專利名稱：載重組人血管內皮抑制素的peg-plga納米粒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種用高分子材料載藥納米粒及其制備方法。
背景技術：
20世紀70年代，美國哈佛大學Folkman教授就提出實體瘤及其轉移灶生長至1 2mm以上時，可以通過阻斷腫瘤新生血管生成來達到抑制和治療腫瘤的目的。血管內皮抑制 素(endostatin)正是基于此，能特異性抑制內皮細胞的增值及血管生成，使腫瘤處于休眠 狀態，從而抑制腫瘤生長。它能使腫瘤血管內皮細胞的增值與凋亡重新恢復到平衡狀態且 無細胞毒性，抗腫瘤譜廣，不產生耐藥，且治療靶向明確，有很好的臨床應用前景。但由于恩 度(重組人血管內皮抑制素rh-Endo)與NP化療方案聯合給藥時，在治療周期的第1 14 日需要每日給藥，給藥次數比較頻繁，增加患者的痛苦，降低了患者的依從性。因此，研究能 長期緩釋且保持其生物活性的緩釋系統具有重要意義。納米控釋系統由于其可以靜脈注射，延長保留時間的效應(EPR)被動靶向，透過 生物屏障及緩釋等諸多優點，漸漸被用來包裹化療藥物。利用納米緩釋載體制備成緩釋系 統后，不僅能達到延長藥物在體內的作用時間，降低給藥頻率，而且可以維持有效地血藥濃 度，提高治療效果。一般可生物降解的聚合物納米粒載體材料包括天然和合成兩類。PLGA 作為無毒性、可降解的合成高分子材料，具有良好的生物相容性。但由于該納米粒表面具有 一定的疏水性，其納米粒靜注后易被巨噬細胞識別、包圍、吞噬，使該納米粒在血液循環系 統中的循環時間減少，降低療效。目前還沒有一種合成聚合物納米粒載體材料可用于血管 內注射的臨床報道。其最根本原因之一是載體材料與血細胞長期接觸的血液不相容性。日本今井庸二提出，具有血液相容性材料應在0. 1 0. 2um范圍內具有物理或化 學上的不均勻微觀結構。同時很多實驗結果顯示，當聚合物呈現某種特定的相分離結構時， 表現出良好的血液相容性。因此，在一個大分子鏈上同時含有親水和疏水鏈段的兩親(或 兩性)嵌段及接枝共聚物如聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA上接枝聚乙二醇PEG引起了人 們的注意。PEG同樣沒有毒性，無免疫原性，并且可生物降解，其降解產物易于從體內排出而 不蓄積。把PEG接枝在PLGA形成二嵌段共聚物，這類含有不相容鏈段的共聚物具有微觀相 分離的形態。動物實驗結果表明與靜脈PLGA納米粒相比，靜注PEG-PLGA納米粒后，納米 粒中的藥物在血液循環中的滯留時間明顯延長。盡管這樣，當前研究載活性蛋白的還是微 球的較多，有研究載恩度(重組人血管內皮抑制素)緩釋微米球的，如專利CN101536984A， CN101428142A;該類緩釋微球只能皮下或腹腔注射，不能用于靜脈注射。微球的粒徑遠大于 納米粒，靜脈注射易導致栓塞，后果嚴重；并且微球釋放的藥物需要經過組織擴散，透過血 管內皮屏障后方能進入血液循環到腫瘤生長部位，起效藥物量較少，不能很好的發揮藥物 的治療作用。由于恩度(重組人血管內皮抑制素)是剛上市的蛋白類新藥，且蛋白質藥物分 子量較大(22KDa)，難以包裹在納米粒載體中，所以關于載恩度PEG-PLGA納米粒的研究甚 少。專利CN1608675A公開了一種高分子材料載藥納米粒，該種納米粒采用PELGE和PELGA三嵌段共聚物為載體，載體材料分子量大，其涉及包裹的內容主要是基因，涉及小分子多肽 類藥物胸腺五肽，沒有對大分子蛋白類化療藥物進行技術公示；而且制備出納米級的微粒 粒徑分布較寬、載藥量少。

發明內容
本發明的目的在于提供一種載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒及其制 備方法。本發明采取的技術方案為載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA (聚乙二醇-聚乙丙交酯)納米粒，該納米 粒的重量百分比組成為重組人血管內皮抑制素 9. 8%, PEG-PLGA 90. 2% -99% ；該 納米粒粒徑在50 500nm，多分散指數(PDI)為0. 28 1。上述載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒最佳粒徑在100 300nm。本發明用的載體材料PEG_PLGA(購于山東省醫療器械研究所)是用 丙交酯/乙交酯(LA/GA)為50 50分子量為45KDa的聚乙丙交酯(PLGA， Poly(DL-lactide-co-glycolide))和純度為 95 % 的 2KDa 的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)聚合成，PEG含量10%，其有機溶劑為二氯甲烷(DCM)，其有機溶劑殘余量低于 限量的1/10，粒徑在50 500nm。上述載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒的制備方法，包括如下步驟(1)將一定量的PEG-PLGA加到一定體積的二氯甲烷(DCM)有機溶劑中構成有機 相，取適量的恩度水溶液作為水相，將恩度水溶液加入有機相中2000 2800rpm渦旋混合， 其勻化后形成初乳(巧/o)；(2)將形成的初乳加到由一定量的乳化劑和去離子水所構成的乳化劑水溶液中， 高速20000 25000rpm攪拌再次乳化均勻，繼而在室溫條件下攪拌蒸發有機溶劑2 8小 時，使二氯甲烷揮發完全，即得PEG-PLGA納米粒的膠體溶液(Wl/o/V2)，經洗滌干燥得納米 粒。所述的載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒的制備方法，步驟(1)中所述 的PEG-PLGA與恩度的重量比例為9 40 1 ；所述的有機溶劑與恩度水溶液的體積比例 為1 5 20。上述步驟(1)中所述的恩度水溶液濃度為5mg/ml 15mg/ml。上述步驟(2)中所述的初乳與乳化劑水溶液的體積比例為1 4 10。步驟⑵中所述的乳化劑水溶液為0. 0. 5% )的PVA溶液。本發明的有益效果第一、恩度是是大分子蛋白質類藥物，本發明的上述方法可以應用于載化學藥物 或多肽、蛋白藥物的PEG-PLGA納米粒的制備。第二、本發明制備的載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒，表面較光滑圓 滑，無粘連，粒徑小，粒徑在50 500nm，最佳粒徑在100 300nm，粒徑分布窄，不僅可以同 微球一樣肌肉注射，還適合靜脈注射，能更有效得到達腫瘤生長部位；第三、使用PEG-PLGA作為載體材料，包封率高，在50 98 %，使得轉載藥物的能力
增強，載藥量高；
第四、緩釋效果好,W1AvV2的納米粒在體外條件下緩釋時間在1月以上；不同于w/ ο/ο納米粒，PEG親水基團可以有效得避免內皮網狀系統的捕獲，體內循環系統中的滯留時 間明顯延長，能穩定的釋放藥物；第五、制備方法簡單、適宜大規模連續生產。第六、該方法得到的納米粒能緩慢的釋放藥物，更有利于恩度發揮其抗癌藥效。


圖1載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒粒徑分布圖。圖2載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒透射電鏡圖。圖3載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒透射電鏡圖。圖4載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒體外釋放曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明加以進一步的說明。實施例1 精確稱取PEG-PLGA 5mg，加到Iml 二氯甲烷中溶解構成有機相。取50ul的濃度為 10mg/ml的恩度水溶液作為水相。將恩度溶液加入有機相中2800rpm渦旋混合，其勻化后形 成初乳。稱取聚乙烯醇(PVA)加入雙蒸水中使其充分溶解，調節使其濃度為0. 1%，構成外 水相。內水相與外水相的體積比為1 4。將制備的初乳立即加到外水相中，25000rpm高 速剪切60s，將所得乳液倒入IOml 0. 聚乙烯醇溶液中，用磁力攪拌蒸發有機溶劑4 5 小時，使二氯甲烷揮發完全，即得PEG-PLGA納米粒的膠體溶液。平均粒徑為109nm，包封率 為89. 3%，如圖3。實施例2精確稱取PEG-PLGA 10mg，加到Iml 二氯甲烷中溶解構成有機相。取50ul的濃度 為10mg/ml的恩度水溶液作為水相。將恩度溶液加入有機相中2800rpm渦旋混合，其勻化后 形成初乳。稱取聚乙烯醇(PVA)加入雙蒸水中使其充分溶解，調節使其濃度為0. 25%，構成 外水相。內水相與外水相的體積比為1 4。將制備的初乳立即加到外水相中，20000rpm高 速剪切60s，將所得乳液倒入IOml 0. 25%聚乙烯醇溶液中，用磁力攪拌蒸發有機溶劑4 5小時，使二氯甲烷揮發完全，即得PEG-PLGA納米粒的膠體溶液。平均粒徑為198nm，包封 率為94. 9%，如圖2。實施例3精確稱取PEG-PLGA18mg，加到Iml 二氯甲烷中溶解構成有機相。取200ul的濃度 為10mg/ml的恩度水溶液作為水相。將恩度溶液加入有機相中2000rpm渦旋混合，其勻化后 形成初乳。稱取聚乙烯醇(PVA)加入雙蒸水中使其充分溶解，調節使其濃度為0. 25%，構成 外水相。內水相與外水相的體積比為1 4。將制備的初乳立即加到外水相中，20000rpm高 速剪切60s，將所得乳液倒入IOml 0. 25%聚乙烯醇溶液中，用磁力攪拌蒸發有機溶劑4 5小時，使二氯甲烷揮發完全，即得PEG-PLGA納米粒的膠體溶液。平均粒徑為253nm，包封 率為98%。實施例4
參數及性能測試納米粒的粒度用激光粒度儀和透射電鏡測量所得。納米粒中DNA的包封率的測定取載恩度PEG-PLGA納米粒膠體溶液，在40000r/min條件下離心40min，取上清液 lml，用Bradford法，根據標準曲線計算上清液中恩度的濃度，按下式計算包封率包封率(%) = [(X1-X2)AJ X 100%式中X1為未經包封前恩度的總濃度，X2為上清液中恩度的濃度。納米粒體外釋放實驗采用動態滲析法，將定量的納米粒膠體置于透析管內，加釋放介質pH7. 4磷酸鹽 緩沖液封口，置于(37 士 0. 5) °C條件下恒溫攪拌，轉速為70r/min，定時離心測上清液濃度。 棄上清液用緩沖液洗滌3次后并補充相同體積釋放介質。樣品液按Bradford法測樣品液 中恩度濃度，并計算累計降解百分率。實施例1、2、3得到粒徑在50 500nm，表面較光滑圓滑，無粘連的重組人血管內皮 抑制素的PEG-PLGA納米粒，納米粒大小可控，粒徑范圍窄(如附圖1)，便于靜脈注射；PEG 修飾后的載體材料包封藥物效果好，并且其親水性可以發揮避免內皮網狀系統捕獲的長循 環的作用。納米粒緩釋效果好，體外釋放時間長，能達到1個月以上。如附圖4釋放分為前 半部分的突釋期和后半部分的穩定期，釋放量穩定。
權利要求
載重組人血管內皮抑制素的PEG PLGA納米粒，其特征是，該納米粒的重量百分比組成為重組人血管內皮抑制素1％～9.8％，PEG PLGA 90.2％ 99％；該納米粒粒徑在50～500nm，多分散指數為0.28～1。
2.根據權利要求1所述的載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒，其特征是，載 重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒粒徑在100 300nm。
3.載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒的制備方法，其特征是，包括如下步驟(1)將一定量的PEG-PLGA加到一定體積的二氯甲烷有機溶劑中構成有機相，取適量的 恩度水溶液作為水相，將恩度水溶液加入有機相中2000 2800rpm渦旋混合，其勻化后形 成初乳；(2)將形成的初乳加到由一定量的乳化劑和去離子水所構成的乳化劑水溶液中，高速 20000 25000rpm攪拌再次乳化均勻，繼而在室溫條件下攪拌蒸發有機溶劑2 8小時，使 二氯甲烷揮發完全，即得PEG-PLGA納米粒的膠體溶液，經洗滌干燥得納米粒。
4.根據權利要求3所述的載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒的制備方法，其 特征是，步驟(1)中所述的PEG-PLGA與恩度的重量比例為9 40 1 ；所述的有機溶劑與 恩度水溶液的體積比例為1 5 20 ；所述的恩度水溶液濃度為5mg/ml 15mg/ml。
5.根據權利要求3所述的載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒的制備方法，其 特征是，步驟(2)中所述的初乳與乳化劑水溶液的體積比例為1 4 10。
6.根據權利要求3或5所述的載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒的制備方 法，其特征是，步驟(2)中所述的乳化劑水溶液為0. 0.5%的PVA溶液。
全文摘要
本發明公開了一種載重組人血管內皮抑制素的PEG-PLGA納米粒及其制備方法，該納米粒的重量百分比組成為重組人血管內皮抑制素1％～9.8％，PEG-PLGA 90.2％-99％；該納米粒粒徑在50～500nm，多分散指數為0.28～1。本發明得到的納米粒表面較光滑圓滑，無粘連，納米粒大小可控，粒徑小、范圍窄，便于靜脈注射，緩釋效果好；PEG修飾后的載體材料包封藥物效果好，并且其親水性可以發揮避免內皮網狀系統捕獲的長循環的作用。
文檔編號A61K9/14GK101889983SQ20101021193
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者劉崇忠, 張光永, 胡三元, 閆治波, 陳偉杰 申請人:山東大學齊魯醫院