一種從羅漢果廢棄物中富集谷氨酸脫羧酶制備γ-氨基丁酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從羅漢果廢棄物中富集谷氨酸脫羧酶制備γ?氨基丁酸的方法，屬于有機酸生產領域。本發明將從羅漢果廢棄物中的羅漢果果籽中提取的谷氨酸脫羧酶用于生物催化生產GABA，大大提高了羅漢果在生產中的使用效率。按照本發明所述的方法所得到的GABA產品經高效液相色譜法檢測，谷氨酸轉化率為99％，GABA收率大于95％。本發明生產GABA的過程未使用對人體有害的有機溶劑，生產過程綠色環保，產品安全，可用于食品、醫藥行業。
【專利說明】
一種從羅漢果廢棄物中富集谷氨酸脫羧酶制備γ -氨基丁酸的方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種從羅漢果廢棄物中富集谷氨酸脫羧酶制備γ-氨基丁酸的方法，屬于氨基酸及其衍生物生產領域。
【背景技術】
[0002]γ-氨基丁酸(簡稱GABA)是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，由谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸的α-脫羧反應生成，是哺乳動物中樞神經系統中重要的抑制性神經傳達物質。在人體大腦皮質、海馬、丘腦、基底神經節和小腦中起重要作用，并具有調節血壓與心率、增強腦活力、活化肝腎功能、改善更年期綜合癥等多種功效。鑒于GABA具有眾多良性生理功能，現在GABA已被作為一種新型功能因子廣泛應用于食品、醫藥等行業。在我國食品行業，國家衛生部于2009年9月27日第十二號公告批準GABA為新資源食品，其相關的保健制品也在國內保健品市場上快速成長起來。
[0003]目前工業上制備GABA作為安全級食品添加劑主要通過植物提取和生物合成法獲得。自然界植物中GABA含量少且較難分離，工藝復雜且成本較高，無法大規模生產獲得。生物合成法相對而言是一種安全經濟的方法，在大腸桿菌發酵過程中利用其產生的谷氨酸脫羧酶作用將L-谷氨酸轉化為GABA，再分離純化獲得GABA產品。但使用大腸桿菌制備食品添加劑尚無國家標準認可，存在安全性的問題，因此從自然界植物中富集天然谷氨酸脫羧酶并催化L-谷氨酸制備GABA可解決生產成本過高和食品安全隱患的問題。
[0004]羅漢果作為我國特有植物，因地域優勢為羅漢果各方面研究提供了便利，對其研究主要集中在羅漢果復配及羅漢果甜苷V的提取純化工藝。羅漢果提取的主要方式為果肉破碎、水提、濃縮、離子交換樹脂脫色、打孔熟知吸附分離及氧化鋁層析，最后經濃縮干燥得到產品。在羅漢果產品生產中往往將羅漢果果籽、果莖剔除，使得羅漢果未被充分利用，且增加了廢棄物料的處理成本。

【發明內容】

[0005]本發明提供一種從羅漢果果籽中富集谷氨酸脫羧酶的方法，包括以下步驟:
[0006](I)原料前處理:羅漢果果籽洗凈、破碎；
[0007](2)谷氨酸脫羧酶富集:將破碎后的羅漢果果籽進行浸提，提取溶劑為50-60mM的pH7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，羅漢果果籽與提取溶劑比例為Ikg:(1-6 )L，提取過程中進行攪拌，28-30°C提取12-15h;提取液經離心過濾后得粗酶液。
[0008]在本發明的一種實施方式中，將破碎后的羅漢果果籽進行浸提，提取溶劑為50mM的PH7.5磷酸鹽緩沖液，羅漢果果籽與提取溶劑比例為lkg:5L，提取過程中進行攪拌，30°C提取15h;提取液經臥式螺旋離心機、管式離心機、超濾后得粗酶液。
[0009]在本發明的一種實施方式中，臥式螺旋離心的轉速為2500rpm，管式離心機轉速為12000rpm，超濾中使用超濾膜節流分子量為20_60kDa。
[0010]本發明還提供一種應用上述方法得到的谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸生成GABA的方法:
[0011 ] (I)L-谷氨酸催化:按粗酶液:L-谷氨酸為IL: (1-3)kg的比例，將L-谷氨酸添加到粗酶液中，加入0.02g/L磷酸吡哆醛，37°C催化10h。
[0012](2)脫色、結晶和干燥:采用活性炭脫色，按1:(5-8)的體積比將體積分數為95%的乙醇溶液與脫色液混合，結晶過夜，抽濾，80°C烘干。
[0013]在本發明的一種實施方式中，步驟(I)，粗酶液與L-谷氨酸的用量比例為IL:3kg。
[0014]在本發明的一種實施方式中，步驟(I)，粗酶液與L-谷氨酸的用量比例為IL:1kg。
[0015]在本發明的一種實施方式中，步驟(2)，按1:8的體積比將體積分數為95%的乙醇溶液與脫色液混合。
[0016]本發明對羅漢果提取甜味劑后廢棄物進行研究，將羅漢果廢棄物中的羅漢果果籽提取的谷氨酸脫羧酶用于生物催化生產GABA，大大提高了羅漢果在生產中的使用效率。按照本發明所述的方法所得到的GABA產品經高效液相色譜法檢測，谷氨酸轉化率為99%，GABA收率大于95 %。
【附圖說明】
[0017]圖1不同提取溶劑添加比例對粗酶液中谷氨酸脫羧酶酶活的影響；其中:1-6號分別為羅漢果果籽與提取溶劑比例為1: 1、1: 2、1: 3、1:4、1:5和1:6。
[0018]圖2不同提取溶劑添加比例對GABA得率的影響；其中:1-6號分別為羅漢果果籽與提取溶劑比例為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5和1:6。
[0019]圖3不同磷酸吡哆醛添加量對GABA得率的影響；其中:I號不添加磷酸吡哆醛，2號添加0.02g/L磷酸吡哆醛。
[0020]圖4不同L-谷氨酸添加量對GABA得率的影響，其中:1_4號分別為粗酶液與L-谷氨酸比例為1:1、1:2、1:3和1:4。
[0021 ]圖5不同酒精比例對GABA得率的影響，其中:1_5號分別為酒精與催化液體積比例為1:5、1:6、1:7、1:8和1:9。
【具體實施方式】
[0022]酶活測定方法:取0.5mL粗酶液，加0.2mo 1/L的谷氨酸溶液(pH4.6) 1mL，于37 °C恒溫水浴中，2001'/111；[11下振蕩反應10111；[11后，立即沸水浴1min終止反應，10000r/min離心5min，收集上清液;量取1.0mL上清液于三角瓶中，加入39.0mL蒸餾水，混勻，吸取1.0mL于帶塞試管中，加入ImL質量分數6%的苯酚和0.4mL次氯酸鈉(活性氯質量分數多5.2% )，充分混勻，沸水浴1min后冰水浴20min，再加入3.1mL蒸餾水，然后在630nm處測吸光度;制作γ -氨基丁酸含量與吸光度關系的標準曲線，根據標準曲線和所測吸光度，計算出酶活。酶活力單位定義:在反應液中，每分鐘催化底物生成Iymol γ -氨基丁酸所需的酶量為I個活力單位(U)。
[0023]GABA測定方法:按照國標QB/T 4587-2013進行。
[0024]實施例1
[0025]1.原料前處理:羅漢果果籽洗凈、破碎；
[0026]2.谷氨酸脫羧酶富集:將破碎后的羅漢果果籽進行浸提，提取溶劑為50mM pH7.5磷酸鹽緩沖液，羅漢果果籽與提取溶劑比例分別為1:1(1^:0、1:2(1^:1^)、1:3(1^:1^)、1:4(1^:0、1:5(1^:0和1:6(1^:0，提取過程中進行攪拌，30°(:提取1511。提取液經臥式螺旋離心機、管式離心機、超濾后得粗酶液，其中所述臥式螺旋離心的轉速為2500rpm，管式離心機轉速為12000rpm，超濾中使用超濾膜節流分子量為20_60kDa。
[0027]3.L-谷氨酸催化:按粗酶液:L-谷氨酸為IL: 3kg的比例將L-谷氨酸加到粗酶液中，加入0.02g/L磷酸吡哆醛，37 °C催化I Oh。
[0028]4.脫色、結晶和干燥:采用活性炭脫色，然后按1:8的體積比將體積分數為95%的乙醇溶液與脫色液混合，結晶過夜，抽濾，80°C烘干。
[0029]從圖1結果可以看出，隨著羅漢果果籽與提取溶劑的比例從1:1提高至1:5，粗酶液中谷氨酸脫羧酶酶活從27U/mL提高至40U/mL，而1:6比例提取的粗酶液的酶活比1:5提取的粗酶液低，為39U/mL;從圖2結果可知，隨著羅漢果果籽與提取溶劑的比例從1:1提高至1:5，GABA得率逐漸提高，從80 %提高至98 %，而1:6比例提取的粗酶液用于生產GABA時，GABA得率與1:5比例相當，故選用羅漢果果籽與提取溶劑比例為1: 5。
[0030]實施例2
[0031 ] 1.原料前處理:羅漢果果籽洗凈、破碎；
[0032]2.谷氨酸脫羧酶富集:將破碎后的羅漢果果籽進行浸提，提取溶劑為50mM pH7.5磷酸鹽緩沖液，羅漢果果籽與提取溶劑比例為l:5(kg:L)，提取過程中進行攪拌，30°C提取15h。提取液經臥式螺旋離心機、管式離心機、超濾后得粗酶液，其中所述臥式螺旋離心的轉速為2500rpm，管式離心機轉速為12000rpm，超濾中使用超濾膜節流分子量為20_60kDa。
[0033]3.L-谷氨酸催化:按粗酶液:L-谷氨酸為IL: 3kg的比例將L-谷氨酸加到粗酶液中，分別不添加和添加0.02g/L磷酸吡哆醛，37 °C催化I Oh。
[0034]4.脫色、結晶和干燥:采用活性炭脫色，然后按1:8的體積比將體積分數為95%的乙醇溶液與脫色液混合，結晶過夜，抽濾，80°C烘干。
[0035]結果表明(圖3)，不添加磷酸吡哆醛GABA得率為僅為12%，而添加0.02g//L磷酸吡哆醛GABA得率為98%。故在GABA催化反應中需添加0.02g/L磷酸吡哆醛。
[0036]實施例3
[0037]1.原料前處理:羅漢果果籽洗凈、破碎；
[0038]2.谷氨酸脫羧酶富集:將破碎后的羅漢果果籽進行浸提，提取溶劑為50mM pH7.5磷酸鹽緩沖液，羅漢果果籽與提取溶劑比例為l:5(kg:L)，提取過程中進行攪拌，30°C提取15h。提取液經臥式螺旋離心機、管式離心機、超濾后得粗酶液，其中所述臥式螺旋離心的轉速為2500rpm，管式離心機轉速為12000rpm，超濾中使用超濾膜節流分子量為20_60kDa。
[0039]3.L-谷氨酸催化:分別按1: 1、1:2、1:3、1:4(粗酶液:L-谷氨酸，L: kg)比例加入L-谷氨酸于粗酶液中，添加0.02g/L磷酸吡哆醛，37 °C催化I Oh。
[0040]4.脫色、結晶和干燥:采用活性炭脫色，然后按1:8的體積比將體積分數為95%的乙醇溶液與脫色液混合，結晶過夜，抽濾，80°C烘干。
[0041 ] 結果表明(圖4)，當粗酶液與L-谷氨酸比例從1:1提至1: 3，GABA得率均為98%。而粗酶液與L-谷氨酸比例為1:4時，L-谷氨酸未能完全轉化，GABA得率為87%。故GABA催化反應選用粗酶液與L-谷氨酸比例為1: 3。
[0042]實施例4
[0043]1.原料前處理:羅漢果果籽洗凈、破碎；
[0044]2.谷氨酸脫羧酶富集:將破碎后的羅漢果果籽進行浸提，提取溶劑為50mM pH7.5磷酸鹽緩沖液，羅漢果果籽與提取溶劑比例為l:5(kg:L)，提取過程中進行攪拌，30°C提取15h。提取液經臥式螺旋離心機、管式離心機、超濾后得粗酶液，其中所述臥式螺旋離心的轉速為2500rpm，管式離心機轉速為12000rpm，超濾中使用超濾膜節流分子量為20_60kDa。
[0045]3.L-谷氨酸催化:按1:3 (粗酶液:L-谷氨酸，L: kg)比例加入L-谷氨酸于粗酶液中，加入0.02g/L磷酸吡哆醛，37 °C催化I Oh。
[0046]4.脫色、結晶和干燥:采用活性炭脫色，分別按1:5、1:6、1:7、1:8和1:9的體積比將體積分數為95 %的乙醇溶液與脫色液混合，結晶過夜，抽濾，80 0C烘干。
[0047]結果表明(圖5)，按1:5、1:6、1:7、1:8的體積比將體積分數為95 %的乙醇溶液與脫色液混合后結晶，GABA得率逐漸提高，得率分別為70%、75%、89%和98%。繼續提高體積比為1:9，結晶GABA得率相當，所以選用1:8體積比添加95%的乙醇進行結晶。
[0048]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1.一種獲得谷氨酸脫羧酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)原料前處理:羅漢果果籽洗凈、破碎； (2)谷氨酸脫羧酶富集:將破碎后的羅漢果果籽進行浸提，提取溶劑為50-60mM的pH7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，羅漢果果籽與提取溶劑比例為Ikg:(1-6 )L，提取過程中進行攪拌，28-30°C提取12-15h;提取液經離心過濾后得粗酶液。2.根據權利要求1所述的一種獲得谷氨酸脫羧酶的方法，其特征在于，提取溶劑為50mM的pH7.5磷酸鹽緩沖液。3.根據權利要求1所述的一種獲得谷氨酸脫羧酶的方法，其特征在于，羅漢果果籽與提取溶劑比例為I kg: 5L，提取過程中進行攪拌，30 °C提取15h。4.根據權利要求1所述的一種獲得谷氨酸脫羧酶的方法，其特征在于，提取液經臥式螺旋離心機離心、管式離心機離心、超濾后得粗酶液，臥式螺旋離心機的轉速為2500rpm，管式離心機轉速為12000rpm。5.根據權利要求1所述的一種獲得谷氨酸脫羧酶的方法，其特征在于，提取液過濾時使用超濾膜節流分子量為20-60kDa的超濾膜。6.一種應用谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸生成GABA的方法:其特征在于，包括以下步驟: (1)原料前處理:羅漢果果籽洗凈、破碎； (2)谷氨酸脫羧酶富集:將破碎后的羅漢果果籽進行浸提，提取溶劑為50-60mM的pH7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，羅漢果果籽與提取溶劑比例為Ikg:(1-6 )L，提取過程中進行攪拌，28-30°C提取12-15h;提取液經離心過濾后得粗酶液； (3)L-谷氨酸催化:按粗酶液:L-谷氨酸為lL:(l-3)kg的比例，將L-谷氨酸添加到粗酶液中，加入0.02g/L磷酸吡哆醛，37°C催化1h; (4)脫色、結晶和干燥:采用活性炭脫色，按1:(5-8)的體積比將體積分數為95%的乙醇溶液與脫色液混合，結晶過夜，抽濾，80 0C烘干。7.根據權利要求6所述的方法:其特征在于，步驟(3)，粗酶液與L-谷氨酸的用量比例為1L:3kg08.根據權利要求6所述的方法:其特征在于，步驟(3)，粗酶液與L-谷氨酸的用量比例為1L:1kg09.根據權利要求6所述的方法:其特征在于，步驟(4)，按1:8的體積比將體積分數為95%的乙醇溶液與脫色液混合。
【文檔編號】C12N9/88GK105925557SQ201610415106
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月13日
【發明人】竇文芳, 許偉, 黃華學, 謝雁飛, 黃河
【申請人】無錫布萊尼斯生物科技有限公司, 湖南華誠生物資源股份有限公司