表達。因此，以病毒基因組為基礎除去其復制所 需要的基因而代之以治療基因和選擇性標記物,構建而成的病毒載體具有轉移基因片段 容量大、不易誘發宿主免疫反應、安全性較好、不僅能感染分裂細胞最大特點是還能用 于感染不分裂細胞如神經細胞、造血干細胞、肌纖維細胞和肝細胞等；穩定整合于靶細胞的基因組,治療基因表達時間長，在基因治療中具有廣泛的應用前景，其臨床應用前 景更優。本發明提供了可高效治療卵巢癌并含有新型抑癌基因PDCD4的重組表達載體和釆用 該重組表達載體進行制備治療卵巢癌藥物的方法。迄今為止，尚未有應用攜帶該基因的 重組表達載體治療卵巢癌的研究報告。本發明通過將編碼PDCD4基因的核苷酸序列插入重組表達載體基因組中，制備治療 卵巢癌的化學藥物，使其在腫瘤細胞內高效表達，用以治療卵巢癌，并抑制卵巢癌細胞 的生長以及轉移。此方法有望應用于卵巢癌的臨床治療，改善患者的預后，提高患者的 生存率，延長患者的生存時間。


圖l:示PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞后明顯抑制細胞生長周期，使G2-M期明顯降 低。1為SK0V3組;2為SK0V3-Mock (空載體)組；3為SK0V3-PDCD4組。 圖2:示PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞后細胞的生長曲線。圖3:示PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞后明顯抑制細胞克隆形成，使腫瘤細胞克隆 數明顯減少。圖4:示裸鼠體內PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞后腫瘤的生長曲線。
具體實施方式
本發明的試驗中優選使用的重組表達載體是病毒性載體(購自武漢大學病毒所)， 病毒性載體中優選使用的是腺病毒 1.構建和生產PDCD4重組腺病毒 (1)腺病毒表達載體的構建1) PDCD4基因克隆入pMD-18T質粒根據PDCD4的cDNA序列(包括信號肽)設計一對特 異性寡核苷酸引物，上游引物序列為5' -CTGAGCACATATGATGAATCAAACTGCGATTCTGAT-3', 下游引物序列為5'-GAGGATCCTTMGGAGATCTTTTAGACATTTC-3'。以噬菌體人肺cDNA文 庫為模板，使用上述上、下游引物，用Pyrobest高保真DNA聚合酶擴增目的基因PDCD4。 PCR參數是94 'C, 30 s; 53 'C, 1 min; 72 'C， 1 min, 30個循環。1%瓊脂糖凝膠電 泳回收PCR產物。用T4連接酶在合適的緩沖液中連接pMD-18T與回收片段16'C、 lh。連接 產物轉化DH5a,在Amp+LB平板上37'C培養12h。挑取陽性克隆，經HindIII和XbaI雙酶 切鑒定。正確克隆命名為pMD-18T/PDCD4。2) 將PDCD4基因亞克隆入穿梭載體將質粒pMD-18T/PDCD4和pAdTrack-CMV-p38分別 經HindIII和XbaI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收，回收產物用T4DNA連接 酶于16'C過夜連接后再轉化感受態DH5a菌。在Kana+LB平板上37'C培養20 h，挑取較小 的陽性克隆。經HindIII和XbaI雙酶切鑒定正確后命名為pAdTrack-CMV/PDCD4。3) BJ5183大腸桿菌感受態細胞的制備取凍存的大腸桿菌BJ5183菌液1 iil分別稀釋 到lmlLB中，再從中取10nl，鋪AMP+的LB平板，置37'C溫育過夜。取出LB平板，分別 挑取單克隆于5mlLB中，37'C， 220r/min， 震蕩培養4h。分別取菌液lml加入100mlLB 細菌培養液中，37'C震蕩培養至D600-0.3時，將細菌分裝到無菌的、冰預冷的50ml聚丙 烯管中，在冰上放置IO min,使培養物冷卻至O'C。 4'C， 4000 r/min,離心10min;棄 上清。分別加入4。C預冷的0. lmol/LCaCl210ml,混勻，冰上放置約30 min。 4'C， 4000r/min,離心10min,棄上清。分別加入4'C預冷的0. lmol/LCaCl22 ml,混勻，置4'C過夜。加入10%無菌甘油，混勻，置冰上分裝于EP管中，-80'C凍存備用。(2) 細菌內同源重組產生重組腺病毒質粒取lyg pAdTrack-CMV/PDCD4用Pmel線性化后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠 回收目的片斷。挑取凍存的已含pAdEasy-1的BJ5183菌，用CaCl2法制備高效感受態，再 將l U g線性化pAdTrack-CMV/PDCD4轉入含有pAdEasy-1的BJ5183菌；取適量的細胞在 Kana+的平板中，37'C培養16-20h;挑取陽性克隆，抽提質粒鑒定后再轉入DH5 a菌中。 重組病毒質粒命名為pAd/PDCD4。用PacI對pAd/PDCD4重組病毒質粒進行酶切鑒定。(3) 重組腺病毒載體在HEK293細胞的包裝和擴增從轉化入pAd/PDCD4重組質粒的DH5a菌中提取質粒DNA10w g,用PacI酶切使之線性 化，同時切去Kan和Ori等載體構件，暴露反轉錄末段重復序列。酶切產物加入1/10體積 的3mol/L冷NH4Ac與2.5倍體積的無水乙醇，-20'C沉淀DNA, 4'C進行11000r/min離心 20mim棄上清；加入75%冷乙醇溶液，離心洗滌2次，每次5min，棄上清；空氣干燥， 加入ddH20溶解DNA并定量。培養HEK293細胞，按照廠家說明用Polyfect進行細胞轉染， 2d后用熒光顯微鏡進行觀察。7-10d后收集細胞，離心沉淀后在37'C/-80'C條件下反復 凍融4次，4r、 7000g離心5min，取部分病毒上清再次感染HEK293細胞以擴增重組病毒。(4) 重組腺病毒的鑒定重組病毒Ad/PDCD4的鑒定取病毒上清2y 1，煮沸10min以制備病毒基因組DNA。以重 組病毒基因組DNA為模板，以擴增PDCD4的上、下游引物按前述條件進行PCR反應。2.體外實驗通過PDCD4重組病毒感染人卵巢癌細胞系，研究PDCD4表達或過表達 對卵巢癌細胞的生長的影響■ PDCD4重組腺病毒轉染卵巢癌細胞系將卵巢癌細胞株SK0V3細胞置于1640培養液(含10"M、牛血清)中，在37。C、 5%0)2的水 飽和條件下孵箱內培養，常規更換培養液，消化傳代。實驗用細胞均處于對數生長期。 細胞SK0V3以1. 8X105接種于6cm培養皿，在5%00237°(:條件下培養2411后換以新鮮培養液， 根據需要分別加入200 u 1的重組腺病毒懸液(100 MOI)繼續培養24h后，換以新鮮培養液， 培養72h后在熒光顯微境下觀察GFP基因的表達。■用RT-PCR和Westernblot方法檢測PDCD4在轉染后人卵巢癌細胞系(購自中國科 學院上海細胞庫)中的表達用Trizol—步法按說明書分別提取細胞總RNA，以32磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為 內參照，采用半定量RT-PCR分析PDCD4mRNA的表達。引物序列如下PDCD4上游引物5' TGG CAC TCT GCT TGC TCA CC 3' ， PDCD4下游引物:5， CTC ATC CAC AAT GCC CGT CT 3，，產物長度為179bp;內參照GAPDH的序列，上游引物5' TGG GGA AGG TGA AGG TCG GA 3，，下游引物5， GGG ATC TCG CTG CTC GAA GA 3，，產物長度為673bp。 PCR產 物經2%瓊脂糖凝膠系統電泳(含0. 5g/L溴化乙啶)，用GDS28000凝膠成像分析系統拍照鑒定,圖像分析軟^^定量分析。Western印跡檢測PDCD4蛋白的表達用含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解溶液裂解收集 的細胞，經BCA蛋白質濃度測定試劑盒進行蛋白質定量。等量的細胞總蛋白(10ug/泳 道)上樣進行電泳[12 %十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)]，一抗采用美 國Upstate公司兔抗PDCD4抗體(1 : 2000)和兔抗GAPDH(1 : 5000), 二抗采用美國Sigma公 司抗兔IgG2辣根過氧化物酶(服P) (1 : 5000)。最終用以色列Biological industries公司EZ-ECL熒光底物試劑盒曝光顯影。畫流式細胞術分析PDCD4轉染后人卵巢癌細胞系細胞凋亡與細胞周期的變化情況 取1X1(T個PDCD4重組腺病毒轉染后的SK0V3細胞，以1000r/min的轉速離心5min,棄上清。加入lxPBS輕輕振蕩使細胞懸浮，經PI染色，應用流式細胞術檢測細胞周期。結果如圖l示PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞后明顯抑制細胞的生長周期，使G2-M期的細胞數明顯減少。■ OLYMPUS 1X71-F22FL/PH熒光倒置顯微鏡觀察PDCD4在轉染前后人卵巢癌細胞系 生長的形態學變化，并繪制生長曲線結果如圖2示PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞后明顯抑制細胞生長，使細胞數量明顯 減少。■集落形成實驗觀察PDCD4轉染后人卵巢癌細胞系集落形成程度的變化情況 取PDCD4重組腺病毒轉染后的SK0V3細胞，胰蛋白酶消化制備細胞懸液、計數，接種 于6孔板，1500個細胞/孔。常規培養，每日觀察克隆形成情況，2周后，利用20%甲醇固 定細胞并用結晶紫染色，鏡下計數>50個細胞的克隆數。計算克隆形成率克隆形成率 (%)=克隆數/接種細胞X10(m。結果如圖3示PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞后明顯 抑制細胞克隆形成，使腫瘤細胞克隆數明顯減少。3.體內實驗用PDCD4重組病毒感染人卵巢癌細胞系，在裸鼠體內研究PDCD4表達對卵巢癌細胞生長和轉歸的影響■皮下注射卵巢癌細胞系構建荷瘤裸鼠模型本實驗使用的18只SPF級4 6周齡BALB/c雌性裸鼠由上海中科院斯萊克實驗動物中 心提供。在每只裸鼠右側腋下接種5X105個SK0V3細胞，6-7天成瘤后，將實驗動物隨機 分為3組①PBS對照組；②空載體對照組；③注射PDCD4重組腺病毒組。每組采用6只裸 鼠，分別瘤內注射PBS、空載體、PDCD4重組腺病毒。此后每周定期測量腫瘤的長徑和短 徑，計算腫瘤的體積。4周后無痛處死動物，分離皮下形成的腫瘤并稱重。結果如圖4示 PDCD4表達載體轉染卵巢癌細胞后明顯抑制腫瘤的生長。
權利要求
1、PDCD4重組表達載體在制備治療卵巢癌藥物中的應用。
2、 根據權利要求l所述的應用，其特征在于所述PDCD4重組表達載體是PDCD4基因 與病毒性載體或非病毒性載體構建的重組表達載體。
3、 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述PDCD4重組表達載體是PDCD4基因與病毒性載體構建的重組表達載體。
4、 根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于所述PDCD4基因包含人PDCD4基因 cDNA全長編碼序列。
5、 根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于所述病毒性載體是腺病毒或慢病毒。
6、 根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述病毒性載體是腺病毒。
7、 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述非病毒性載體是質粒。
全文摘要
本發明公開了一種PDCD4重組表達載體在制備治療卵巢癌藥物中的應用。本發明通過將編碼PDCD4基因的核苷酸序列插入重組表達載體基因組中，制備治療卵巢癌的化學藥物，使其在腫瘤細胞內高效表達，用以治療卵巢癌，并抑制卵巢癌細胞的生長以及轉移。本發明為抗癌藥物開發提供強有力的實驗依據，具有重大的理論價值和良好的應用前景。
文檔編號A61K48/00GK101219222SQ200710115320
公開日2008年7月16日 申請日期2007年12月11日 優先權日2007年12月11日
發明者霞 張, 張利寧, 朱法良, 群 王, 王曉燕, 春 郭, 飛 高, 魏增濤 申請人:山東大學