專利名稱：抗-系統asc氨基酸轉運蛋白2(asct2)抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識別系統ASC氨基酸轉運蛋白2(以下稱為“ASCT2”)的細胞外區域的天然三維結構并與該細胞外區域結合；產生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA ;包含所述DNA的載體；可通過導入所述載體獲得的轉化體；利用所述雜交瘤或轉化體生產抗體或其抗體片段的方法；和利用所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及利用所述抗體或其抗體片段的診斷試劑。
背景技術：
ASCT2多肽是由541個氨基酸構成的全長10次跨膜蛋白，并依賴鈉離子發揮將中性氨基酸轉運過細胞膜的轉運蛋白的功能。氨基酸轉運蛋白根據包括底物特異性等在內的功能功能特征分成幾個系統。ASCT2屬于系統ASC并具有依賴鈉離子進行中性氨基酸例如L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、和L-谷氨酰胺的細胞內攝取的功能(非專利文獻I)。此外，ASCT2是D型猿逆轉錄病毒和三種C型病毒[貓內源病毒(RD114)，狒狒內源病毒，和鳥類網狀內皮組織增殖病毒](非專利文獻2和3)共享的病毒細胞表面受體。ASCT2也被稱為2型鈉依賴性中性氨基酸轉運蛋白，脂肪細胞氨基酸轉運蛋白，AAAT，中性氨基酸轉運蛋白B，ATB，氨基酸轉運蛋白Β°，ΑΤΒ°，ΑΤΒ0，狒狒M7病毒受體，M7V1，M7VS1，胰島素活化氨基酸轉運蛋白，FLJ31068，RDl 14病毒受體，RDl 14/猿D型逆轉錄病毒受體，RDR, RDRC,或R16 (非專利文獻I和3)。此外，作為另一個名稱，ASCT2被稱為溶質載體家族I (中性氨基酸轉運)、成員5、溶質載體家族I成員5或SLC1A5，并屬于SLCl家族。關于癌癥發展和ASCT2或SLC1A5表達之間的關系，利用表達序列標簽(EST)數據庫已經發現，SLC1A5、SLC7A5和SLC38A5三者在癌組織中的表達水平顯著增加(非專利文獻4)。此外，在正常肝臟中沒有發現SLC1A5的表達，但是在肝細胞癌或肝母細胞瘤的臨床組織中發現SLC1A5的表達(非專利文獻5)。另外已經發現，在低分化的星形細胞瘤或多形性膠質母細胞瘤的臨床組織中SLC1A5的表達比在正常組織中高(非專利文獻6)。此外，通過免疫組織學染色或Western印跡法，在大腸癌和前列腺癌臨床組織中檢出了 ASCT2的表達，而高度表達ASCT2的患者的后果較差(非專利文獻7和8)。此外，A SCT2擔負大腸癌、肝癌、乳腺癌、星形細胞瘤和神經母細胞瘤的幾個細胞系中谷氨酰胺的攝取(非P專利文獻9至12)，并通過利用ASCT2的底物丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸混合物來競爭性抑制谷氨酰胺的細胞內攝取，從而抑制了細胞增殖(非專利文獻9)。至于與ASCT2結合的抗體，已知的是抗人ASCT2的細胞內N-末端或C-末端部分肽的多克隆抗體(非專利文獻13、14和15)。因為這些抗體全都是識別ASCT2的細胞內部分，所以它們不能與細胞的細胞膜上表達的ASCT2相結合。已知當抗體與細胞膜上表達的抗原蛋白結合時，在生物體內誘導了抗體的效應子活性引起的細胞毒性，例如抗體依賴性細胞的細胞毒性(以下稱為“ADCC活性”)或補體依賴性細胞毒性(以下稱為“CDC活性”)(非專利文獻16)。但是，因為這些抗體不能與細胞的細胞膜上表達的ASCT2結合，不能期待由效應子活性引起的這些細胞毒性。另外，因為所有這些抗體是識別ASCT2的細胞內部分的抗體，它們不能抑制由活細胞中表達的ASCT2細胞內攝取氨基酸。另外，識別人類ASCT2的多克隆抗體可以從:LifeSpan BioSciences (產品編號:LS-C16840 和 LC-C31887)，Avia Systems Biology (產品編號:ARP42247_T100)，Santa CruzBiotechnology (產品編號:sc_50698 和 sc-50701)，或 Millipore (產品編號:AB5468)獲得。但是，尚不知道特 異性識別ASCT2的細胞外區域的天然三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻I: J.Biol.Chemistry, 271, 18657 (1996)非專利文獻2:Proc, Natl.Acad, Sc1.USA, 96, 2129 (1999)非專利文獻3:J.Virology, 73，4470 (1999)非專利文獻4:Seminars in Cancer Biology, 15, 254(2005)非專利文獻5:Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol., 283, G1062 (2002)非專利文獻6:NeuroReport, 15，575 (2004)非專利文獻7:Anticancer Research, 22, 2555 (2002)非專利文獻8:Anticancer Research, 23, 3413 (2003)非專利文獻9:J.Surgical Research, 90, 149 (2000)非專利文獻10:J.Cellular Physiology, 176, 166(1998)非專利文獻11:J.Neuroscience Research, 66, 959 (2001)非專利文獻12:Am.J.Physiol.Cell Physiol.，282，C1246 (2002)非專利文獻13:J.Gene Medicine, 6，249 (2004)非專利文獻14:Am.J.Physiol.Cell Physiol.，281，C963 (2001)非專利文獻15:Biochem.J.，382，27 (2004)非專利文獻16 =Cancer Res.，56，1118(1996)
發明概要 本發明要解決的技術問題本發明的目的是提供單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識別ASCT2的細胞外區域的天然三維結構并與該細胞外區域結合；產生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA ;包含所述DNA的載體；可通過導入所述載體獲得的轉化體；利用所述雜交瘤或轉化體生產抗體或其抗體片段的方法；和利用所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及利用所述抗體或其抗體片段的診斷試劑
解決問題的方案本發明涉及以下(I)至(44):(I) 單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識別系統ASC氨基酸轉運蛋白2(以下稱為“ASCT2”)的細胞外區域的天然三維結構并與該細胞外區域結合；(2) (I)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其抑制通過ASCT2細胞內攝取氨基酸；(3) (I)或(2)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其具有細胞的細胞毒性；(4) (3)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其中所述細胞毒性是抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)活性或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性；(5) (I)至(4)任一項所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與人類ASCT2結合而不與小鼠ASCT2結合；(6) (5)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與人類ASCT2的至少EL2區域結合；(7) (6)所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與選自SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列中 154,159 至 160,163 至 171,173 至 174、177、188、204 至 205,207,210 至 212 和 214至223位的至少任何一個氨基酸結合；(8) (I)至(7)任一項所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是與選自雜交瘤KM4008 (FERM BP-10 962)和雜交瘤KM4012 (FERM BP-10963)的任何一種雜交瘤產生的單克隆抗體所識別的表位結合的單克隆抗體；(9) (I)至⑶任一項所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是選自雜交瘤KM4008 (FERM BP-10962)和雜交瘤KM4012 (FERM BP-10963)的任何一種雜交瘤產生的單克隆抗體；(10) (I)至(9)任一項所述的抗體片段，其中所述抗體片段是選自Fab、Fab’、F (ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體化V區(雙抗體)、二硫鍵穩定的V區(dsFv)和包含⑶R的肽的抗體片段；(11) (I)至(10)任一項所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是重組抗體；(12) (11)所述的重組抗體或其抗體片段，其中所述重組抗體是選自人嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體的重組抗體；(13) (11)所述的重組抗體或其抗體片段，其包括⑴至(9)任一項所述的單克隆抗體的重鏈可變區(以下稱為“VH”)和輕鏈可變區(以下稱為“VL”)的互補決定區(以下稱為“CDR”)；(14) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQ ID NO:26、27和28表示的氨基酸序列；(15) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VL的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO:29、30和31表示的氨基酸序列；(16) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID N0:26、27和28表示的氨基酸序列，和抗體的VL的CDRU CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO:29、30和31表示的氨基酸序列；
(17) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO:32、33和34表示的氨基酸序列；(18) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VL的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO:35、36和37表示的氨基酸序列；(19) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID N0:32、33和34表示的氨基酸序列，而抗體的VL的CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO:35、36和37表示的氨基酸序列；(20) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO:49、50和51表示的氨基酸序列；(21) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VL的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NO:52、53 和54表示的氨基酸序列；(22) (13)所述的重組抗體或其抗體片段，其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID N0:49、50和51表示的氨基酸序列，而抗體的VL的CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NO:52、53和54表示的氨基酸序列；(23) (12)所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其包含⑴至⑶的任一項所述的單克隆抗體的VH和VL ；(24) (23)所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其選自其中抗體的VH包含SEQ IDNO: 19表示的氨基酸序列和抗體的VL包含SEQ IDNO: 21表示的氨基酸序列的人嵌合抗體、其中抗體的VH包含SEQ IDNO:23表示的氨基酸序列和抗體的VL包含SEQ ID N0:25表示的氨基酸序列的人嵌合抗體、和其中抗體的VH包含SEQ ID NO:46表示的氨基酸序列和抗體的VL包含SEQ ID N0:48表示的氨基酸序列的人嵌合抗體；(25) (12)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中抗體的VH包含SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列，或其中選自SEQ ID N0:71表示的氨基酸序列中第2位Val、第9位Ser、第20 位 Val、第 30 位 Ser、第 38 位 Arg、第 46 位 Glu、第 86 位 Leu、第 93 位 Val、第 95 位 Tyr和第116位Val的至少一個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；和/或其中抗體的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列，或其中選自SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列中第8位Pro、第15位Val、第38位Gin、第43位Ala、第44位Pro、71位Phe和第87位Tyr的至少一個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列，(26) (25)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中抗體的VH包含的氨基酸序列在SEQ ID N0:71表示的氨基酸序列中導入選自Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val，Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的修飾中的至少一個修飾，和抗體的VL包含的氨基酸序列在SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列中導入選自Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代71位Phe和Phe取代第87位Tyr的修飾中的至少一個修飾；(27) (25)所述的人源化抗體或其抗體片段，其中人源化抗體選自抗體的VH包含SEQ ID NO: 76表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO: 78表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID N0:80表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO: 76表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗體，抗體的VH包含SEQ ID NO: 78表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗體,抗體的VH包含SEQ ID NO: 80表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體，和抗體的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗體；(28)產生(I)至(27)任一項所述的單克隆抗體的雜交瘤；(29) (28)所述的雜交瘤，其中所述雜交瘤是雜交瘤KM4008(FERM BP-10962)或雜交瘤 KM4012(FERM BP-10963)；(30)編碼(I)至(29)任一項所述的抗體或其抗體片段的DNA ；(31)包含(30)所述的DNA的重組載體；(32)可通過將(31)所述的重組載體導入宿主細胞而獲得的轉化體；(33)生產(I)至(27)任一項所述的抗體或其抗體片段的方法，包括在培養基中培養(28)或(29)所述的雜交瘤或(32)所述的轉化體以在所述培養物中形成和累積(I)至(27)任一項所述的抗體或其抗體片段，和從所述培養物收集所述抗體或其抗體片段； (34)包含(I)至(27)任一項所述的抗體或其抗體片段作為活性成分的ASCT2相關疾病的治療藥；(35) (34)所述的治療藥，其中所述與ASCT2相關的疾病是癌癥；(36) (35)所述的治療藥,其中所述癌癥是血液癌,食道癌，胃癌,大腸癌,肝癌或前列腺癌；(37)免疫學檢測或測量ASCT2的方法，其利用(I)至(27)的任一項所述的抗體或其抗體片段；(38) (37)所述的方法，其中所述免疫學測量方法是免疫沉淀法；(39)免疫學檢測或測量表達ASCT2的細胞的方法，其利用(I)至(27)任一項所述的抗體或其抗體片段；(40) (39)所述的方法，其中所述免疫學檢測方法是熒光細胞染色法；(41)免疫學檢測或測量ASCT2的試劑，其利用(I)至(27)任一項所述的抗體或其抗體片段；(42) ASCT2相關疾病的診斷試劑，其利用⑴至(27)任一項所述的抗體或其抗體片段；(43) (42)所述的診斷試劑，其中所述與ASCT2相關的疾病是癌癥；和(44) (43)所述的診斷試劑,其中所述癌癥是血液癌,食道癌，胃癌,大腸癌,肝癌或前列腺癌。發明的有益效果本發明能提供單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識別ASCT2的細胞外區域的天然三維結構并與該細胞外區域結合；產生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA ;包含所述DNA的載體；可通過導入所述載體獲得的轉化體；利用所述雜交瘤或轉化體產生抗體或其抗體片段的方法；和利用所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及利用所述抗體或其抗體片段的診斷試劑


圖 1-1 顯示了 NM_005628(SEQ ID NO:1)和HCH0N2001712 (SEQ ID N0:87)的比對。
*表不兩個核苷酸序列在該位置相同。圖 1-2顯示了 NM_005628(SEQ ID NO:1)和HCH0N2001712 (SEQ ID N0:87)的比對。
*表不兩個核苷酸序列在該位置相同。圖 1-3 顯示了 NM_005628(SEQ ID NO:1)和 HCH0N2001712 (SEQ ID N0:87)的比對。*表示兩個核苷酸序列在該位置相同。下劃線處是用于Q-PCR的擴增引物的設計位置(Fw#l對應NM_005628的2281至2301位核苷酸和HCH0N2001712的1689至1709位核苷酸，Rv#l對應NM_005628的2739至2719位反向核苷酸鏈和HCH0N2001712的2139至2119位的反向核苷酸鏈)。圖 1-4 顯示了 NM_005628(SEQ ID NO:1)和 HCH0N2001712 (SEQ ID N0:87)的比對。*表示兩個核苷酸序列在該位置相同。下劃線處是用于Q-PCR的擴增引物的設計位置(Fw#l對應NM_005628的2281至2301位核苷酸和HCH0N2001712的1689至1709位核苷酸，Rv#l對應NM_005628的2739至2719位反向核苷酸鏈和HCH0N2001712的2139至2119位的反向核苷酸鏈)。 圖2-1顯示癌細胞系、異種移植物、正常組織和臨床癌組織中ASCT2基因的mRNA表達水平。圖2-2顯示癌細胞系、異種移植物、正常組織和臨床癌組織中ASCT2基因的mRNA表達水平。圖3顯示通過流式細胞儀測量的抗-myc抗體(抗_myc)和抗-His抗體(抗-His)與固定化的人ASCT2-myc/His基因-導入CHO細胞(ASCT2/CH0)和載體導入CHO細胞(載體/CH0)的反應性。橫坐標表示突光強度,縱坐標表示細胞計數。抗體通過涂黑指示，緩沖液由白色曲線指示。圖4顯示在結合ELISA中，抗ASCT2的N-末端肽的單克隆抗體KM3842與ASCT2的N-末端肽的反應性。橫坐標表示抗體濃度(μ g/mL)，縱坐標表示吸光度比值(0D415/490)。▲表示在利用人ASCT2N-末端肽-THY結合物情況下的吸光度比值和■表示在利用對照肽-THY結合物情況下的吸光度比值。圖5顯示利用熒光細胞染色(流式細胞儀)檢測的抗ASCT2單克隆抗體KM3998與ASCT2-myc/His基因導入的CHO細胞(ASCT2/CH0)、載體導入的CHO細胞(載體/CH0)和KMS-1l的反應性。橫坐標表示突光強度,縱坐標表示細胞計數。KM3998通過涂黑指示,大鼠IgG2a-UNLB由白色曲線指示。圖6顯示利用熒光細胞染色(流式細胞儀)檢測的抗-ASCT2單克隆抗體KM4000、KM4001、KM4008、KM4012 和 KM4018 與人 ASCT2_myc/His 基因導入的 CHO 細胞(ASCT2/CH0)、載體導入的CHO細胞(載體/CH0)和KMS-1l的反應性。橫坐標表示抗體濃度(μ g/mL)，縱坐標表示平均熒光強度。KM511的平均熒光強度由籲和實線表示，KM4000的平均熒光強度由■和粗實線表示，KM4001的平均熒光強度由▲和虛線表示，KM4008的平均熒光強度由O和虛線表示，KM4012的平均熒光強度由□和虛線表示，大鼠IgG2a-UNLB的平均熒光強度由符號□和實線表示，和KM4018的平均熒光強度由▲和粗實線表示。圖7顯示抗-ASCT2單克隆抗體KM3998對人大腸癌細胞系WiDr的谷氨酰胺依賴性增殖的抑制活性。橫坐標表示KM3998的終濃度(μ g/mL)，縱坐標表示以抗體未處理的細胞的增殖作為100%得到的相對值(%)。KM3998的相對增殖率由 和實線表示，大鼠IgG2a-UNLB的相對增殖率由符號X和實線表示，AST混合物的相對增殖率由虛線表示。圖8 顯示抗-ASCT2 單克隆抗體 KM4000、KM4001、KM4008、KM4012 和 KM4018 對人大腸癌細胞系WiDr的谷氨酰胺依賴性增殖的抑制活性。橫坐標表示各個抗體的終濃度(μ g/mL)，縱坐標表示以抗體未處理的細胞的增殖作為100%得到的相對值(%)。KM4000的相對增殖率由 和實線表示，KM4001的相對增殖率由■和實線表示,KM4008的相對增殖率由Δ和實線表示，KM4012的相對增殖率由O和實線表示，KM511的相對增殖率由X和實線表示，KM4018的相對增殖率由■和實線表示，大鼠IgG2a-UNLB的相對增殖率由X和實線表示，AST混合物的相對增殖率由虛線表示。圖9顯示利用熒光細胞染色(流式細胞儀)檢測的抗-ASCT2人嵌合抗體與人ASCT2-myc/His基因導入的CHO細胞(ASCT2/CH0)和人多發性骨髓瘤細胞系0PM-2的反應性。橫坐標表示抗體濃度(μ g/mL)，縱坐標表示平均熒光強度。CKM4008的平均熒光強度由O和實線表示，CKM4012的平均熒光強度由Λ和實線表示，CKM4018的平均熒光強度由.和實線表示。圖10顯示抗-ASCT2人嵌合抗體對人多發性骨髓瘤細胞系KMS-11的ADCC活性。橫坐標表示抗體濃度(ng/mL)，縱坐標表示ADCC活性。cKM4008的ADCC活性由O和實線表示，CKM4012的ADCC活性由Λ和實線表示，cKM4018的ADCC活性由■和實線表示。圖11顯示抗-ASCT2人嵌合抗體對人ASCT2_myc/Hi s基因導入的CHO細胞(ASCT2/CH0)和人大腸癌細胞系Colo205的⑶C活性。橫坐標表示抗體濃度(μ g/mL)，縱坐標表示⑶C活性。CKM4008的⑶C活性由O和實線表示，CKM4012的⑶C活性由Λ和實線表示，CKM4018的⑶C活性由■和實線表示。圖12顯示抗_asct2人嵌合抗體對人大腸癌細胞系WiDr的谷氨酰胺依賴性增殖的抑制活性。橫坐標表示各個抗體的終濃度(μ g/mL)，縱坐標表示以抗體未處理的細胞的增殖作為100%得到的相對值(%)。KM4008的相對增殖率由O和實線表示，KM4012的相對增殖率由Λ和實線表示，ΚΜ4018的相對增殖率由■和實線表示，ΚΜ511的相對增殖率由+和實線表示，AST混合物的相對增殖率由虛線表示。圖13顯示人ASCT2蛋白和小鼠ASCT2蛋白的示意圖。黑色表示在推定的細胞外區域(EL1，EL2，EL3，EL4和EL5)中人和小鼠蛋白之間不同的氨基酸。
具體實施方案本發明涉及單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識別ASCT2的細胞外區域的天然三維結構并與該細胞外區域結合。

本發明的ASCT2的物種沒有特別的限制。物種的例子可優選是哺乳動物，具體是人類。ASCT2的氨基酸序列信息可以從已知的數據庫例如NCBI (//www.ncb1.nlm.nih.gov/)獲得。實例包括 SEQ ID NO: 2 表示的人 ASCT2 (NCBI 登錄號 NP_005619)，SEQ IDNO: 86表示的小鼠ASCT2(NCBI登錄號NP_033227)，等等。本發明的ASCT2包括包含SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列或者SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基被缺失、取代和/或添加并具有ASCT2功能的多肽。本發明的ASCT2還包括與SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列具有60%以上同源性、優選80%以上同源性、更優選90%以上同源性、更加優選95%以上同源性并具有ASCT2功能的多肽。在本發明中，包含在SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸殘基缺失、取代和/或添加的氨基酸序列的所述多肽，可通過位點特異性誘變得到[MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實驗室手冊，第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989) ；Current Protocols in Molecular Biology(現代分子生物學技術)，John Wiley & Sons (1987-1997)，Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)，Prop, Natl.Acad Sc1.，USA, 79, 6409(1982)，Gene, 34, 315(1985)，Nucleic AcidsResearch, 13, 4431 (1985), Proc.Natl Acad Sci USA,迎，488 (1985)]。例如，其可在具有帶有SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的多肽的編碼核苷酸序列中導入位點特異性突變而得至IJ。被缺失、取代和/或添加飛氨基酸殘基數量沒有特別限定。適當的數量是I至數十個，優選I至20個，更優選I至數個，更加優選I至5個。編碼ASCT2的基因的實例包括SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列。編碼ASCT2的基因的實例還包括:其包含的DNA含有在SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列中具有一個或多個核苷酸的缺失、取代或添加的核苷酸序列、并編碼具有ASCT2功能的多肽的基因；其包含的DNA含有與SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列具有至少60%以上同源性、優選80%以上同源性和更優選95%以上同源性的核苷酸序列、并編碼具有ASCT2功能的多肽的基因；其包含的DNA在嚴格條件下與具有SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的DNA雜交、并包含具有ASCT2功能的多肽的編碼DNA的基 因；等等。在本發明中，在嚴格條件下雜交的DNA是指通過集落雜交、卩遼斑雜交、Southern雜交、DNA微陣列等，利用具有SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的DNA作為探針而得到的DNA。這樣的DNA的具體實例是雜交的菌落或斑塊來源的DNA，其可如下進行鑒別:在0.7至1.0mol/l氯化鈉存在下，利用其上有固定化PCR產物或寡聚DNA的濾光片或載玻片，在65 °C進行雜交，然后在65°C下用0.1至2-倍濃度的SSC溶液(1-倍濃度SSC溶液:150mmol/l氯化鈉和15mmol/l檸檬酸鈉)洗滌所述濾光片或載玻片。雜交可以根據下列文獻中記載的方法進行:Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(分子克隆:實驗室手冊，第二版)，Cold Spring Harbor Lab, Press (1989), Current Protocolsin Molecular Biology (現代分子生物學技術)，John Wiley & Sons (1987-1997) ;DNACloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition (DNA 克隆 1:核心技術，實用方法)，Oxford University (1995)。具體地說，能夠雜交的DNA包括與SEQ IDNO:1表示的核苷酸序列具有至少60%以上同源性、優選80%以上同源性、更優選90%以上同源性和最優選95%以上同源性的DNA。在編碼真核生物蛋白質的核苷酸序列中，經常發現遺傳多態性。用于本發明的ASCT2基因還包括在核苷酸序列中通過這樣的多態性產生小修飾的基因。除非另有陳述，本發明所記載的同源性數值可以是利用技術人員已知的同源性檢索程序計算的數值。關于核苷酸序列，所述數值可以通過BLAST[J.MotBiol, 215, 403 (1990)]用缺省參數等計算，而關于氨基酸序列，所述數值可以利用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997);Genome Res.,7,649(1997); //www.ncb1.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmll 用缺省參數等計算。作為缺省參數，G (開放缺口成本(cost to open gap))對于核苷酸序列來說是5，對于氨基酸序列來說是11 ;_E (延伸缺口成本(cost to extend gap))對于核苷酸序列來說是2,對于氨基酸序列來說是I ;_q (核苷酸錯配的罰分(penalty for nucleotidemismatch))是-3 ;_r (核苷酸匹配的獎勵(reward for nucleotide match))是 I ;_e (預期值(expect value))是10 ;_W (字長(wordsize))對于核苷酸序列來說是11個殘基,對于氨基酸序列來說是3個殘基；-y (以比特計blast延伸的下降值(X) (dropoff (X) forblast extensions in bits))對于blastn來說是20,對于blastn之外的程序來說是7 ；-X(以比特計的缺口比對的 X 下降值(X dropoff value for gapped alignment in bits))是15 ;和_Z(以比特計的缺口比對的最終X下降值(final X dropoff value for gappedalignment in bits))對 blastn 是 50 和對于 blastn 之外的程序是 25(http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。包含SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽可通過為本領域技術人員所知的方法制備，例如通過部分缺失編碼SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的DNA、并培養導入了包含所述部分缺失的DNA的表達載體的轉化體而制備。基于這樣構建的多肽或DNA，還可以依照上面描述的相同方法，得到在SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代和/或添加一個或多個氨基酸的多肽。還可以通過化學合成方法，例如芴基甲氧基羰基(Fmoc)法、叔丁氧基羰基(tBoc)法等，生產包含SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽，或在SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代和/或添加一個或多個氨基酸的多肽。本發明ASCT2的細胞外區域的實例包括根據SEQ ID NO:2表示的多肽的氨基酸序列，通過已知的跨膜區域預測程序預測的區域，所述預測程序是S0SUI(http;//SOSu1.proteome.bi0.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM 第二版(http: /www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), ExPAsy Proteomics Server (http: //Ca.expasy.0rg/)等。具體地說，范例包括在74至98位、154至224位、287至305位、357至376位和420至425位的五個區，它們是ExPASy Proteomics Server預測的細胞外區域。或者,范例包括在65至88位、152至224位、288至306位、361至380位和447至451位的五個區，它們是文獻[J.Biol.Chemistry.271.18657(1996)]或[J.Virology, 73, 4470(1999)]預測的細胞外區域。在本發明中，所述五個細胞外區域從N-末端側起順序表示為ELl區域、EL2區域、EL3區域、EL4區域和EL5區域。例如，在SEQ ID NO: 2表示的ASCT2多肽的氨基酸序列中的EL2區域對應154至224位或152至224位。本發明的單克隆抗體與ASCT2的細胞外區域結合，優選與ASCT2的細胞外區域中以上所述的ELl至EL5結合，更優選至少與ASCT2的細胞外區域中的EL2結合。本發明中ASCT2的細胞外區域的天然三維結構可以是任意結構，只要它具有的三維結構等同于由具有SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的ASCT2的細胞外區域以天然狀態形成的三維結構即可。
本發明的抗體或其抗體片段是否特異性識別ASCT2的細胞外區域的天然三維結構并與所述細胞外區域結合，可通過利用固相夾心法等的放射免疫分析，或通過利用例如酶免疫分析(ELISA)法等的ASCT2表達細胞的已知免疫檢測方法來證實，優選能夠研究抗體與特定抗原和表達所述特定抗原的細胞結合的方法，例如熒光細胞染色法。例如，具體例子包括利用FMAT8100HTS系統的熒光抗體染色法(Applied Biosystems制造)[CancerImmunol.1mmunother, 36, 373(1993)]等，利用流式細胞術突光細胞染色法，利用Biacore系統的表面等離子體共振(GE Healthcare制造)等，或其它方法。此外，已知的免疫學檢測方法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition (單克隆抗體-原理和實踐，第三版)，Academic Press (1996) ；Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal AntibodyExperimental Manual (單克隆抗體實驗手冊)，Kodan-sha Scientific (1987)]等可加以組合來驗證結合。在本發明中，表達ASCT2的細胞可以是任意細胞，只要它表達ASCT2即可，例子包括天然存在于人體的細胞、從天然存在于人體的細胞建立的細胞系、通過基因重組技術得到的細胞等等。天然存在于人體的細胞包括在癌癥患者體內表達多肽的細胞，例如通過活組織檢查得到的在腫瘤細胞中表達ASCT2的細胞等。從天然存在于人體的細胞建立的細胞系的例子包括通過建立從上述癌癥患者得到的ASCT2-表達細胞而制備的細胞系中，表達ASCT2的細胞系，例子還包括多發性骨髓瘤細胞系KMS-1l [人類科學研究資源庫(HSRRB)序號JCRBl 179]，RPMI 8226(HSRRB序號:JCRB0034)等。通過基因重組技術得到的細胞的具體例子可包括通過將包含ASCT2-編碼cDNA的表達載體導入昆蟲細胞、動物細胞等得到的ASCT2-表達細胞，等等。本發明的單克隆抗體包括通過雜交瘤生產的抗體和通過用包含抗體編碼基因的表達載體轉化的轉化體生產的重組抗體。雜交瘤可以例如如下制備:制備表達ASCT2作為抗原的上述細胞，從用所述抗原免疫的動物誘導抗原特異性的抗體生產細胞，和將該抗體生產細胞與骨髓瘤細胞融合。而抗-ASCT2抗體可以如下得到:培養雜交瘤或將所述雜交瘤細胞施用到動物中以在所述動物中引起腹水腫瘤，分離和提純所述培養物或腹水。用抗原免疫的動物可以是任何動物，只要可以制備雜交瘤即可，小鼠、大鼠、倉鼠、兔子等都適合使用。本發明的抗體還包括從這樣的動物得到具有抗體生產活性的細胞，并在體外免疫之后，與骨髓瘤細胞融合得到的雜交瘤生產的抗體。本發明的雜交瘤生產的單克隆抗體的具體例子可以包括雜交瘤KM3998生產的抗體KM3998、雜交瘤KM4000生產的抗體KM4000、雜交瘤KM4001生產的抗體KM4001、雜交瘤KM4008生產的抗體KM4008、雜交瘤KM4012生產的抗體KM4012、雜交瘤KM4018生產的抗體KM4018等。雜交瘤KM4008和KM4012已經根據布達佩斯公約，在2008年5月I日保藏獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物保藏中心，保藏號分別為FERM BP-10962和FERMBP-10963。此外，本發明的單克隆抗體還包括與以上所述雜交瘤生產的抗體所結合的表位相結合的單克隆抗體。本發明的重組抗體包括通過基因重組生產的抗體，例如人嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體和其抗體片段。在重組抗體當中，具有單克隆抗體的共有特性、即免疫原性低和血液半衰期延長的重組抗體優選作為治療藥。所述重組抗體的例子包括利用重組技術修飾上述單克隆抗體得到的重組抗體。本發明的重組抗體的例子包括:其中抗體的重鏈可變區(以下稱為VH)的互補性決定區(以下稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3)分別包含SEQ ID NOs:26,27和28表示的氨基酸序列，和/或抗體的輕鏈可變區(以下稱為VL)的⑶R1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQ IDNOs: 29、30和31表示的氨基酸序列的抗體；其中抗體的VH的⑶R1XDR2和⑶R3分別包含SEQ ID NOs: 32、33和34表示的氨基酸序列，和/或抗體的VL的CDRl、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID NOs:35,36和37表示的氨基酸序列的重組抗體；其中抗體的VH的CDR1、CDR2和CDR3分別包含SEQ ID N0s:49、50和51表示的氨基酸序列，和/或抗體的VL的CDR1、⑶R2和⑶R3分別包含SEQ ID N0s:52、53和54表示的氨基酸序列的重組抗體；等等。人嵌合抗體是包含非人動物的抗體的VH和VL、以及人類抗體的重鏈恒定區(以下稱為CH)和輕鏈恒定區(以下稱為CL)的抗體。具體地說，本發明的人嵌合抗體可以如下生產:從生產特異性識別ASCT2的細胞外區域的天然三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH和VL的cDNA，將它們各插入包含編碼人類抗體的CH和CL的DNA的動物細胞用表達載體從而構建用于表達人嵌合抗體的載體，然后將所述載體導入動物細胞以表達所述抗體。對于人嵌合抗體 的CH來說，可以使用任何CH，只要它屬于人免疫球蛋白(以下稱為“hlg”)即可，并優選屬于hlgG類別的CH，并可以使用屬于hlgG類別的任一亞類，例如hI gG1、hI gG2、hI gG3、和hI gG4。對于人嵌合抗體的CL來說，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類別即可，可以使用屬于K類或λ類的CL。本發明的人嵌合抗體的例子包括:其中抗體的VH包含SEQ ID NO: 19表示的氨基酸序列而抗體的VL包含SEQ ID NO: 21表示的氨基酸序列的人嵌合抗體；其中抗體的VH包含SEQ ID NO: 23表示的氨基酸序列而抗體的VL包含SEQ ID NO: 25表示的氨基酸序列的人嵌合抗體；其中抗體的VH包含SEQ ID Ν0:46表示的氨基酸序列而抗體的VL包含SEQ IDNO:48表示的氨基酸序列的人嵌合抗體等。具體的例子包括人嵌合抗體cKM4008、cKM4012、CKM4018 等。人源化抗體是其中源自非人動物抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人類抗體的VH和VL的適當位置中的抗體，也被稱為人⑶R移植抗體、重構抗體(reshaped-antibody)等。本發明的人源化抗體可以如下產生:構建編碼抗體可變區(以下稱為“V區”)的cDNA，其中源自于非人動物的、由生產特異性識別ASCT2的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體的雜交瘤產生的抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列，被移植到合適的人類抗體的VH和VL的構架中(在后文中稱為“FR”)；將cDNA分別插入到用于動物細胞表達的、含有人類抗體的CH和CL的編碼基因的載體中，從而構建人源化抗體表達載體；以及將所述載體導入到動物細胞中以表達和生產人源化抗體。
對于人源化抗的VH和VL的FR的氨基酸序列來說，可以使用任何氨基酸序列，只要它們分別是源自于人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列即可。例子包括在數據庫例如蛋白數據庫(Protein Data Bank)中登記的人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列、在例如美國衛生與人類服務部(Dept.Health and Human Services)的《免疫學重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest) (1991)中描述的人類抗體的VH和VL的每個亞組FR的共有氨基酸序列，等等。對于人源化抗體的CH來說，可以使用任何CH，只要它屬于hlg類別即可，優選的是hlgG類別的，并可以使用屬于hlgG類別的任何一個亞類，例如hlgGl、hIgG2、hIgG3和hIgG4。對于人源化抗體的CL來說，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類別即可，并可以使用屬于K類別或λ類別的CL。本發明的人源化抗體的具體例子包括下面的人源化抗體:其中抗體的VH包含SEQID NO:71表示的氨基酸序列，或其中在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中選自第2位Val、第9位Ser、第20位Val、第30位Ser、第38位Arg、第46位Glu、第86位Leu、第93位Val、第95位Tyr和第116位 Val的至少一個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列，和/或其中抗體的VL包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列，或其中選自SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列中第8位Pro、第15位Val、第38位Gin、第43位Ala、第44位Pro、71位Phe和第87位Tyr的至少一個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列；等等。在這方面，導入的修飾數量沒有限制。抗體的VH的氨基酸序列的例子優選包括:包含的氨基酸序列中SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列的第9位Ser、第20位Val、第38位Arg、第46位Glu、第93位Val、第95位Tyr和第116位Val被其它氨基酸殘基取代的人源化抗體；包含的氨基酸序列中SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列的第20位Val、第46位Glu、第95位Tyr和第116位Val被其它氨基酸殘基取代的人源化抗體；或包含的氨基酸序列中SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列的第46位Glu和第95位Tyr被其它氨基酸殘基取代的人源化抗體。通過上述氨基酸修飾得到的抗體的VH的氨基酸序列可包括，例如，其中在SEQ IDNO:71表示的氨基酸序列中引入選自Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸修飾中的至少一個修飾的氨基酸序列。導入十個修飾的氨基酸序列的具體例子包括其中在SEQ ID N0:71表示的氨基酸序列中導入Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導入九個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位A rg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，和Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導入八個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，
Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val.1le取代第20位Val.Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val.1le取代第20位Val.Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val.1le取代第20位Val.Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，
Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr,iP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr,iP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg>Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr,iP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86 位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，
Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg>Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr,iP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取 代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser>Lys取代第38位Arg、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位Tyr>^P Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser>Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，
Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser> Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser>Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，和Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser>Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導入七個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，

Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Va l、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導入六個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，
Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導入五個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第2位Val、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第30位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨 基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Val取代第86位Leu、Phe取代第95位TyrJP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導入四個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列等。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導入三個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Ile取代第20位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取 代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，
Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Thr取代第93位Val和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Thr取代第93位Val、Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。其中在SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列中導入兩個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第2位Val、和Pro取代第9位Ser的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Ile取代第20位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，

Ile取代第2位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，
Ile取代第2位Val、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第2位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Ile取代第20位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Thr取代第30位Ser的氨基酸序列， Ile取代第20位Val、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Ile取代第20位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第38位Arg、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、和Val取代第86位Leu的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Val取代第86位Leu、和Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Val取代第86位Leu、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Val取代第86位Leu、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，Thr取代第93位Val、和Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第93位Val、和Leu取代第116位Val的氨基酸序列，和
Phe取代第95位TyrjP Leu取代第116位Val的氨基酸序列。在SEQ ID NO:71表示的氨基酸序列中導入一個修飾的VH的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Ile取代第2位Val的氨基酸序列，Pro取代第9位Ser的氨基酸序列，Ile取代第20位Val的氨基酸序列，Thr取代第30位Ser的氨基酸序列，

Lys取代第38位Arg的氨基酸序列，Lys取代第46位Glu的氨基酸序列，Val取代第86位Leu的氨基酸序列， Thr取代第93位Val的氨基酸序列，Phe取代第95位Tyr的氨基酸序列，和Leu取代第116位Val的氨基酸序列。關于抗體的VL，優選的例子包括:包含SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中第15位Val、第43位Ala、第44位Pro、第71位Phe、和第87位Tyr被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列的人源化抗體包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中第15位Val、第71位Phe和第87位Tyr被其它氨基酸殘基取代的氨基酸序列的人源化抗體，等等。通過上述氨基酸修飾得到的抗體的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中導入選自Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin,Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸修飾中的至少一個修飾的氨基酸序列。導入七個修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括:在SEQ ID NO:72表示的氨基酸序列中導入Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導入六個修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，和Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導入五個修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Arg取代第38位GlruThr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位GlruVal取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

Thr取代第8位Pro、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Tyr取代第71位PheJP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Val取代第44位Pro和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，
Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，和Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Thr取代第43位Ala、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導入四個修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，等等。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導入三個修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Leu取代第15位Val、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Arg取代第38位Gin、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，
Leu取代第15位Val、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Val取代第44位Pro、Tyr取代第71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序
歹IN等等。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導入兩個修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Thr取代第8位Pro、和Leu取代第15位Val的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第8位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Leu取代第15位Val、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、和Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Arg取代第38位Gin、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala、和Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Val取代第44位Pro、和Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，

Val取代第44位Pro、和Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列，Tyr取代71位PhejP Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。在SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列中導入一個修飾的VL的氨基酸序列的具體例子包括下列氨基酸序列:Thr取代第8位Pro的氨基酸序列，Leu取代第15位Val的氨基酸序列，Arg取代第38位Gln的氨基酸序列，Thr取代第43位Ala的氨基酸序列，Val取代第44位Pro的氨基酸序列，Tyr取代第71位Phe的氨基酸序列，Phe取代第87位Tyr的氨基酸序列。
另外，本發明的人源化抗體的具體例子還包括:抗體的VH包含SEQ ID N0:71表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO:76表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO: 78表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID N0:80表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO:82表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:72表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID N0:76表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO:84表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO: 78表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID NO: 84表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID NO:80表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體；抗體的VH包含SEQ ID N0:82表示的氨基酸序列和/或抗體的VL包含SEQ ID N0:84表示的氨基酸序列的人源化抗體等等。人類抗體本來是人體中天然存在的抗體，它還包括從人類抗體噬菌體文庫或產生人類抗體的轉基因動物得到的抗體，所述噬菌體文庫或轉基因動物是基于遺傳工程、細胞工程和發育工程 的新進展技術制備的。舉例而言，人體中存在的抗體可以如下制備:分離人外周血淋巴細胞，用EB病毒等感染使其永生化，然后將其克隆從而得到能夠生產所述抗體的淋巴細胞，培養這樣得到的淋巴細胞，和從培養物的上清液提純所述抗體。人類抗體噬菌體文庫是通過將從人類B細胞制備的編碼抗體的基因插入到噬菌體基因中，而在噬菌體表面上表達抗體片段例如Fab和scFv的文庫。表達具有所需抗原結合活性的抗體片段的噬菌體，可以利用它與固定有抗原的基質的結合活性作為指標，從文庫中回收。抗體片段可以通過遺傳工程技術進一步轉變為含有兩條完整的H鏈和兩條完整的L鏈的人類抗體分子。產生人類抗體的轉基因動物是細胞中整合了人類抗體基因的動物。具體來說，產生人類抗體的轉基因動物可以如下制備:將編碼人類抗體的基因導入到小鼠ES細胞中，將ES細胞移植到另一只小鼠的早期胚胎中，然后使其發育。人類抗體可以從產生人類抗體的轉基因非人類動物如下制備:通過通常在非人類哺乳動物中進行的雜交瘤制備方法獲得產生人類抗體的雜交瘤，將獲得的雜交瘤進行培養，并在培養上清液中形成和積累人類抗體。在構成上述的抗體或抗體片段的氨基酸序列中，其中一個或多個氨基酸被缺失、取代、插入或添加、但仍與上述抗體或其抗體片段具有相似活性的抗體或其抗體片段，也包括在本發明的抗體或抗體片段中。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸數量是一個或多個，沒有具體的限制，但是它在通過已知方法例如位點定向誘變位點有可能進行缺失、取代或添加的范圍內，所述方法定向誘變描述在[Molecular Cloning, Second Edition (分子克隆，第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology(現代分子生物學技術)，John Wiley & Sons (1987-1997) ; Nucleic Acids Research,10, 6487 (1982), Proc.Natl.Acad Sci USA, 79, 6409(1982) ;Gene, M, 315 (1985)，NucleicAcids Research, 13, 4431(1985) ; Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 488(1985)]等中。例如，數量為I到幾十個，優選為I到20個，更優選為I到10個，最優選為I到5個。
上述抗體的氨基酸序列中“一個或多個氨基酸殘基被缺失、取代、插入或添加”的表述意義如下。即，它意味著在同一序列和一個或多個氨基酸序列中的任選位置上，存在著一個或多個氨基酸的缺失、取代、插入或添加。此外，缺失、取代、插入或添加可以同時發生，被取代、插入或添加的氨基酸可以是天然類型或非天然類型的。天然類型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-半胱氨酸等。可互相取代的氨基酸的優選例子顯示在下面。同樣組中的氨基酸可以互相取代。A組:亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲基絲氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，環己基丙氨酸B組:天冬氨酸，谷氨酸，異天冬氨酸，異谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸C組:天冬酰胺，谷氨酰胺D組:賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸，2，4- 二氨基丁酸，2，3_ 二氨基丙酸E組:脯氨酸，3-羥基脯氨酸，4-羥基脯氨酸F組:絲氨酸，蘇氨酸，高絲氨酸G組:苯丙氨酸，酪氨酸本發明的抗體片段包括Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、雙抗體、dsFv、包含CDR的肽等。Fab是具有大約50，000的分子量并具有抗原結合活性的抗體片段，其中在蛋白酶一木瓜蛋白酶(在H鏈的224位切開氨基酸殘基)處理IgG抗體分子獲得的片段中，H鏈的大約一半N-端側和整個L鏈通過二硫鍵結合在一起。本發明的Fab可以通過用木瓜蛋白酶處理特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體而產生。此外，Fab也可以通過將編碼抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，并將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產。F(ab’)2是具有大約100，000分子量并具有抗原結合活性的抗體片段，并包含通過用酶一胃蛋白酶消化IgG的絞鏈區中兩個二硫鍵的下半部而得到的、在所述鉸鏈位置中結合的兩個Fab區。本發明的F(ab’) 2可以通過用胃蛋白酶處理特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體而產生。F(ab’ )2還可以通過硫醚鍵或二硫鍵結合下述的Fab’而制備。Fab’是具有大約50，000分子量和抗原結合活性的抗體片段，是通過切開上述卩(&13’)2的鉸鏈區中的二硫鍵得到的。本發明的Fab’可以通過用還原劑例如二硫蘇糖醇處理特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的F (ab’)2來生產。此外，Fab’也可以通過將編碼抗體的Fab’片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中、并將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab’來生產。scFv是其中一條VH鏈和一條VL鏈使用適當的肽接頭(在后文中稱為“P”)連接在一起的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并且是具有抗原結合活性的抗體片段。本發明的scFv可以如下生產:獲得特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA，將所述DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然后將表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。雙抗體是其中scFvs被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。兩個抗原在二價抗原結合活性方面可以相同或不同的。本發明的雙抗體可以如下生產:獲得特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA使得蛋白接頭的氨基酸序列長度是8個殘基以下，將所述DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然后將表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。dsFv是通過將VH和VL的各一個氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代的多肽經半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接在一起而獲得的。用半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基，可以按照已知的方法(Protein Engineering, 7, 697-704(1994)),根據抗體的三維結構預測進行選擇。本發明的dsFv可以如下生產:獲得特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將所述DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然后將表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。包含⑶R的肽通過包含VH或VL的一個或多個⑶R而構成。包含多個⑶R的肽可以直接或通過適當的肽接頭結合。本發明的含有CDR的肽，可以如下生產:構建特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA，將所述DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然后將表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達肽。含有CDR的肽也可以通過化學合成方法例如Fmoc法或tBoc法來生產。本發明的單克隆抗體包括抗體結合物，其中特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體或其抗體片段與放射性同位素、低分子藥齊U、高分子量藥劑、蛋白質、治療抗體等用化學或遺傳學手段進行結合。

本發明的抗體結合物可以如下產生:用化學手段將放射性同位素、低分子藥劑、高分子量藥劑、蛋白質、治療抗體等與本發明的特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體或其抗體片段的H鏈或L鏈的N末端側或C末端側、所述抗體或抗體片段的適當的取代基或側鏈、所述抗體或抗體片段中的糖鏈等結合[抗體工學入門，地人書館(1994)]。所述抗體結合物還可以通過遺傳學手段產生:將本發明中特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體或其抗體片段的編碼DNA與待結合的另一種編碼蛋白質或治療抗體的DNA連接，將所述DNA插入表達載體，并將所述表達載體導入適當的宿主細胞。放射性同位素包括1311、1251、9°Y、64CU、199Tc、77LU、211At等。放射性同位素可以通過氯胺-T方法等與所述抗體結合。螯合放射性同位素的物質還可以與抗體結合。螯合劑包括
1-異硫氰酸基并苯甲基-3-甲基二亞乙基-三胺五乙酸(MX-DTPA)等等。低分子藥劑包括:抗腫瘤劑例如烷基化劑，亞硝基脲劑，代謝拮抗劑，抗生素物質，來源于植物的生物堿，拓撲異構酶抑制劑，激素療法藥劑，激素拮抗劑，芳香化酶抑制劑，P糖蛋白抑制劑，鉬復合物衍生物，M期抑制劑和激酶抑制劑[臨床腫瘤學，癌癥化學療法社(1996)]，類固醇劑例如氫化可的松和潑尼松龍，非類固醇藥劑例如阿司匹林和吲哚美辛，免疫調節劑例如金硫代蘋果酸鹽，青霉胺，免疫抑制劑例如環磷酰胺和硫唑嘌呤，抗炎劑例如抗組胺劑，例如馬來酸氯苯那敏和氯馬斯汀[炎癥和抗炎癥療法，醫齒藥出版株式會社(1982)]等。抗腫瘤劑的例子包括阿米福汀(Ethyol)、順鉬、達卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、氮芥(氮芥子氣)、鏈脲佐菌素、環磷酰胺、異環磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(亞德里亞霉素)、表柔比星、吉西他濱(Gemsal)、柔紅霉素、丙卡巴肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春花堿、長春新堿、博來霉素、道諾霉素、培洛霉素、雌氮芥、紫杉醇(泰素)、多烯紫衫醇(泰素帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉬、奧沙利鉬、奈達鉬、克拉曲濱、喜樹堿、10-羥基-7-乙基喜樹堿(SN38)、氟尿苷、氟達拉濱、羥基脲、異環磷酰胺、伊達比星、美司那、伊立替康(CPT-11)、鹽酸拓撲替康、米托蒽醌、拓撲替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、輕基脲(hydroxycarbamide)、普卡霉素、米托坦、培門冬酶、戊制菌素、哌泊溴烷、鏈脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睪內酯、硫鳥嘌呤、硫替哌、尿嘧啶氮芥、長春瑞賓、苯丁酸氦芥、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奧沙利鉬、吉非替尼(易瑞沙)、伊馬替尼(STI 571)、埃羅替尼、FMS-樣酪氨酸激酶3 (Flt3)抑制劑、血管內皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑例如易瑞沙和特羅凱、根赤殼菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素、雷帕霉素、安丫啶、全反式視黃酸、沙利度胺、來那度胺、阿那曲唑、法曲唑、來曲唑、依西美坦、硫代蘋果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環孢霉素、雷帕霉素、氫化可的松、蓓薩羅丁 (塔革雷汀)、他莫昔芬、地塞米松、孕激素物質、雌激素物質、阿那曲唑(瑞寧得)、來普隆、阿司匹林、Π引哚美辛、塞來考昔、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代蘋果酸金、馬來酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維A酸、蓓薩羅丁、砷、voltezomib、別嘌呤醇、加里剎霉素、替伊莫單抗、塔革雷汀、奧唑米星、克拉霉素、甲酰四氫葉酸、異環磷酰胺、酮康唑、氨魯米特、蘇拉明、氨甲蝶呤、美登醇及其衍生物等。將低分子藥劑與抗體結合的方法包括:所述藥劑與抗體的氨基通過戊二醛結合的方法，所述藥劑的氨基與抗體的羧基通過水溶性碳二亞胺連接的方法，等等。

高分子藥劑包括聚乙二醇(以下稱為“PEG”)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯-馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羥丙基甲基丙烯酰胺等等。通過將這些高分子化合物與抗體或抗體片段結合，預期有下列作用:(1)提高對各種化學、物理或生物因子的穩定性；(2)顯著延長血液半衰期；(3)免疫原性消失，抑制抗體產生；等等[生物結合物藥物，廣川書店(1993)]。例如，將PEG與抗體結合的方法包括使抗體與PEG修飾試劑反應[生物結合物藥物，廣川書店(1993)]。PEG修飾試劑包括賴氨酸的ε-氨基的修飾劑(特開昭61-178926)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修飾劑(特開昭56-23587)、精氨酸的胍基的修飾劑(特開平2-117920)等。免疫刺激劑可以是任何被稱為免疫佐劑的天然產物。增強免疫原的藥劑的例子包括β (I — 3)葡聚糖(香菇多糖，裂裥菌素)、α-半乳糖苷神經酰胺(KRN7000)等。蛋白質包括激活免疫活性細胞例如NK細胞、巨噬細胞或中性粒細胞的細胞因子或生長因子；毒性蛋白等等。細胞因子或生長因子的例子包括干擾素(在后文中稱為“INF”)-α、INF-β、INF- y、白介素(后文稱為“IL”)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)等。毒性蛋白包括篦麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，還包括在蛋白中導入突變以便控制毒性的毒性蛋白。治療性抗體包括針對通過結合抗體誘導凋亡的抗原的抗體、針對參與腫瘤的病態形成的抗原的抗體、調節免疫功能的抗體、以及與病變部位中血管生成有關的抗體。與抗體的結合誘導凋亡的抗原包括分化簇(在后文中稱為“⑶”)19、⑶20、⑶21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80 (B7.l)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86 (B7.2)、II 類人類白細胞抗原(HLA)、表皮生長因子受體(EGFR)，等等。參與腫瘤病態形成的抗原或調節免疫功能的抗體的抗原包括⑶4、⑶40、⑶40配體、B7 家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7 家族分子的配體(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA )、0X-40、0X-40 配體、CD 137、腫瘤壞死因子(TNF )受體家族分子(DR4、DR5、TNFRU TNFR2)、誘導TNF相關的凋亡的配體受體(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子 κ B 配體(RANK)的受體激活劑、RANK配體、CD25、葉酸受體4、細胞因子[IL-1 α、IL-1 β、IL_4、IL_5、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長因子(TGF) β ,TNFa，等等]、這些細胞因子的受體、趨化因子(SLC、ELC、1-309、TARC、MDC、CTACK等)以及這些趨化因子的受體。在病變部位抑制血管生成的抗體的抗原包括血管內皮生長因子(VEGF)、促血管生成素、成纖維細胞生長因子(FGF)、EGF、血小板衍生的生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF),促紅細胞生成素(EPO )、TGF β、IL-8、Ephi I in、SDF-1、它們的受體，等等。帶有蛋白質或治療抗體的融合抗體可以如下生產:將編碼單克隆抗體或抗體片段的cDNA與編碼蛋白質的cDNA連接，構建編碼融合抗體的DNA，將所述DNA插入原核生物或真核生物的表達載體，然后將所述表達載體導入原核生物或真核生物以表達融合抗體。在上述抗體結合物在本發明中用于檢測方法、定量測定方法、檢測試劑、定量測定試劑或診斷試劑的情況下，特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體或其抗體片段所結合的藥劑的例子包括用于常規免疫檢測或測量方法的標記物。所述標記物包括酶例如堿性磷酸酶、過氧化物酶和熒光素酶，發光物質例如吖啶酯和洛芬堿，熒光物質例如異硫氰酸熒光素(FITC)和四甲基若丹明異硫氰酸酯(RITC)，
坐坐寸寸ο此外，本發明包括抑制由ASCT2細胞內攝取氨基酸的單克隆抗體，和其抗體片段。本發明的抗體或其抗體片段對由ASCT2介導細胞內攝取氨基酸的抑制活性的評價方法的例子包括:使抗體或其抗體片段與表達ASCT2的正常或癌細胞反應，然后利用活細胞計數試劑等評價谷氨酰胺依賴性增殖的抑制[J Surgical Research, 90, 149 (2000)]；使抗體或其抗體片段與表達ASCT2的正常或癌細胞反應，然后利用適當的設備例如閃爍計數器評價氨基酸例如放射性物質標記的丙氨酸的攝取的抑制[J.BiolChem.，271, 14883 (1996)]，等等。另外，本發明包括具有細胞毒性例如補體依賴性細胞毒性(CDC)活性或抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC活性)的單克隆抗體和其抗體片段。本發明的抗體或其抗體片段 對抗原陽性細胞系的CDC活性或ADCC活性可以通過已知的測定法進行評價[Cancer Tmmunol Immunother, 36, 373 (1993) I。此外，本發明包括具有凋亡誘導活性的單克隆抗體，和其抗體片段。此外，本發明包括不與小鼠ASCT2結合、但是與人ASCT2結合的單克隆抗體，和其抗體片段。此外，本發明包括與人ASCT2的細胞外區域中至少EL2區域結合的單克隆抗體和其抗體片段，例如，與選自SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列中154、159至160、163至171、173至174、177、188、204至205,207,210至212、和214至223處的氨基酸中的至少任何一個氨基酸結合的單克隆抗體和其抗體片段。本發明的抗體或其抗體片段的結合特異性可以通過已知的表位分析法評價，例如根據氨基酸序列信息，測量與其中適當的位點被小鼠ASCT2的序列置換的人/小鼠嵌合ASCT2的結合活性。本發明還涉及與ASCT2有關的疾病的治療藥，其包含特異性識別ASCT2的細胞外區域的三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體或其抗體片段作為活性成分。與ASCT2有關的疾病沒有限制，只要它是與表達ASCT2的細胞有關的疾病即可，例
如癌癥。癌癥包括血液癌、乳腺癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前列腺癌和胰腺癌。優選的癌癥例子包括血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌和前列腺癌。血 液癌的例子包括骨髓性白血病、淋巴細胞性白血病、多發性骨髓瘤、霍奇金氏(Hodgkin’ s)淋巴瘤和非霍奇氏金淋巴瘤。本發明的治療藥包括包含本發明的上述單克隆抗體或抗體片段作為活性成分的治療藥。包含本發明的抗體或其抗體片段、或其結合物的治療藥可以只包含所述抗體或其抗體片段、或其結合物作為活性成分。通常優選治療藥制備成通過在制藥技術領域中眾所周知的適當方法并通過將其與一種或多種藥用可接受的載體混合而生產的藥物制劑。優選通過治療最有效的途徑施用所述治療藥。實例包括經口給藥和腸胃外給藥，例如經頰、氣管、直腸、皮下、肌內或靜脈內給藥，優選靜脈內給藥。治療藥可以是噴霧劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、帶劑(tape)等的形式。雖然給藥劑量或頻率根據目標治療效果、給藥方法、治療時間、年齡、體重等而異，但通常是成人每天10 μ g/kg至8mg/kg。此外，本發明涉及免疫學檢測或測量ASCT2的方法、免疫學檢測或測量ASCT2的試齊U、免疫學檢測或測量表達ASCT2的細胞的方法和診斷與ASCT2有關的疾病的診斷試劑，它們包含特異性識別ASCT2的細胞外區域的天然三維結構并與所述細胞外區域結合的單克隆抗體或其抗體片段作為活性成分。在本發明中，檢測或測量ASCT2量的方法可以是任何已知的方法。例如，包括免疫檢測或測量方法。免疫學檢測或測量方法是利用標記抗原或抗體來檢測或確定抗體量或抗原量的方法。免疫學檢測或測量方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體法(RIA)、酶免疫分析(EIA或ELISA)、熒光免疫分析(FIA)、發光免疫分析、Western印跡法、物理化學方法等。
與ASCT2有關的上述疾病可以通過利用本發明的單克隆抗體或抗體片段來檢測或測量表達ASCT2的細胞進行診斷。至于檢測表達ASCT2的細胞，可以使用已知的免疫學檢測方法，并優選使用免測沉淀法、熒光細胞染色法、免疫組織染色法等。利用FMAT 8100 HTS系統(AppliedBiosystem)的突光抗體染色法等也可以使用。在本發明中，用于檢測或測量ASCT2的生物體樣品沒有特別的限制，只要它可能含有表達ASCT2的細胞即可，所述樣品例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液或培養液。含有單克隆抗體或其抗體片段、或其結合物的診斷試劑還可以根據目的診斷法包含用于執行抗原-抗體反應的試劑或用于檢測所述反應的試劑。執行抗原-抗體反應的試劑包括緩沖液、鹽等等。檢測試劑包括通常用于免疫學檢測或測量方法的試劑，例如識別所述單克隆抗體、其抗體片段 、或結合物的標記第二抗體和與所述標記對應的底物。本發明可提供單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識別系統ASC氨基酸轉運蛋白2(以下稱為“ASCT2”)的細胞外區域的天然三維結構并與該細胞外區域結合；產生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA ;包含所述DNA的載體；可通過導入所述載體獲得的轉化體；利用所述雜交瘤或轉化體產生抗體或其抗體片段的方法；和利用所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及利用所述抗體或其抗體片段的診斷試劑。。下面具體描述本發明抗體的生產方法、疾病治療方法和疾病診斷方法。1.單克隆抗體的制備方法(I)抗原的制備ASCT2或表達ASCT2作為抗原的細胞可通過將包含編碼全長ASCT2或其部分長度的cDNA的表達載體導入大腸桿菌(Escherichiacoli)、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等中而得至IJ。另外，ASCT2可從表達大量ASCT2的各種各樣的人類腫瘤細胞系、人類組織等中提純。可將該腫瘤細胞系和組織用作抗原。此外，具有ASCT2的部分序列的合成肽可通過化學合成方法例如Fmoc法或tBoc法制備并用作抗原。本發明所用的ASCT2可例如通過在宿主細胞中表達編碼ASCT2的DNA進行生產，利用在 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實驗室手冊，第二版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols inMolecular Biology (現代分子生物學技術)、John Wiley & Sons (1987-1997)等中記載的方法如下進行。首先，通過將包含ASCT2編碼區的全長cDNA插入到適合的表達載體的啟動子下游而制備重組載體。這時，如果需要，具有適當的長度、含有基于全長cDNA的多肽的編碼區域的DNA片段，該DNA片段可以代替上述的全長cDNA使用。接下來，通過將重組載體導入適合表達載體的宿主細胞，可以獲得產生ASCT2的轉化體。表達載體可以是任何表達載體，只要它能夠在供使用的宿主細胞中自主復制或者它能夠整合到含有適當啟動子的染色體中使得編碼所述多肽的DNA能夠被轉錄的位置即可。宿主細胞可以是任何細胞，只要它能夠表達目的基因即可。例子包括屬于大腸桿菌屬的微生物、例如大腸桿菌，酵母，昆蟲細胞，動物細胞等。
當使用原核生物例如大腸桿菌作為宿主細胞時，優選本發明中使用的重組載體在原核生物中可以自主復制，并含有啟動子、核糖體結合序列、編碼ASCT2的DNA以及轉錄終止序列。重組載體不必需具有轉錄終止序列，但是轉錄終止序列優選設置在緊接結構基因之后。重組載體還可以含有調控啟動子的基因。上述重組載體還優選是其中核糖體結合序列Shine-Dalgamo序列與起始密碼子之間的間距調整到適當的距離(例如6至18個核苷酸)的質粒。此外，編碼ASCT2的DNA的核苷酸序列可以用其它堿基取代，以便成為在宿主細胞中表達的適當密碼子，從而改善目的ASCT2的生產率。任何表達載體都可以使用，只要它能夠在所用的宿主細胞中發揮功能即可。表達載體的例子包括pBTrp2、pBTacl、pBTac2 (都由Roche Diagnostics制造)、pKK233_2 (Pharmacia 制造)、pSE280 (Invitrogen 制造)、pGEMEX-1 (Promega 制造)、pQE-8 (QIAGEN 制造)、pKYPIO (特開昭 58-110600)、pKYP200[Agricultural BiologicalChemistry, 48, 669(1984) ]、pLSAl [Agric.Biol.Chem.，53, 277(1989) ]、pGELl [Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 4306 (1985) ] > pBluescript II SK (-) (Stratagene 制造)、pTrs30[從大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]、pTrs32 [從大腸桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)制備]、pGHA2 [從大腸桿菌 IGHA2 (FERM BP-400)制備，特開昭 60-221091]、pGKA2 [從大腸桿菌 IGKA2 (FERM BP-6798)制備，特開昭 60-221091]、pTerm2 (US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUBllO、pTP5、pC194、pEG400 [J.Bacteriol..172.2392 (1990) 1、pGEX (Pharmacia 制造)、pET 系統(Novagen 制造)、PME18SFL3，等等。任何啟動子都可以使用，只要它能夠在所使用的宿主細胞中起作用即可。例子包括源自于大腸桿菌、噬菌體等的啟動子，例如trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子和T7啟動子。此外，人工設計和修飾的啟動子也可以使用，例如其中兩個Ptrp串聯連接的啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子和IetI啟動子。宿主細胞的例子包括大腸桿菌XLl-Blue、大腸桿菌XL2_Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌N0.49、大腸桿菌胃3110、大腸桿菌階49、大腸桿菌0冊0，等等。任何導入重組載體的方法都可以使用，只要它是將DNA導入到宿主細胞中的方法即可，例子包括在 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 69, 2110(1972)、Gene, 17, 107(1982)和Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)中記載的使用I丐離子的方法，等等。當動物細胞被用作宿主細胞時，可以使用任何表達載體，只要它能夠在動物細胞中起作用即可。例子包括pcDNA1、pcDM8 (Funakoshi制造)、pAGE107[特開平 3-22979 ;Cytotechnology，I 133 (1990) ]、pAS3-3 (特開平 2-227075)、pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987) ]、pcDNAI/Amp (Invitrogen 制造)、pcDNA3.1 (Invitrogen制造)、pREP4 (Invitrogen 制造)、pAGE103 [J.Biochemistry, 101, 1307 (1987) ]、pAGE210、PME18SFL3、pKANTEX93 (WO 97/10354)，等等。任何啟動子都可以使用，只要它能夠在動物細胞中起作用即可。例子包括細胞肥大病毒(CMV)的立即早期 (IE)基因的啟動子、SV40早期啟動子、逆轉錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRa啟動子等、莫洛尼鼠白血病病毒啟動子或增強子等。此夕卜，人類CMV的IE基因的增強子可以與啟動子一起使用。宿主細胞包括人類Namalwa細胞、猴COS細胞、中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、HST5637(特開昭63-000299)等。任何導入重組載體的方法都可以使用，只要它是用于將DNA導入到動物細胞中的方法即可，例子包括電穿孔[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]、磷酸I丐法(特開平2-227075)、脂質轉染法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Μ, 7413 (1987)]，等等。將來源于微生物、動物細胞等并具有包含ASCT2編碼DNA的重組載體的轉化體在培養基中培養，以在培養物中形成和累積ASCT2，并從培養物中回收ASCT2，從而能夠生產ASCT2。在培養基中培養轉化體的方法根據用于宿主培養的一般方法執行。當在來源于真核生物的細胞中表達ASCT2時，能夠得到結合了糖或糖鏈的ASCT2。當用含有誘導型啟動子的重組載體轉化的微生物進行培養時，如果需要，可以在培養基中加入誘導劑。例如，當對使用Iac啟動子的重組載體轉化的微生物進行培養時，可以在培養基中加入異丙基_β -D-硫代半乳糖苷等，或者當對使用trp啟動子的重組載體轉化的微生物進行培養時，可以在其中加入吲哚丙烯酸等。當使用動物細胞作為宿主細胞獲得的轉化體進行培養時，培養基包括常用的RPMI1640 培養基[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) 1、Eagle’s MEM 培養基[Science, d 501 (1952) ]、Dulbecco 改良的 MEM 培養基[Virology, 8, 396 (1959)]以及 199 培養基[Proceeding of the Society for the BiologyMedicine, 73, 1 (1950)]、Iscoove改良的Dulbecco培養基(MDM)、添加了胎牛血清等的培養基，等等。培養一般在存在5%C02的情況下，在pH6到至8和30至40°C下進行I到7天。如果必要 ，在培養過程中可以向培養基添加抗生素例如卡那霉素或青霉素。對于ASCT2編碼基因的表達方法來說，除了直接表達之外，還可以按照MolecularCloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實驗室手冊，第二版)，ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)中描述的方法進行分泌生產、融合蛋白表達等生產ASCT2的方法包括在宿主細胞中進行細胞內表達的方法、從宿主細胞進行細胞外分泌的方法、在宿主細胞膜外被膜上生產的方法等。適合的方法可以通過改變所使用的宿主細胞和所產生的ASCT2的結構來選擇。當在宿主細胞中或宿主細胞膜外被膜上生產ASCT2時，按照Paulson等的方法 Γ.Τ.Biol.Chem..264.17619 (1989) 1、Lowe 等的方法[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86, 8227 (1989)，Genes Develop.，4, 1288 (1990)]、特開平 05-336963 和 WO 94/23021中描述的方法等，可以將ASCT2主動分泌到細胞外。此外，按照特開平2-27075中描述的方法，利用使用二氫葉酸還原酶基因的基因擴增系統，能夠增加ASCT2的生產量。所得的ASCT2可以例如如下進行分離和純化。當ASCT2以溶解狀態在細胞內表達時，細胞在培養后通過離心回收，懸浮在水性緩沖液中，然后使用超聲波破碎器、French壓力器、Manton Gaulin勻衆器、戴諾磨等進行破碎，以獲得無細胞的提取液。將無細胞的提取液進行離心以獲得上清液，并通過對上清液進行通用的蛋白分離和純化技術來獲得純化的制備物，這些技術例如溶劑抽提，使用硫酸銨等進行鹽析，脫鹽，用有機溶劑沉淀，使用樹脂例如二乙氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75 (三菱化學社制造)進行陰離子交換層析，使用樹脂例如S-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia制造)進行陽離子交換層析，使用樹脂例如丁基_瓊脂糖凝膠或苯基_瓊脂糖凝膠進行疏水層析，使用分子篩進行凝膠過濾，親和層析，層析聚焦，電泳例如等電點聚焦，等等，它們可以單獨或組合使用。當ASCT2通過形成包含體在細胞內表達時，將細胞以同樣的方式回收、破碎和離心，ASCT2的包含體作為沉淀級分被回收。將回收的蛋白包含體用蛋白變性劑進行增溶。通過對增溶的溶液進行稀釋或透析，使蛋白成為正常的三維結構，然后通過與上述相同的分離純化方法獲得ASCT2的純化制品。當ASCT2或衍生物例如糖基化產物被分泌到細胞外時，可以從培養上清液中回收ASCT2或衍生物例如糖基化產物。即,通過例如離心的方法、以與上述相同的方式來處理培養物，從培養上清液中通過與上述相同的分離純化方法，可以獲得ASCT2的純化制品。此外，在本發明中使用的ASCT2可以通過化學合成法來生產，例如Fmoc法或tBoc法。此夕卜，可以使用由 Advanced ChemTech>Perkin-Elmer>Pharmacia>Protein TechnologyInstrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、島津制作所等制造的肽合成儀對其進行化學合成。(2)動物的免疫和融合用抗體產生細胞的制備使用上面(I)中制備的抗原免疫3到20周齡的小鼠、大鼠或倉鼠，從動物的脾臟、淋巴結或外周血收集抗體產生細胞。此外，當在上述動物中發現由于免疫原性低而導致充分的滴度上升時，可以使用ASCT2敲除小鼠作為供免疫的動物。免疫通過給動 物皮下、靜脈內或腹膜內注射施用抗原連同適合的佐劑(例如完全弗氏佐劑，氫氧化鋁凝膠與百日咳菌苗的組合等)來進行。當抗原是部分肽時，用載體蛋白例如BSA (牛血清白蛋白)、KLH (匙孔血藍蛋白)等產生結合物，將其用作抗原。在第一次施用后，每一周或每兩周一次施用抗原，進行5到10次。在每次施用后的第三到第七天，從眼底靜脈叢采集血液樣品，通過例如酶免疫分析[Antibodies-ALaboratory Manual (抗體-實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等測試血清與抗原的反應性。在其血清中顯示出針對免疫用抗原的充分抗體滴度的動物，被用作融合用抗體產生細胞的供應源。在最后施用抗原后的三到七天，從免疫動物摘出含有抗體產生細胞的組織例如脾臟，以收集抗體產生細胞。當使用脾臟細胞時,將脾臟切下并打散,然后離心。除去紅細胞得到融合用抗體產生細胞。(3)骨髓瘤細胞的制備從小鼠獲得的已建立的細胞系被用作骨髓瘤細胞。例子包括8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠(源自于BALB/c小鼠)的骨髓瘤細胞系P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [CurrentTopics in Microbiology and Immunology, 18,1(1978)1、 P3~NSl/l~Ag41(NS~1)[European J.1mmunology, 6, 511(1976)], SP2/0_Agl4 (SP-2)「Nature, 276.269(1978)1、P3-X63-Ag8653 (653) [J.1mmunology, 123.1548 (1979)]、P3_X63_Ag8 (X63)[Nature, 256, 495 (1975)]，等等。所述骨髓瘤細胞在正常培養基中傳代培養[在RPM1-1640培養基中添加谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素、FCS和8-氮雜鳥嘌呤的培養基]，并且在細胞融合之前將它們在正常培養基中傳代培養3或4天，以確保在進行融合的當天細胞數量為2X IO7個以上。(4)細胞融合和制備生產單克隆抗體的雜交瘤將通過上述(2)得到的融合用抗體產生細胞和通過上述(3)得到的骨髓瘤細胞用最低必需培養基(MEM)或PBS (1.83g磷酸氫二鈉，0.21g磷酸二氫鉀，7.65g氯化鈉，I升蒸餾水，pH7.2)進行充分清洗和混合，使抗體產生細胞:骨髓瘤細胞的比率=5-10:1，然后離心。然后丟棄上清液。將沉淀的細胞群充分打散。在打散沉淀的細胞后，在37°C、攪拌下向細胞中加入聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、MEM和二甲亞砜的混合物。另外，每隔I或2分鐘加入I到2mL MEM培養基數次，并加入MEM使得總量為50mL。離心后，將上清液丟棄。輕輕地將細胞打散后，將細胞輕柔地懸浮在HAT培養基中[在正常培養基中添加了次黃嘌呤、胸腺嘧啶和氨基蝶呤的培養基]。將懸浮液在5%C02的培養箱中在37°C培養7到14天。

培養后，取部分培養上清液作為樣品，通過下面描述的結合分析法選擇對含ASCT2抗原有反應性而對不含ASCT2抗原沒有反應性的骨髓瘤。然后，通過有限稀釋方法進行兩次克隆[第一次使用HT培養基(除去了氨基蝶呤的HAT培養基)，第二次使用正常培養基],選擇顯示出穩定的高抗體滴度的雜交瘤作為生產單克隆抗體的雜交瘤。(5)純化的單克隆抗體的制備將在上面(4)中獲得的產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，通過腹膜內注射施用于8到10周齡的降植烷處理過的小鼠或裸鼠中(2，6，10，14-四甲基十五烷(降植烷)腹膜內給藥，然后飼養2周)。雜交瘤在10到21天內發展出腹水腫瘤。從小鼠收集腹水液，離心除去固形成分，用40至50%硫酸銨進行鹽析，然后用辛酸沉淀，通過DEAE-瓊脂糖凝膠柱、蛋白A柱或凝膠過濾柱,收集IgG或IgM級分作為純化的單克隆抗體。此外，將通過上述(4)得到的生產單克隆抗體的雜交瘤在含有10%FBS等的RFMI1640培養基中培養，并離心除去上清液。將沉淀的細胞懸浮在含有5%DIG0 GF21的雜交瘤SFM培養基中，培養3至7天。將得到的細胞懸液離心，繼而將所得上清液用蛋白A柱或蛋白G柱純化，收集IgG級分。抗體的亞類可以使用亞類分型試劑盒通過酶免疫分析法來確定。蛋白的量可以通過Lowry法或從280nm處的吸光度來測定。(6)單克隆抗體的選擇通過下面的結合分析法，利用酶免疫分析法和氨基酸細胞內攝取的抑制分析，進行單克隆抗體的選擇。(6-a)結合分析法將通過將(I)中得到的含有ASCT2編碼cDNA的表達載體導入大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等得到的基因導入細胞或重組蛋白質，或從人類組織得到的純化多肽或部分肽，用作抗原。當抗原是部分肽時，用載體蛋白例如BSA或KLH制備結合物并使用。在將這些抗原通過分配到96孔板中使之固相化之后，在其中分配雜交瘤的培養上清液或純化的單克隆抗體作為第一抗體，并進行反應。在用PBS、PBS-TWeen徹底清洗后，向其中分配用生物素、酶、化學發光物質、放射性化合物等標記的抗免疫球蛋白抗體作為第二抗體，并進行反應。在用PBS-Tween徹底清洗后，根據第二抗體中的標記物進行反應，以選擇與所述抗原特異性反應的單克隆抗體。(6-b)氨基酸細胞內攝取的抑制分析
可以使用其中包含ASCT2編碼cDNA的表達載體被導入上面(I)得到的細胞例如動物細胞中的基因導入細胞、或表達ASCT2的正常或癌細胞，作為分析細胞。本發明的單克隆抗體或其抗體片段抑制由ASCT2介導的細胞內攝取氨基酸的活性利用下面的方法來評價，包括:將單克隆抗體或其抗體片段與表達ASCT2的正常或癌細胞反應，然后利用活細胞計數試劑等評價谷氨酰胺依賴性增殖的抑制的方法[J，SurgicalResearch，迎，149(2000)];將單克隆抗體或其抗體片段與表達ASCT2的正常或癌細胞進行反應，然后利用適當的設備例如閃爍計數器評價氨基酸例如放射性物質標記的丙氨酸的攝取抑制的方法[J.Biol Chem..271.14883(1996)1 等。2.重組抗體的制備在下面顯示的生產人嵌合抗體和人源化抗體的方法，作為重組抗體的生產實例。(I)表達重組抗體的載體的構建表達重組抗體的載體是用于動物細胞的表達載體，其中插入了編碼人類抗體的CH和CL的DNA，所述載體通過將編碼人類抗體的CH和CL的DNA克隆到動物細胞的表達載體中來構建。人類抗體的C區可以是任何人類抗體的CH和CL。例子包括屬于Y I亞類的CH、屬于K類的CL等。對于編碼人類抗體的CH和CL的DNA來說，通常可以使用cDNA并還可以使用含有外顯子和內含子的染色體DNA。對于動物細胞的表達載體來說，可以使用任何表達載體，只要能夠在其中插入并在其中表達編碼人類抗體的C區的基因即可。例子包括 pAGE107 [Cytotechnol.，3, 133 (1990) ]、pAGE103 [J.Biochem.，101, 1307 (1987)]、pHSG274[Gene, 27, 223 (1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 78, 1527 (1981)]、pSGlbd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、pSElUKlSedl-3[Cytotechnol, 13,79(1993)]等等。用于動物細 胞表達載體的啟動子和增強子的例子包括SV40早期啟動子[J.Biochem., 101.1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒 LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149, 960 (1987)]、免疫球蛋白 H 鏈啟動子[Cell, 41, 479 (1985)]和增強子[Cell, 33, 717(1983)]，等等。用于表達重組抗體的載體可以是編碼抗體H鏈的基因和編碼抗體L鏈的基因在分開的載體上的類型，或這兩種基因在同一個載體上的類型(串聯類型)。對于構建用于表達重組抗體的載體的容易度、導入動物細胞的容易度、以及動物細胞中抗體H鏈和L鏈的表達量之間的平衡來說，串聯類型的表達重組抗體的載體是更優選的[J.1mmunol.Methods, U71 (1994)]。串聯類型的表達重組抗體的載體的例子包括pKANTEX93 (TO97/10354)、pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)]，等等。(2)非人類動物來源的抗體V區的編碼cDNA的獲得和氨基酸序列分析編碼非人類動物抗體的VH和VL的cDNA和氨基酸序列分析可以按照下面的方式獲得。從來源于非人類動物的抗體產生雜交瘤細胞提取mRNA用于合成cDNA。將合成的cDNA克隆到載體例如噬菌體或質粒中以制備cDNA文庫。使用編碼小鼠抗體的一部分C區和V區的DNA作為探針，從文庫中分離各個含有編碼VH或VL的cDNA的重組噬菌體或重組質粒。測定了重組噬菌體或重組質粒上目的小鼠抗體的VH和VL的全長核苷酸序列，并從該核苷酸序列分別推導出VH和VL的全長氨基酸序列。
用來制備產生非人類抗體的雜交瘤細胞的非人類動物的實例包括小鼠、大鼠、倉鼠和兔子等。可以使用任何動物，只要能夠從其制備雜交瘤細胞即可。從雜交瘤細胞制備總RNA的方法的實例包括利用試劑盒例如RNA簡易試劑盒(Qiagen 制造)等的硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymology, 154, 3 (1987) I。從總RNA制備mRNA的方法的例子包括:寡聚(dT)固定化的纖維素柱方法[[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實驗室手冊，第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)],利用試劑盒例如寡聚-dT30〈Super>mRNA純化試劑盒(Takara Bio制造)的方法等。用于從雜交瘤細胞制備mRNA的試劑盒的例子還包括Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)和QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)等。用于合成cDNA和制備cDNA文庫的方法的例子包括已知的方法[MolecularCloning, A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Lab.Press (1989) ；Current Protocols in Molecular Biology (現代分子生物學技術)，附錄I, John Wiley & Sons (1987-1997)];使用試劑盒例如用于cDNA合成和質粒克隆的SuperScript質粒系統(GIBCO BRL制造)、ZAP_cDNA試劑盒(Stratagene制造)等的方法；等等。插入了利用從雜交瘤細胞提取的mRNA作為模板合成的cDNA、供制備cDNA文庫用的載體可以是任何載體，只要所述cDNA可以插入即可。例子包括ZAP Express [Strategies,5,58 (1992)]> pBluescript 11 SK (+) [Nucleic AcidsResearch, Γ7, 9494 (1989) ] > λ zap II( Stratagene 制造)、λ gtlO 和 Agtll[DNA Cloning: APractical Appr oach (DNA 克隆:實用方法)，I, 49 (1985) ]、Lambda BlueMid (Clontech制造)、AExCell 和 pT7T3 18U (Pharmacia 制造)、pcD2[MoI Cell.Biol, 3, 280(1983)],pUC18[Gene, 33, 103(1985)]等。可以使用導入由曬菌體或質粒載體構建的cDNA文庫的任何大腸桿菌，只要該cDNA文庫可以被導入、表達和維持即可。例子包括XLl-BlueMRF，[Strategies, 5, 81 (1992) ] , C600 [Genetics,並，177 (1954) ]、Y1088 和Y1090 [Science, 222, 778 (1983)] , NM522[J.Mol Biol, 1M, 1 (1983)]、K802[J.MolBiol, 16, 118(1966)]、JM105 [Gene 38, 275(1985)]等。利用同位素或熒光標記的探針進行菌落雜交或噬斑雜交方法，可以用于從cDNA文庫中挑選編碼非人類動物抗體等的VH和VL的cDNA克隆[Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實驗室手冊，第二版)，Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)]。也可以通過聚合酶鏈反應(在后文中稱為“PCR”)[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (分子克隆:實驗室手冊，第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Current Protocols in MolecularBiology (現代分子生物學技術)，附錄1，John Wiley & Sons (1987-1997)]制備引物并使用從mRNA制備的cDNA或者cDNA文庫作為模板，來制備編碼VH和VL的cDNA。cDNA的核苷酸序列可以如下確定:用適合的限制性酶等消化選出的cDNA，將片段克隆到質粒例如pBluescript SK(-) (Stratagene制造)中，在雙脫氧法[[Proc.Natl Acad.ScL USA, 74, 5463 (1977)]之后，通過常規使用的核苷酸分析法例如使用核苷酸序列自動分析儀例如A.L.F.DNA測序儀(Pharmaci制造)分析序列從而進行反應。
從測定的核苷酸序列推導出VH和VL的全長氨基酸序列，并將它們與已知抗體的VH和 VL 的全長氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫重要的蛋白序列)，美國衛生與人類服務部(US Dept, Health and Human Services) (1991)]進行比較，由此可以證實獲得的cDNA是否編碼含有分泌信號序列的抗體的VH和VL的完整氨基酸序列。將含有分泌信號序列的抗體的VH和VL的全長氨基酸序列與已知抗體的VH和 VL 的全長氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫重要的蛋白序列)，美國衛生與人類服務部(US Dept, Health and Human Services) (1991)]進行比較，推導出分泌信號序列和N-末端氨基酸序列的長度，并且還可以知道它們所屬的亞類。此外，VH和VL的每個⑶R的氨基酸序列可以通過將所得的氨基酸序列與已知抗體的 VH 和 VL 的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫重要的蛋白序列)，美國衛生與人類服務部(US Dept, Health and Human Services) (1991)]進行比較來發現。此外，通過使用得到的VH和VL的全長氨基酸序列，與任何數據庫例如SffISS-PROT, PIR-Protein等中的序列進行同源性搜索，例如按照BLAST方法[J.MolBiol, 215, 403 (1990)]等，可以研究VH和VL的全長氨基酸序列的新穎性。(3)人嵌合抗體表達載體的構建將編碼非人類動物抗體的VH和VL的cDNA，分別克隆到上面(I)中所述的重組抗體表達載體中編碼人類抗體的CH和CL的基因上游，從而構建了人嵌合抗體的表達載體。例如，為了連接含有非人類動物抗體的VH和VL的3’ -末端的核苷酸序列和人類抗體的CH和CL的5’ -末端的核苷酸序列的cDNA，將每個編碼非人類動物的抗體的VH和VL的cDNA制備成編碼由連接部分的核苷酸序列編碼的適當氨基酸并設計成具有限制性酶的適當識別序列。將得到的編碼抗體的VH和VL的cDNA分別克隆，使得它們各自在上面⑴中所述的人源化抗體表達載 體中編碼人類抗體的CH和CL的基因上游以合適的形式表達，從而構建了人嵌合抗體的表達載體。另外，編碼非人類動物的VH或VL的cDNA利用在兩端具有適當的限制性酶識別序列的合成DNA，通過PCR進行擴增，它們各被克隆到上面(I)中得到的重組抗體表達載體中。(4)編碼人源化抗體V區的cDNA的構建編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA可以如下獲得。首先，分別選擇人類抗體的VH或VL中構架區(后文稱為“FR”)的氨基酸序列，所述序列中移植了非人類動物來源的抗體的VH或VL中CDR的氨基酸序列。人類抗體的FR的任何氨基酸序列均可以使用，只要它們源自于人類即可。例子包括在數據庫例如蛋白數據庫(Protein Data Bank)等中登記的人類抗體的FR的氨基酸序列、人類抗體的FR亞類共有的氨基酸序列[Sequences of Proteinsof Immunological Interest (免疫重要的蛋白序列)，美國衛生與人類服務部(1991)],等等。為了抑制抗體結合活性降低，選擇與原始抗體的VH或VL中FR的氨基酸序列具有高度同源性(至少60%以上)的氨基酸序列。然后，將原始抗體的CDR的氨基酸序列分別移植到人類抗體的VH或VL中FR的選定氨基酸序列中，以設計人源化抗體的VH或VL的每個氨基酸序列。通過考慮在抗體基因的核苷酸序列中發現的密碼子使用頻率[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (免疫重要的蛋白序列)，美國衛生與人類服務部(1991)]，將設計的氨基酸序列變換成DNA序列，并設計編碼人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。根據設計的核苷酸序列，合成幾個長度大約100個核苷酸的合成DNA，使用它們進行PCR。在這種情況下，鑒于PCR反應的效率和可以合成的DNA的長度，優選對于H和L鏈各設計6個合成DNA。此外，通過在兩端上存在的合成DNA的5’端導入適當的限制性酶的識別序列，可以將編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA容易地克隆到在(I)中構建的人源化抗體表達載體中。在PCR后,將擴增產物克隆到質粒例如pBluescript SK(-) (Stratagene制造)等中，按照與(2)中描述的方法相類似的方法測定核苷酸序列，獲得了具有所需人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的編碼DNA序列的質粒。(5)人源化抗體的V區的氨基酸序列的修飾
已經知道，當通過僅僅將非人類動物來源的抗體的VH和VL中的⑶R簡單地移植到人類抗體的VH和VL的FR中來生產人源化抗體時，它的抗原結合活性低于來自非人類動物的原始抗體[B10/TECHN0L0GY，9，266(1991)]。在人源化抗體中，在人類抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列當中，鑒定與抗原結合直接相關的氨基酸殘基、與CDR中的氨基酸殘基相互作用的氨基酸殘基、和維持抗體的三維結構并間接地與結合抗原相關的氨基酸殘基，并將其修飾成在非人類動物的原始抗體中發現的氨基酸殘基，從而使已經降低的抗原結合活性增加。為了鑒定FR中與抗原結合活性有關的氨基酸殘基，通過X-射線晶體學[J，MolBiol, 112, 535 (1977)]、計算機模擬[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)]等構建并分析抗體的三維結構。另外，現在必須需要進行各種不同的嘗試，例如，生產每種抗體的幾種修飾的抗體，并檢驗各個修飾的抗體與其抗體結合活性之間的相關性。人類抗體的VH和VL中FR的氨基酸序列的修飾可以使用用于修飾的各種合成DNA，按照(4)中描述的PCR來進行。至于通過PCR獲得的擴增產物，按照(2)中描述的方法測定核苷酸序列，以便確認是否已經發生目的修飾。(6)人源化抗體表達載體的構建通過將構建的重組抗體的VH或VL的每個編碼cDNA克隆到在(I)中描述的重組抗體表達載體中編碼人類抗體的CH或CL的每個基因的上游中，可以構建人源化抗體的表達載體。例如，在(4)和(5)中構建人源化抗體的VH或VL使用的合成DNA當中，當兩端位置的合成DNA的5’-末端中引入適當的限制性酶的識別序列時，克隆能夠進行，以便它們能在上面(I)中描述的人源化抗體表達載體中，在編碼人類抗體的CH或CL的每個基因的上游以適當的形式表達。(7)重組抗體的一過性表達為了有效評估產生的各種人源化抗體的抗原結合活性，可以使用在(3)和(6)中描述的重組抗體表達載體或其修飾的表達載體一過性表達所述重組抗體。任何細胞都可以用作宿主細胞，只要該宿主細胞能夠表達重組抗體即可。一般來說使用 C0S-7 細胞(ATCC CRL1651) [Methods in Nucleic Acids Res., CRCPress, 283 (1991)]。將表達載體導入C0S-7細胞的方法的例子包括DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)]、脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci USA, M，7413 (1987)]，等等。導入表達載體之后，在培養上清液中重組抗體的表達量和抗原結合活性可以通過酶免疫分析[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition(單克隆抗體原理和實踐，第三版)，Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988), Monoclonal AntibodyExperiment Manual (單克隆抗體試驗手冊)，Kodansha Scientific (1987)]等來測定。(8)獲得穩定表達重組抗體的轉化體和制備重組抗體將(3)和￠)中描述的重組抗體表達載體導入到適合的宿主細胞，可以獲得穩定表達重組抗體的轉化體。將表達載體導入宿主細胞的方法的例子包括電穿孔[特開平2-257891，Cytotechnology, 3, 133 (1990)]等。至于導入重組抗體表達載體的宿主細胞，可以使用任何細胞，只要它是能夠產生重組抗體的宿主細胞即可。例子包括小鼠SP2/0-Agl4細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(在后文中稱為〃dhfr〃)缺陷的CHO 細胞[Proc.Natl.Aca.Sc1.U.S.A., 77, 4216 (1980) ]、lection 抗性獲得 Lecl3 [SomaticCell and Molecular genetics.12.55 (1986) 1、a I, 6_ 巖藻糖基轉移酶基因缺陷的 CHO 細胞(TO 2005/35586, WO 02/31140)、大鼠 YB2/3HL.Ρ2.Gil.16Ag.20 細胞(ATCC CRL1662)等。另外，還可以使用下列宿主細胞:其中所導入的諸如與合成細胞內糖核苷酸，GDP-巖藻糖有關的酶的蛋白、諸如與其中在復合型N-葡萄糖苷-連接的糖鏈中1-位巖藻糖與還原端的6-位N-乙酰葡糖胺通過a -鍵結合的糖鏈的修飾有關的酶的蛋白、或與細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖運輸到高爾基體有關的蛋白，它們的活性被降低或缺失的宿主細胞，優選WO 05/35586、WO 02/31140等所述的a 1，6-巖藻糖基轉移酶基因缺陷的CHO細胞。在導入表達載體之后，通過在含有藥劑例如G418硫酸鹽(在后文中稱為G418 )等的用于動物細胞培養的培養基中進行培養，來選擇穩定表達重組抗體的轉化體(特開平
2-57891)。培養動物細胞的培養基的例子包括RPMI1640培養基(Invitrogen制造)、GIT培養基(日本制藥社制造)、EX-CELL301培養基(JRH制造)、MDM培養基(Invitrogen制造)、雜交瘤-SFM培養基(Invitrogen制造)、在這些培養基中加入各種添加劑例如胎牛血清(后文稱為“FCS”)而獲得的培養基等。通過將選出的轉化體在培養基中進行培養，可以在培養上清液中產生并累積重組抗體。培養上清液中重組抗體的表達量和抗原結合活性可以通過ELISA等測量。此外，在轉化體中，可以按照特開平2-57891中公開的方法，通過使用DHFR擴增系統等來增加重組抗體的表達量。通過使用蛋白A柱,可以從轉化體的培養上清液中純化重組抗體[MonoclonalAntibodies-Principles and practice, Third edition (單克隆抗體-原理和實踐，第三版).Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實驗室手冊)，ColdSpring Harbor Laboratory (1988)]。例如,可以通過凝膠過濾、離子交換層析、超濾等的組合來純化重組抗體。純化的重組抗體的H鏈或L鏈或完整抗體分子的分子量通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(在后文中稱為〃SDS-PAGE〃)「Nature, 227.680 (1970) ]、Western印跡法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition (單克隆抗體-原理和實踐，第三版)，Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]等來測定。3.單克隆抗體或抗體片段活性的評價本發明的純化的單克隆抗體或抗體片段的活性可以下面的方式進行評價。與ASCT2-表達細胞的結合活性通過上面I (6a)記載的結合分析來評價。此外，它可以通過突光抗體技術[Cancer Immunol.1mmunother., 36, 373 (1993)]、利用諸如 BIAcore系統的表面等離子體共振法等來測量。ASCT對細胞內攝取氨基酸的抑制活性可以通過上面l_(6b)記載的方法來評價。另外，對抗原陽性細胞系的⑶C活性或ADCC活性通過已知的方法評價[CancerTmmunol Immunother., 36, 373(1993)]。4.利用本發明的抗ASCT2單克隆抗體或抗體片段治療疾病的方法本發明的特異性識別ASCT2的 細胞外區域的天然三維結構并與該細胞外區域結合的單克隆抗體或其抗體片段，可以用于治療與ASCT2有關的疾病。包含本發明的單克隆抗體或抗體片段或其衍生物的治療藥可以只將該抗體或抗體片段或其衍生物作為活性成分，并優選提供為通過制藥學技術領域中公知的適當方法，將其與一種或多種藥物可接受的載體混合而制造的藥物制劑。給藥途徑的例子包括經口給藥和腸胃外給藥，例如經頰、氣管、直腸、皮下、肌肉內或靜脈內給藥。劑型的例子包括噴霧劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、帶劑等。適合于經口給藥的藥物制劑包括乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等。液體制劑例如乳劑和糖漿劑可以使用下述作為添加劑來生產:7jC，糖例如蔗糖、山梨糖醇和果糖，二醇例如聚乙二醇和丙二醇，油例如芝麻油、橄欖油和大豆油，防腐劑例如對羥基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和胡椒薄荷，等等。膠囊、片劑、散劑、顆粒劑等可以使用下述作為添加劑來生產:賦形劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇，崩解劑例如淀粉和藻酸鈉，潤滑劑例如硬脂酸鎂和滑石粉，粘合劑例如聚乙烯醇、羥丙基纖維素和明膠，表面活性劑例如脂肪酸酯，增塑劑例如甘油，等等。適合腸胃外給藥的藥物制劑包括注射劑、栓劑、噴霧劑等。注射劑可以使用載體例如鹽溶液、葡萄糖溶液或其二者的混合物來制備。栓劑可以使用載體例如可可脂、氫化脂肪或羧酸來制備。噴霧劑可以使用抗體或抗體片段本身、或將其與不刺激患者的口腔或氣道粘膜并能通過將化合物分散成細小粒子而促進其吸收的載體一起使用來制備。載體包括乳糖、甘油等。可以生產藥物制劑例如氣溶膠或干粉。此外，經口制劑的添加劑所例舉的成分，也可以添加到腸胃外制劑中。5.利用本發明的抗ASCT2單克隆抗體或抗體片段診斷疾病的方法與ASCT2有關的疾病可以通過利用本發明的單克隆抗體或抗體片段來檢測或測定ASCT2或表達ASCT2的細胞進行診斷。癌是與ASCT2有關的疾病之一，其診斷可以通過例如如下的檢測或測量ASCT2來進行。首先，從兩個以上健康人生物體采集活體樣品，利用本發明的單克隆抗體或抗體片段或其衍生物，通過以下免疫學手段進行ASCT2的檢測或測量，來確認健康人活體樣品中ASCT2的表達量。通過以同樣方式也檢查待測人活體樣品中ASCT2的量，將該量與健康人的量相比較。當待測人的多肽量與健康人相比增加時，可以診斷癌癥陽性。免疫學方法是利用標記抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫學方法的例子包括放射性物質標記免疫抗體法、酶免疫分析、熒光免疫分析、發光免疫分析、Western印跡法、物理-化學方法等。放射性物質標記免疫抗體法的例子包括這樣的方法:使本發明的抗體或抗體片段與抗原或表達抗原的細胞反應，然后將抗免疫球蛋白抗體進行放射性標記，使其結合片段等等與其反應，繼而利用閃爍計數器等測定。酶免疫分析的例子包括這樣的方法:使本發明的抗體或抗體片段與抗原或表達抗原的細胞等反應，然后使進行過抗體標記的抗免疫球蛋白抗體或其結合片段與其反應，通過分光光度計測量發色的色素；并且可以使用例如夾心ELISA。至于酶免疫分析中使用的標記物，可以使用任何已知的酶標記物[酵素免疫測定法，醫學書院(1987)]。實例包括堿性磷酸酶標記、過氧化物酶標記、熒光素酶標記、生物素標記等。夾心ELISA是抗體與固相結合起來的方法，待檢測或測量的抗原被俘獲，用另一種抗體與被俘獲的抗原反應。在該ELISA中，制備兩種識別待檢測或測量的抗原的抗體或其抗體片段，但它們的抗原識別位點不同，一種抗體或抗體片段被預先吸附在板(例如96-孔板)上，而另一種抗體或抗體片段用熒光物質例如FITC、酶例如過氧化物酶或生物素標記。使吸附了上述抗體的板與從活體分離的細胞或其細胞破碎懸液、組織或其破碎液、培養細胞、血清、胸膜積液、腹水、眼液等反應，然后使其與標記的單克隆抗體或抗體片段反應，并進行該標記物質的相應檢測反應。當通過該方法測量待測樣品中的抗原濃度時，可以從通過逐步稀釋已知濃度的抗原制備的校準曲線來計算待測樣品中的抗原濃度。至于夾心ELISA使用的抗體,可以使用任何多克隆抗體和單克隆抗體,或者可以使用抗體片段例如Fab、Fab’和F(ab)2。至于夾心ELISA中使用的兩種抗體的組合,可以使用識別不同表位的單克隆抗體或抗體片段的組合，或者可以使用多克隆抗體與單克隆抗體或抗體片段的組
口 ο熒光免疫分析包括記載在下面文獻中的方法等[MonoclonalAntibodies-Principles and practice, Third Edition (單克隆抗體-原理和實踐，第三版)，單克隆抗體試驗手冊，Kodansha Scientific (1987) ] 0至于突光免疫分析的標記物，可以使用已經記載的任何已知的突光標記物(突光抗體法，Soft Science, (1983))。例子包括 FITC、RITC 等。可以利用在文獻[生物發光和化學發光，臨床檢查42，廣川書店(1998)]等中記載的方法，進行發光免疫分析。至于發光免疫分析使用的標記物，可以包括任何已知的發光標記物。可以使用的例子包括吖啶酯、洛芬堿等。

Western印跡法是被抗原或表達抗原的細胞通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分級的方法[Antibodies-A Laboratory Manual (抗體-實驗室手冊)(Cold Spring HarborLaboratory, 1988)],該凝膠被點在PVDF膜或硝化纖維素膜上，使該膜與識別抗原的抗體或抗體片段反應，進一步使其與用熒光物質例如FITC、酶標記物例如過氧化物酶、生物素標記等標記的抗小鼠IgG抗體或抗體片段反應，使該標記物可視化來確認反應。其例子描述如下。將表達具有SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的多肽的細胞或組織溶解在溶液中，在還原條件下將每道0.1至30 μ g的蛋白量通過SDS-PAGE法進行電泳。電泳過的蛋白轉移到PVDF膜，使其與含有I至10%BSA的PBS (以下稱為“BSA-PBS” )在室溫下反應30分鐘，進行封阻。此時，使本發明的單克隆抗體與其反應，用含有0.05至0.l%Tween20的PBS (以下稱為“Tween-PBS”)洗滌，并使得與用過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG在室溫下反應2小時。用Tween-PBS洗漆并利用ECL Western印跡檢測試劑(Amersham制造)等檢測單克隆抗體結合條帶，從而檢測具有SEQ ID N0:2表示的氨基酸序列的多肽。至于Western印跡法中供檢測所用的抗體，使用的是能夠與不具有天然型三維結構的多肽結合的抗體。物理化學方法具體通過將ASCT2作為抗原與本發明的抗體或抗體片段反應以形成凝集體，并檢測該凝集體進行。物理化學方法的其它例子包括毛細管法、一維免疫擴散法、免疫比濁法、乳膠免疫比濁法[臨床檢查法提要，金原出版(1988)]等。例如，在乳膠免疫擴散法中，可以使用載體，例如粒徑約0.1至I μ m用抗體或抗原致敏的聚苯乙烯乳膠，并且當利用該相應的抗原或抗體進行抗原抗體反應時，反應溶液中的散射光增加而透射光減少。當作為吸光度或積分球濁度檢測到這樣的改變時，就可以在待測樣品中測量抗原濃度等。
另一方面，為了檢測或測量表達ASCT2的細胞，可以使用已知的免疫學檢測方法，優選使用免疫沉淀法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法、熒光抗體染色法等。免測沉淀法是使表達ASCT2的細胞與本發明的單克隆抗體或抗體片段反應，然后添加與免疫球蛋白例如蛋白G-瓊脂糖具有特異性結合能力的載體，以便抗原-抗體復合體沉淀的方法。也可以進行以下方法。本發明的單克隆抗體或抗體片段在用于ELISA的96-孔板上是固相化的，然后用BSA-PBS封阻。當抗體是未純化的狀態例如雜交瘤細胞的培養物上清液時，抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或蛋白A或G等預先吸附在用于ELISA的96-孔板上，并用BSA-PBS封阻，在其中分配雜交瘤細胞的培養物上清液進行結合。在棄去BSA-PBS并用PBS充分洗滌殘余物之后，用表達ASCT2的細胞或組織的溶解溶液進行反應。從用SDS-PAGE用樣品緩沖液充分洗滌的板提取免疫沉淀物，并通過上述Western印跡法檢測。免疫細胞染色法和免疫組織染色法是這樣的方法:將表達抗原的細胞或組織在有必要的情況下用表面活性劑、甲醇等處理，使得抗體容易的透入細胞或組織，然后使本發明的單克隆抗體與其反應，然后進一步使其與受過熒光標記例如FITC、酶標記例如過氧化物酶或生物素標記的抗免疫球蛋白抗體或其結合片段反應，并使標記物可視化和在顯微鏡下觀察。檢測也可以通過突光抗體染色法進行[Monoclonal Antibodies-Principlesand practice, Third Edition (單克隆抗體_原理和實踐，第三版)，AcademicPress (1996), Manual for Experiments of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體試驗手冊)，Kodansha Scientif ic (1987)],其中使細胞與突光標記抗體反應并通過流式細胞儀分析。特別是，因為本發明的單克隆抗體或抗體片段與ASCT2的細胞外區域結合，所以它可以優選被用來通過熒光抗體染色法檢測表達保持天然型三維結構的這種多肽的細胞。另外，在熒光抗體染色法中使用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems制造)等的情況下，不用將形成的抗體-抗原復合體與未參與形成抗體-抗原復合體的游離抗體或抗原分離，就可以測量抗原量或抗體量。下面通過實施例描述本發明；但是，本發明不局限于以下實施例。實施例1:各種細胞系、異種移植物和正常組織中ASCT2基因表達的分析(I)SCID小鼠皮下移植癌細胞系來構建異種移植物和制備腫瘤塊依照以下方法，在SCID小鼠中皮下移植人類癌細胞系，從而構建異種移植物。從所產生的異種移植物摘出和制備腫瘤塊來源于人類胰腺癌細胞系的細胞[ASPC-1(ATCC編號:CRL_1682)、CaPan-1 (ATCC編號:HTB_79)、PANC-1 (ATCC編號:CRL_1469)]、和人類結腸直腸癌細胞系[Colo205 (Riken (理研院)細胞庫編號:RCB2127)、HT_29 (ATCC 編號:HTB_38)、LS180 (ATCC編號刃(^-187)、5胃1116(么了0:編號:CCL-233)和WiDr(ATCC編號:CCL_218)]以細胞密度約IxlO8細胞/mL懸浮在PBS中。在每組4只Fox CHASE C.B-17/Icr-scidJcl小鼠(雄性，5周齡，購自日本CLEA社)的腹側皮下移植各細胞懸液100 μ L/動物。各種細胞CO2培養箱中37° C下在含有10%失活的胎牛血清(Invitrogen制造)的RPMI1640培養基(Invitrogen制造)中懸浮和傳代培養，用于移植。得到的異種移植物分別命名為xASPCl、xCaPanl、xPANCl、xColo205、xHT29、xLS180、xSW1116 和 XffiDr0腫 瘤移植之后，腫瘤塊的直徑天天使用游標卡尺測量。腫瘤的主軸達到大約Icm的動物依次在麻醉下放血處死，然后摘出每個腫瘤塊。每個腫瘤塊切成4份，用液氮迅速冷凍，然后儲存在_80°C的冷凍器中。(2)總RNA的提取和poly A (+) RNA的純化從細胞系和上面(I)制備的異種移植物的腫瘤塊中，依照以下程序提取總RNA和純化 poly A (+) RNA。至于細胞系，使用血液癌來源的細胞系{KG-1 (ATCC編號:CCL_246)，THP-1 (ATCC編號:TIB-202)，HL-60(ATCC編號:CCL_240)[以上均為急性骨髓性白血病(AML)來源的細胞系];CCRF-CEM (ATCC 編號:CCL_119)，CCRF-SB (ATCC 編號:CCL_120)，Jurkat (ATCC 編號:TIB-152)，HSB-2(ATCC 編號:CCL_120)，HPB-ALL (理研院細胞庫編號:RCB1935)[以上均為急性淋巴細胞性白血病(ALL)來源的細胞系];K-562(ATCC編號:CCL_243)，KU812(ATCC編號:CRL-2099)[以上均為慢性粒細胞性白血病(CML)來源的細胞系];KMS_11 (HSRRB編號:JCRBl 179)，ARH-77(ATCC 編號:CRL_1621)，頂-9 (ATCC 編號:CCL_159)，RPMI8226 (HSRRB編號 JCRB0034)，U266B1 (ATCC 編號:TIB-196)，MC/CAR(ATCC 編號:CRL_8083)[以上均為多發性骨髓瘤(MM)來源的細胞系];HS-Sultan(ATCC編號:CRL-1484)，Daudi (ATCC編號:CCL-213)，Raji (ATCC 編號:CCL_86)，Ramos (ATCC 編號:CRL_1596)[以上均為Burkitt 淋巴瘤(BL)來源的細胞系];U-937(ATCC 編號:CRL_1593.2)，ML_1(DSMZ 編號:ACC464)[均為組織細胞淋巴瘤(HS)來源的細胞系]};肺癌來源的細胞系[PC-14理研院細胞庫編號:RCB0446)，PC-7(免疫生物研究所社，產品編號:37011)，PC_9(免疫生物研究所社，產品編號:37012)，PC-1 (免疫生物研究所社，產品編號:37008)(以上均為非小細胞肺癌)；Lu-139(理研院細胞庫編號:RCB0469), NC1-H69 (ATCC編號=HTB-119),RERF-LC-MA (HSRRB 編號:JCRBQ812)，SBC-5 (HSRRB 編號:JCRB0819)(以上均為小細胞肺癌)];胃癌來源的細胞系[Kato III (理研院細胞庫編號:RCB2088)，MKN-74 (HSRRB編號:JCRBG255)，NUGC-4(理研院細胞庫編號:RCB1939)，AZ-521 (HSRRB 編號 JCRB0061)];結腸直腸癌來源的細胞系{Colo205(理研院細胞庫編號:RCB2127)、HT-29(ATCC編號:HTB_38)、LS174T[European Collection of Cell Cultures (歐洲細胞培養物保藏中心)(ECACC)編號=87060401], LS180(ATCC 編號:CCL187)，SW1116 (ATCC 編號:CCL_233)};胰腺癌來源的細胞系[ASPC-1 (ATCC 編號:CRL-1682)，BXPC-3 (ATCC 編號:CRL_1687)，CaPan-1 (ATCC編號:HTB-79)];惡性黑色素瘤(黑色素瘤)來源的細胞系[G-361(ATCC編號:CRL_1424)，HMV-1 (理研院細胞庫編號:RCB0004)，SK-MEL-28 (ATCC編號:HTB_72)];和正常人類肺成纖維細胞[MRC-5(ATCC 編號:CCL-171)]。
從細胞系提取總RNA如下進行。在粘著細胞系的情況下，培養之后使用抽吸器除去培養基，用適量的PBS洗滌，并使用有機硅制成的刮片回收細胞。將細胞充分懸浮并通過每種細胞對應于IOcm2培養面積添加ImL TRIzol試劑(Invitrogen制造)進行裂解。另夕卜，得到的細胞裂解液10次通過18-號注射針頭，將基因組DNA斷裂成片。在漂浮細胞系的情況下，使用冷凍離心機(日立工機社制造，Himac CF15R，轉頭:T11A21)，將細胞培養物以1，500rpm離心5分鐘，通過傾析除去培養基，將細胞懸浮在PBS中。細胞懸浮液再次用冷凍離心機(日立工機社制造，Himac CF15R，轉頭:T11A21)以1500rpm離心5分鐘，并回收細胞。向IxlO7個回收細胞中，添加ImL TRIzol試劑(Invitrogen制造)，并充分懸浮使得細胞裂解。將細胞裂解液10次通過18-號注射針頭，將基因組DNA斷裂成片。如下進行(I)中制備的異種移植物腫瘤塊的裂解和總RNA的提取。將凍結的腫瘤塊投入IOmL TRIzol試劑(Invitrogen制造)中，并立即使用Polytron勻衆器(PT 2100,Kinematica制造)以30，OOOrpm裂解15秒，得到細胞裂解液。每個細胞裂解液使用冷凍離心機(日立工機社制造，Himac CF15R，轉頭:T11A21)以11，OOOrpm離心10分鐘，并將各上清液小心轉移到新鮮試管，免得帶出沉淀物。向上清液添加2mL氯仿并劇烈攪拌15秒，混合物在室溫下靜置2至3分鐘，并使用冷凍離心機(日立工機社制造，Himac CF7D2，轉頭:RT3S3)在4°C下以3，OOOrpm離心90分鐘。將各上清液轉移至新鮮的試管，向其添加5mL異丙醇，然后輕柔混合。將混合物在室溫下靜置10分鐘，并使用冷凍離心機(日立工機社制造，Himac CF15R，轉頭:T11A21)以11，OOOrpm離心10分鐘去除上清液之后，向其中添加IOmL 75%乙醇水溶液，然后使用冷凍離心機(日立工機社制造，Himac CF15R，轉頭:T11A21)以11，OOOrpm混合和離心5分鐘，得到沉淀物。沉淀物溶解在適量的無RNase的水中，以制備總RNA樣品。總RNA樣品的濃度通過吸光光度計測量，并確認A260/A280的比率是1.7以上。當A260/A280的比率小于1.7時，使用RNeasy試劑盒(Qiagen制造)進行進一步純化。從上面制備的400 μ g總RNA樣品中，使用Micro Poly(A)純化試劑盒(Ambion制造)，按照其中附帶的說明書，純化poly A(+)RNA。(3)cDNA 的合成使用供RT-PCR用的Superscript第一鏈合成系統(Invitrogen制造)，從(2)中得到的poly A(+)RNA或市售的組織來源的mRNA合成cDNA。
至于來源于人類正常組織(肝臟、肺、全腦、心臟、胃、脾、脊髓、小腸、骨骼肌、子宮、呼吸道、甲狀腺、胸腺、精巢、唾液腺、前列腺、胎盤、淋巴結、胰腺、大腸、血液或腎臟)的mRNA,使用市售的mRNA (Clontech制造)。來源于人類臨床癌組織(肺癌、胃癌、直腸結腸癌、腎癌、肝癌、子宮癌、乳腺癌或食道癌)的mRNA，也使用市售的RNA (BioChain制造)。向(2)中得到的I μ g poly A (+) RNA或市售的組織來源的mRNA中，添加I μ LIOmmoI/L dNTP 和 I μ L0.5 μ g/ μ L Oligo (dT) 12_18，然后向其中添加 DEPC 水至總量 7 μ L。將反應溶液在65°C加熱5分鐘變性，在冰上驟冷，并使其靜置I分鐘以上。向mRNA溶液中，添加 IOx RT 緩沖液(2 μ L)、氯化鎂(4 μ L, 25mmol/L)、0.lmol/LDTT (2 μ L)和 RNase OUT 重組核糖核酸酶抑制劑(I μ L)，并將溫度保持在42°C 2分鐘。向其中再加入SuperscriptIIRT(IuL)以在42°C進行逆轉錄反應50分鐘。在70°C加熱15分鐘使酶失活。然后，向反應溶液中加入I μ L大腸桿菌RNase H并在37°C反應20分鐘。向所得到的溶液中添加DEPC水，以達到總量ImL。以下，是采用以上制備的溶液的五倍稀釋液10 μ L進行實時PCR的反應體系。(4)通過實時PCR法(定量PCR法或Q-PCR法)定量測定細胞系、異種移植物腫瘤塊和正常組織中ASCT2基因的mRNA的表達水平向(3)中制備的各cDNA 10 μ L(對應于2ng的poly A(+)RNA)中，加入用于檢測ASCT2基因的cDNA的正向引物(Fw#l)和用于檢測ASCT2基因的cDNA的反向引物(Rv#l)，達到它們各自300nmol/L的終濃度，其中正向引物包含從SEQ ID N0:1設計的SEQ ID NO: 3表示的核苷酸序列，反向引物包含SEQ ID N0:4表示的核苷酸序列(均由Proligo制造)。此夕卜，向得到的溶 液中，加入IOx R-PCR緩沖液(無Mg2+，Takara Bio制造，2 μ L)、250mmol/L Mg2+溶液(0.2μ L)、dNTPs(10mmol/L，0.6μ L)、Ex Taq R-PCR (Takara Bio 制造，0.2 μ L)和SYBR Green I (BMA制造；產品原液稀釋2，500倍，I μ L)。向其中添加DEPC水，至總量20 μ L0PCR在以下反應條件下進行:最初在94°C激活Taq DNA聚合酶和變性模板DNA5分鐘，然后進行45個循環，每個由三個過程組成:94°C變性30秒、65°C退火30秒和72°C DNA延長30秒。由插入到擴增產物的SYBR Green I產生的熒光強度通過PRISM 7700 (AppliedBiosystems制造)測量,數據根據儀器PRISM 7700附帶的軟件Sequence Detector 1.7a版進行分析。以上實時PCR得到的信號是否是目的擴增片段，通過在反應完成之后將反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳得到的主要擴增片段的大小來判斷。以上實時PCR使用96-孔PCR板進行。除了以上含有cDNA的反應溶液以外，陰性對照(無菌水)和使用通過Qiagen質粒Midi試劑盒(Qiagen制造)純化的編碼ASCT2的部分片段的質粒HCH0N2001712 (人類CDNAFLJ43232 fis,日本DNA數據庫(DDBJ)編號:AK125222)制備的用于制作校準曲線(1x10至IxlO6拷貝/孔)的樣品，以PCR板的每個孔中一種樣品進行安排，并進行PCR。圖1 (I)至I (4)顯示作為ASCT2的標準序列的NM_005628的全長序列(SEQID NO:1, GenBank編號:NM_005628)的比對，和用作模板用于制作校準曲線的質粒HCH0N2001712的全長序列的比對。在NM_005628和HCH0N2001712的全長序列之間有不一樣的位點。因此，供檢測包含SEQ ID N0:3表示的核苷酸序列的cDNA用的正向引物(Fw#l)和供檢測包含SEQ ID N0:4表示的核苷酸序列的cDNA用的反向引物(Rv#l)，二者用于測量ASCT2表達水平，它們使用在NM_005628和HCH0N2001712序列之間完全同樣的區域來設if ο在每個這樣得到的細胞系、異種移植物腫瘤塊和正常組織中ASCT2基因的mRNA的表達水平的結果顯示在圖2(1)至2 (2)中。mRNA表達水平顯示為每2ng的poly A(+)RNA表達的ASCT2分子數與規定為I的顯示出正常組織最高表達的氣道中ASCT2基因表達水平的相對比。與正常氣道相比較，發現了表達水平提高，亦即，下列細胞系的表達提高了 10-倍以上:血液癌來源的細胞系KG-UAML-來源的細胞系)，HSB-2(ALL-來源的細胞系)，K-562(CML-來源的細胞系)，和KMS-1l和ARH_77( 二者均為MM-來源的細胞系);下列細胞系的表達提高了 5-倍以上Jurkat (ALL-來源的細胞系)，頂-9，RPMI 8226 ( 二者均為MM-來源的細胞系)，HS-Sultan (BL-來源的細胞系)和ML-1 (HL-來源的細胞系)；下列細胞系的表達提高了 2-倍以上:THP-1 (AML-來源的細胞系)，CCRF-CEM(ALL-來源的細胞系)，KU812 (CML-來源的細胞系)，Raji (BL-來源的細胞系)，U-937 (HS-來源的細胞系)，胃癌組織和食道癌組織。實施例2:導入人類ASCT2-myC/His基因的CHO細胞系的構建按照以下方法，得到包含SEQ ID NO:5表示的核苷酸序列和SEQ ID N0:6表示的氨基酸序列的質粒PCR4-SLC1 A5-myc/Hiso使用這種質粒，得到了導入人類ASCT2_myc/His基因的CHO細胞系。向包含SEQ ID NO:7-10的各個核苷酸序列的相應引物(10 μ mol/μ L，各1L)中，加入 IOx Ex Taq 緩沖液(10 μ L)、dNTP (2mmol/L, 10 μ L)和 Ex Taq 聚合酶(I μ L,以上均由Takara Bio制造)，并向其中進一步加入無菌水至總量100 μ L。以類似于實施例1 (3)中記載的方法，在以下反應條件下進行PCR:在96° C反應2分鐘，然后進行35個循環，每個由三個過程組成:96° C反應I分鐘、60° C反應I分鐘和72° C反應I分鐘。結果，當人類ASCT2基因翻譯起始點的核苷酸被定為I位時，合成了對應于I至370位核苷酸序列的核苷酸序列(以下稱為“N-SLC1A5”)。反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離。所得到的大約0.4-kb的擴增片段使 用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen制造)進行提取，然后使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen制造)克隆到pCR4 TOPO載體中(以下，所得到的質粒稱為“PCR4-N-SLC1A5”)。接下來，向IOng包含人類ASCT2基因作為模板的質粒HCH0N2001712 (DDBJ編號:AK125222)中，加入包含SEQ ID NOs: 11和12表示的核苷酸序列的各個引物(10 μ mol/L，各I μ L)、IOx Ex Taq 緩沖液(10μ L)、dNTP(2mmol/L，10μ L)和 Ex Taq 聚合酶(I μ L，以上均由Takara Bio制造)，并向其中進一步加入無菌水至總量100 μ L。在與上面描述的相同反應條件下，進行PCR以合成編碼融合蛋白的核苷酸序列(以下稱為“C-SLClA5-myc/His”)，所述融合蛋白在對應于人類ASCT2基因365至1623位核苷酸序列的核苷酸序列的C-端附加了 myc/His。反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離。所得到的大約1.2_kb擴增片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen制造)進行提取。向所得到的作為模板的提取片段中，加入包含SEQ ID N0s:ll和13表示的核苷酸序列的各個引物(ΙΟμπιοΙ/L，各lyL)、10xEx Taq 緩沖液(10 μ L)、dNTP (2mmol/L, 10 μ L)和 Ex Taq 聚合酶(I μ L,以上均由 TakaraBio制造)，并向其中進一步加入無菌水至總量100 μ L0在與上面描述的相同反應條件下，進行PCR以向C-SLClA5-myc/His的C端添加Notl和Spel限制酶位點。所得到的反應產物通過瓊脂糖凝膠電泳分離。所得到的大約1.2-kb的擴增片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen制造)進行提取,然后使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen制造)克隆到PCR4T0P0載體中(以下，將所得到的質粒稱為“pCR4-C-SLClA5-myc/His”)。盡管當SEQ IDNO:1表示的序列的翻譯起始點處的核苷酸被規定為I位時，1455位的T被C取代，但所得到的基因序列沒有顯示出氨基酸變異。得到的pCR4_N_SLClA5 用 BssHII (Takara Bio 制造)和 SpeI (Takara Bio 制造)消化，并通過瓊脂糖凝膠電泳分離。得到的大約4.4-kb的基因片段使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen制造)進行提取。同樣地,得到的pCR4-C-SLClA5_myc/His用BssHII (TakaraBio制造)和SpeI (Takara Bio制造)消化，并提取大約1.4_kb的基因片段。每個提取片段使用Ligation high(東洋紡織社制造)連接，然后按照Cohen等的方法[Proc NatlAcad-Sc1.USA, 69, 2110 (1972)]，用得到的載體轉化大腸桿菌DH5 α (東洋紡織社制造)。使用自動化質粒分離系統P1-50 (Kurabo制造)，從得到的轉化體提取質粒，得到包含SEQ IDΝ0:5表示的核苷酸序列和SEQ ID Ν0:6表示的氨基酸序列的質粒pCR4-SLClA5myc/His。將得到的pCR4_SLClA5myc/His 用 EcoRI (Takara Bio 制造)和 KpnI (Takara Bio制造)消化，并以上面同樣的方式，提取基因片段，得到包含編碼融合蛋白的核苷酸序列(以下稱為“SLClA5-myC/His”)的片段，所述融合蛋白在人類ASCT2基因的C-端添加了myc/Hisο將得到的含有SLClA5_myc/His的片段連接到預先用EcoRI (Takara Bio制造)和KpnI (Takara Bio制造)消化的pKANTEX93載體中(W097/10354)。用與上述同樣的方式，用連接產物轉化大腸桿菌DH5ci (東洋紡織社制造)。得到轉化體之后，使用質粒分離試劑盒(Qiagen 制造)得到表達質粒 pKANTEX-SLClA5_myc/His。依照電穿孔法[Cytotechnology,3, 133 (1990)],將 pKANTEX-SLClA5_myc/His 以下述方式導入 CH0/DG44 細胞[Somatic Cell and Molecular Genetics.12.555 (1986) I。在此使用的細胞是在含 有10%FBS(Life Technologies制造)和慶大霉素(50 μ g/mL，Nacalai Tesque 制造)的 IMDM (Invitrogen 制造)中添加 IxHT 補充劑(Invitrogen 制造)的培養基(以下稱為“A3培養基”)中傳代培養的細胞。CH0/DG44細胞懸浮在含有氯化鉀(137nmol/L)、氯化鈉(2.7nmol/L)、磷酸氫二鈉(8.lmmol/L)、磷酸二氫鈉(1.5nmol/L)和氯化鎂(4mmol/L)的緩沖液(以下稱為“Κ-PBS”)中，至細胞密度為8xl06細胞/mL，并將得到的細胞懸液(200 μ L，細胞計數為1.6χ106細胞)與表達質粒pKANTEX-SLClA5-myc/His (10 μ g)混合。將混合物轉移到小池(電極間距:2mm)中，使用GenePulser II (Bio-Rad制造)在0.35kV的脈沖電壓和250 μ F的電容下進行基因導入。將小池在冰上靜置后，將小池中的細胞懸液懸浮在含有A3培養基的細胞培養容器中，在5%C02培養箱中37°C下培養。培養四天之后，用含有G418的A3培養基(Nacalai Tesque制造；0.5mg/mL)更換培養基，繼續細胞培養。在細胞培養期間進行培養基更換和傳代培養，在基因導入之后大約兩周，得到對G418有抗性的轉化細胞。將得到的G418-抗性轉化細胞在含有0.5mg/L G418的A3培養基中(NacalaiTesque制造)稀釋到細胞密度為5個細胞/10mL，并將稀釋的細胞懸液以100 μ L/孔分配到96-孔板中，然后在逐步增加的氨甲喋呤濃度中生長。以這種方式，選擇顯示出ASCT2-myc/His的高表達水平的克隆，然后從中得到導入了人類ASCT2-myC/His基因的CHO細胞系。得到的人類ASCT2_myc/His基因導入的CHO細胞(Ixl05-5xl05cells)懸浮在70%乙醇-PBS(ImL)中并在冰溫下固定30分鐘。在以IxlO6至5xl06細胞/孔分配到96-孔U形底板并隨后在1，500rpm離心5分鐘之后，棄去上清液，然后用1%BSA_PBS在冰溫下封阻30分鐘。離心除去上清液后，抗-myc抗體PL14(醫學生物學研究所制造)、抗-His抗體(Qiagen制造)和小鼠IgGl同種型對照(Dako制造)作為第一抗體分別用1%BSA_PBS稀釋至終濃度為1.0、0.1和0.lyg/mL，并以100 μ L/孔分配，在冰溫下反應60分鐘。在板用1%BSA-PBS洗滌一次之后，添加100 μ L/孔用1%BSA_PBS稀釋50倍的FITC-標記的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L) (DAK0制造)作為第二抗體，并在遮光和冰溫下反應30分鐘。在用P/oBSA-PBS再次洗滌一次之后，將細胞懸浮在PBS中，并通過流式細胞儀Cytomics FC500MPL, Beckman Coulter制造)測量突光強度。結果顯示在圖3中。根據檢測到抗-myc抗體和抗-His抗體高反應性的事實，確認構建了導入人類ASCT2-myC/His基因的目的CHO細胞系。實施例3:對抗ASCT2的N-端部分肽的單克隆抗體的構建

(I)制備免疫原為了與載體蛋白結合,使用自動化合成機(PSSM-8,島津制作所社制造)合成SEQID NO: 14表示的C-端附加了 Cys的人類ASCT2基因的N-端部分肽(從N-端起2至16位
氣基酸殘基)。為了提高免疫原性，如下制備與KLH(和光純藥社制造)的結合物，并用作免疫原。亦即，將KLH溶解在PBS中至濃度為10mg/mL，然后將1/10體積的N_(間-馬來酰亞胺苯甲酰氧基)琥拍酰亞胺(MBS, Nacalai Tesque制造,25mg/mL)逐滴添加到其中，然后在攪拌下反應30分鐘。反應溶液通過預先用PBS平衡的凝膠過濾柱(Sephadex G-25柱，GEHealthcare制造)，除去未反應的MBS，得到KLH-MBS。附加了 Cys的人類ASCT2的N-端部分肽(Img)溶解在磷酸鈉緩沖液(0.lmol/L, pH7.0)中，向其中添加2.5mg KLH-MBS，然后在攪拌下于室溫中反應3小時。反應完成之后，反應溶液對PBS透析，從而獲得人類ASCT2N端肽-KLH結合物作為免疫原。(2)動物的免疫和抗體產生細胞的制備將上面(I)得到的人類ASCT2N端肽-KLH結合物(100 μ g)與2mg鋁凝膠和IxlO9細胞的百日咳疫苗(千葉縣血清研究所制造)一起施用至4-周齡雌性SD大鼠(日本SLC出產)。第一次給藥之后兩周，將結合物(IOOyg)每周一次再施用于所述大鼠，總計四次。從大鼠的尾靜脈收集血液，其與人類ASCT2部分肽的反應性通過以下的酶免疫分析調查。最后免疫的三天之后，從顯示出足夠抗體滴度的大鼠摘出脾臟。脾臟在MEM(日水制藥社制造)中細細切碎，用鑷子分散，在l，200rpm下離心5分鐘(CR5B，日立制作所制造)。向得到的沉淀級分中添加Tris-氯化銨緩沖液(pH7.65)，反應I至2分鐘，以除去紅血球。作為沉淀級分得到的細胞級分用MEM洗三次，從而制備抗體產生細胞。(3)酶免疫分析根據以下方法，將SEQ ID NO: 14表示的人類ASCT2的附加Cys的N-端部分肽制備成與甲狀腺球蛋白(以下稱為“THY”)的結合物的形式。結合物的構建方法與⑴相同，但是使用4-(N-馬來酰亞胺甲基]-環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯代替MBS。得到的人類ASCT2 N端肽-THY結合物(10 μ g/mL, 50 μ L/孔)分配到96-孔EIA板(Greiner制造)中，在4° C靜置過夜以便吸附。洗掉未吸附的結合物之后，向板添加l%BSA-PBS(100yL/孔)，然后在室溫反應I小時，封阻剩余的活性基團。洗掉未反應的BSA-PBS之后，將50 μ L/孔的被測物質例如抗血清或培養上清液作為第一抗體分配到板中，然后反應2小時。將板用0.05% Tween-PBS洗滌，并將50 μ L/孔稀釋的過氧化物酶標記的抗大鼠免疫球蛋白(Dako制造)作為第二抗體加到板中，然后在室溫反應I小時。在板用0.05% Tween-PBS洗滌之后，在孔中添加2，2-連氮雙(3-乙基苯并噻唑啉_6_磺酸)銨(ABTS)底物溶液[ABTS (和光純藥社制造，lmmol/L)，檸檬酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH4.2)，和Η202 (0.1%)]，然后顯色。在樣品波長415nm和參考波長490nm下的吸光度(0D415-0D490)使用讀板器(Emax微板讀板器，Molecular Devices)測量。(4)小鼠骨髓瘤細胞的制備8-氮雜鳥嘌呤-抗性小鼠骨髓瘤細胞系P3-U1 [P3X63Ag8U.1, ATCC編號:CRL-1597, European Journal of Immunology, 511 (1976)]培養在于 RPMI1640 培養基(Invitrogen制造)中添加了谷氨酰胺(1.5mmol/L)、2-巰基乙醇(5xlO_5mol/L)、慶大霉素(10 μ.g/mL)和FBS (10%)的培養基(以下稱為“正常培養基”)中以確保細胞融合必要的2xl07個以上的細胞計數，并在細胞融合中作為親本細胞提供。(5)雜交瘤的制備在⑵中得到的抗體產生細胞和⑷中得到的骨髓瘤細胞以10:1的比例混合，并將得到的細胞以l，200rpm離心5分鐘(CR5B，日立制作所制造)。棄去上清液并充分分散沉淀的細胞。在37° C和攪拌下，每IxlO8個抗體產生細胞加入PEG IOOO(Ig)、MEM (Invitrogen制造，ImL)和二甲基亞砜(0.35mL)的混合物0.5mL,并數次每隔I至2分鐘向懸液添加MEM(ImL)，然后添加MEM至總量為50mL。900rpm下離心5分鐘之后(CR5B，日立制作所制造)，棄去上清液并緩慢打散沉淀的細胞。然后，通過輕柔地上下吹吸，將細胞懸浮在IOOmL添加了 HAT培養基補充劑(Invitrogen制造)的正常培養基(以下稱為“HAT培養基”)中。在96-孔培養板中，分配200uL/孔得到的懸液，并在5%C02培養箱中37°C培養10至14天。培養之后，培養上清液通過(3)中記載的酶免疫分析進行檢查，選擇特異性與人類ASCT2的N-端部分肽反應的孔。選擇的孔中包含的細胞通過有限稀釋法克隆兩次，得到產生對抗ASCT2的N端部分肽的單克隆抗體的雜交瘤KM3842。使用亞類分型試劑盒(ABTSarotech制造)，KM3842的抗體亞類被確定為是大鼠IgG2a(圖4)。(6)獲得純化的單克隆抗體(5)中得到的雜交瘤(5x106-20x106細胞/動物)腹膜內注射到降植烷處理的8周齡雌性裸鼠(Balb/c，日本SLC出產)中。10至21天之后，雜交瘤變成腹水癌。從產生腹水的小鼠收集腹水(l_8mL/動物)。然后，將腹水以3，OOOrpm離心5分鐘(CR5B，日立制作所制造)，以除去固形成分。得到的溶液通過辛酸沉淀法[Antibodies-A LaboratoryManual (抗體-實驗室手冊),Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]純化,獲得純化的KM3842 抗體。
實施例4:ASCT2的N端部分肽與純化的單克隆抗體的反應性調查根據實施例3 (3)中記載的酶免疫分析法，考察單克隆抗體KM3842與ASCT2的N端部分肽的反應性。實施例3(6)中得到的純化的抗體KM3842用1%BSA_PBS分別稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001 yg/mL的濃度，并用作一級抗體。測量結果如圖4所示，抗體KM3842顯示出與ASCT2的N端部分肽的特異反應性。實施例5:對抗ASCT2的細胞外區域的單克隆抗體的構建(I)制備免疫原實施例2得到的導入人類ASCT2-myC/His基因的CHO細胞系培養在含有10%FBS的IMDM(Invitrogen制造)中2至3天，并使用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(NacalaiTesque制造)剝離。細胞懸浮在PBS中，達到每個免疫動物為6χ106-1χ107個細胞的細胞計數。(2)動物的免疫和抗體產生細胞的制備(I)中得到的細胞懸液與IxlO9個細胞的百日咳疫苗(千葉縣血清血清研究所制造)一起，施用于6-周齡雄性BXSB小鼠(η=3/組，日本SLC出產)或4-周齡雌性SD大鼠(η=3/組，日本SLC出產)。給藥一周之后，所述細胞懸液每周一次施用于所述動物，總計四次。此后，從小鼠的眼底或大鼠的尾靜脈收集血液。血液中其抗體滴度使用以下細胞基分析系統(ABI 8200細胞檢測系統，Applied Biosystems制造)或流式細胞儀(CytomicsFC500 MPL, Beckman Coulter制造)，通過熒光細胞染色法測量。最后免疫的三天之后，從顯示出足夠抗體滴度的小鼠或大鼠摘出脾臟。用和實施例3(2) —樣的方法，從得到的脾臟制備抗體產生細胞。(3)熒光細胞染色法-1 (細胞基分析系統)實施例2中得到的導入ASCT2-myc/His基因的CHO細胞系和導入載體的CHO細胞用作分析細胞。每種細胞在含有10%FBS的MDM(Invitrogen制造)中培養2至3天，并用懸浮在相同培養基中的胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen制造)剝離，以IxlO4細胞/100 μ L培養基/孔的細胞密度接種在ΑΒΙ8200黑色96-孔板中，并培養過夜。將被測物質例如抗血清或培養上清液(10 μ L/孔)分配至板中作為第一抗體，然后添加100 μ L/孔的ALEXA647-標記的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)或ALEXA647-標記的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(以上均由Invitrogen制造)作為第二抗體,然后遮光下靜置4小時。用激光器(633nm He/Ne)激發的650至685nm的突光通過ABI8200細胞檢測系統(Applied Biosystems制造)進行測量。(4)熒光細胞染色法-2 (流式細胞儀)實施例2得到的導入人類ASCT2-myC/His基因的CHO細胞系和導入載體的CHO細胞用作分析細胞。每種細胞在含有10% FBS的MDM(Invitrogen制造)中培養2至3天并用0.0296EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剝離，將它們用PBS洗滌，并使用1%BSA_PBS在冰溫下封阻20分鐘，以避免非特異性抗體吸附。得到的細胞以5x10s細胞/50 μ L/孔的細胞密度接種在96-孔U形底板中，然后以l，800rpm離心2分鐘(05PR-22，日立工機社制造)，然后除去上清液。分配被測物質(50 μ L/孔)例如抗血清或培養上清液作為第一抗體，然后在冰溫下反應30分鐘。使用PBS通過離心法洗滌3次，并添加50 μ L/孔的ALEXA488標記的抗小鼠免疫球蛋白G(G+L)或ALEXA488標記的抗大鼠免疫球蛋白G(G+L)(均由Invitrogen制造)作為第二抗體，然后遮光下在冰溫下反應30分鐘。細胞再次使用PBS通過離心洗滌三次之后，將細胞懸浮在PBS 中，用488nm Ar激光器激發的510至530nm的熒光通過流式細胞儀(Cytomics FC500 MPL, Beckman Coulter 制造)測量。(5)雜交瘤的構建用和實施例3(5) —樣的方法，在(2)中得到的抗體產生細胞和實施例3(4)得到的骨髓瘤細胞之間進行細胞融合。接著，將細胞融合得到的細胞懸浮在HAT培養基中。將得到的細胞懸液以200uL/孔分配到96-孔培養板中，細胞在5%C02培養箱中37°C培養8至10天。培養后的上清液的反應性通過上面(3)和(4)記載的熒光細胞染色法確認，并選擇與導入人類ASCT2-myC/His基因的CHO細胞系起反應而不與導入載體的CHO細胞起反應的孔。然后，將選出的孔中包含的細胞通過有限稀釋法克隆兩次，以得到產生對抗ASCT2的細胞外區域的單克隆抗體的雜交瘤KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012和KM4018。在得到的雜交瘤當中，按照以下方法測定小鼠單克隆抗體的亞類。將抗小鼠免疫球蛋白兔多克隆抗體(Dako制造,10 μ g/mL, 50 μ L/孔)分配到96-孔EIA板(Greiner制造)中，并在4° C靜置過夜進行吸附。洗掉未吸附的結合物之后，向板添加1% BSA-PBS 100 μ L/孔，然后在室溫反應I小時，以封阻剩余的活性基團。洗掉未反應的BSA-PBS之后，將50 μ L/孔的被測物質分配到板中，然后反應2小時。將板用0.05%Tween-PBS洗滌，并將稀釋的亞類特異性過氧化物酶標記的抗小鼠免疫球蛋白(Invitrogen制造,50 μ L/孔)作為第二抗體加到板中，然后在室溫反應I小時。將板用0.05% Tween-PBS洗滌，并添加實施例3 (3)使用的ABTS底物溶液進行顯色。然后，在樣品波長415nm和參考波長490nm下的吸光度(0D415-0D490)使用讀板器(Emax微板讀板器，Molecular Devices)測量。所屬亞類不能通過以上提到的方法確定的小鼠單克隆抗體的亞類使用小鼠大鼠單克隆同種型分型試劑盒(大日本住友制藥社制造)測定。此外，大鼠單克隆抗體的亞類使用大鼠單克隆同種型分型試劑盒(大日本住友制藥社制造)測定。表I示出動物物種和來源于各個雜交瘤的抗體一覽表。表權利要求
1.單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識別系統ASC氨基酸轉運蛋白2ASCT2的細胞外區域的天然三維結構并與該細胞外區域結合，其中: (B)抗體的VH的CDRl、CDR2和CDR3分別由SEQ ID NO: 32、33和34表示的氨基酸序列組成，和抗體的VL的CDR1、CDR2和CDR3分別由SEQ ID NO: 35、36和37表示的氨基酸序列組成。
2.根據權利要求1所述的單克隆抗體或其抗體片段，其抑制通過ASCT2細胞內攝取氨基酸。
3.根據權利要求1或2所述的單克隆抗體或其抗體片段，其具有細胞毒性。
4.根據權利要求3所述的單克隆抗體或其抗體片段，其中所述細胞毒性是抗體依賴性細胞毒性ADCC活性或補體依賴性細胞毒性CDC活性。
5.根據權利要求1或2所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與人類ASCT2結合而不與小鼠ASCT2結合。
6.根據權利要求5所述的單克隆抗體或其抗體片段，其與人類ASCT2的至少EL2區域彡口口
7.根據權利要求1或2所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是與被選自保藏號為FERM BP-10963的雜交瘤KM4012產生的單克隆抗體所識別的表位結合的單克隆抗體。
8.根據權利要求1或2所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是由選自保藏號為FERM BP-109 63的雜交瘤KM4012產生的單克隆抗體。
9.根據權利要求1或2所述的抗體片段，其中所述抗體片段是選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體scFv、二聚體化V區雙抗體、二硫鍵穩定的V區dsFv和包含⑶R的肽的抗體片段。
10.根據權利要求1或2所述的抗體或其抗體片段，其中所述單克隆抗體是重組抗體。
11.根據權利要求10所述的重組抗體或其抗體片段，其中所述重組抗體是選自人嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體的重組抗體。
12.根據權利要求10所述的重組抗體或其抗體片段，其包括權利要求1至8任一項所述的單克隆抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的互補決定區CDR。
13.根據權利要求11所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其包含權利要求1至7任一項所述的單克隆抗體的VH和VL。
14.根據權利要求13所述的人嵌合抗體或其抗體片段，其選自其中抗體的VH包含SEQID NO:23表示的氨基酸序列和抗體的VL包含SEQ ID NO:25表示的氨基酸序列的人嵌合抗體。
15.保藏號為FERMBP-10963的雜交瘤KM4012。
16.DNA，其編碼權利要求1至14任一項所述的抗體或其抗體片段。
17.重組載體，其包含權利要求16所述的DNA。
18.轉化體，其能通過將權利要求17所述的重組載體導入宿主細胞獲得。
19.生產權利要求1至14任一項所述的抗體或其抗體片段的方法，包括在培養基中培養權利要求15所述的雜交瘤或權利要求18所述的轉化體以在培養物中形成和累積權利要求丨至14任一項所述的抗體或其抗體片段，和從所述培養物收集所述抗體或其抗體片段。
20.ASCT2相關疾病的治療藥，其包含權利要求1至14任一項所述的抗體或其抗體片段作為活性成分。
21.根據權利要求20所述的治療藥，其中與ASCT2相關的疾病是癌癥。
22.根據權利要求21所述的治療藥，其中癌癥是血液癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、肝癌或前列腺癌。
23.免疫學檢測或測量ASCT2的試劑，其利用權利要求1至14任一項所述的抗體或其抗體片段。
24.ASCT2相關疾病的診斷試劑，其利用權利要求1至14任一項所述的抗體或其抗體片段。
25.根據權利要求24所述的診斷試劑，其中與ASCT2相關的疾病是癌癥。
26.根據權利要求25所述的診斷試劑，其中癌癥是血液癌、食道癌、胃癌、直腸結腸癌、肝癌或前列腺癌。
27.免疫學檢測或測量ASCT2的方法，其利用權利要求1至14任一項所述的抗體或其抗體片段。
28.根據權利要求27所述的方法 ，其中免疫學測量方法是免疫沉淀法。
29.免疫學檢測或測量表達ASCT2的細胞的方法，其利用權利要求1至14任一項所述的抗體或其抗體片段。
30.根據權利要求29所述的方法，其中免疫學檢測方法是熒光細胞染色法。
全文摘要
本發明公開了單克隆抗體或其抗體片段，所述單克隆抗體特異性識別ASC氨基酸轉運蛋白2系統(ASCT2)的細胞外區域的天然結構并與該細胞外區域結合；能夠產生所述抗體的雜交瘤；編碼所述抗體的DNA；攜帶所述DNA的載體；通過導入所述載體產生的轉化體；利用所述雜交瘤或轉化體生產抗體或其抗體片段的方法；和包含所述抗體或其抗體片段的治療藥，以及包含所述抗體或其抗體片段的診斷試劑。
文檔編號A61K39/395GK103172735SQ20131005086
公開日2013年6月26日 申請日期2009年7月17日 優先權日2008年7月17日
發明者白石紀彥, 古谷安希子, 土岐浩惠, 安藤博司, 鈴木昌代, 久保田麗夫 申請人:協和發酵麒麟株式會社