專利名稱：HPPCn抗體、反義核苷酸及其干涉RNA在腫瘤診斷和治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、蛋白質學、腫瘤學領域，具體而言涉及針對HPPCn的單克 隆抗體、反義核苷酸、干涉RNA及其衍生物的制備以及它們在肝癌診斷和治療中的應用。
背景技術：
Hepatopoietin PCn(HPPCn)是吳祖澤等從人胎肝cDNA文庫中克隆的一個肝 再生因子，能夠特異的促進肝細胞增殖和部分肝切除小鼠的肝臟再生[Cui CP等人， Isolation and Functional Identification of a Novel Human Hepatic Growth Factor Hepatopoietin cn，Hepatology, 2008,47 (3) :986_995]，對四氯化碳引起的急性肝損傷和 肝纖維化具有保護作用[Cui CP 等人，Protective role of Hepatopoietin Cn on liver injury induced by CC14/Ethanol in rat, Hepatology Research,2009,39(2) :200_6]。HPPCn是富含亮氨酸酸性核蛋白(LANP)家族成員之一，LANP蛋白是一類多功 能的酸性核蛋白，其成員包括PP32，PP32rl, PP32r2等。以往的研究顯示這些蛋白在 細胞的信號轉導、蛋白質降解、細胞骨架動力學以及細胞的形態發生等過程中參與作用 [Malek SN 等人，Identification and preliminary characterization of two related proliferation-associated nuclear phosphoproteins. J. Biol. Chem 1990 ；265 (22) 13400-13409. Opal P等人，Generation and Characterization of LANP/pp32 Null Mice, Mole Cell Biol ；24 (8) :3140_9]，特別是pp32常被作為一種抑癌蛋白而備受關注。HPPCn作為LANP家族的一個新的成員，其在腫瘤發生發展中的作用還沒有深入的 研究。申請人的研究發現HPPCn在腫瘤細胞，特別是肝癌細胞中的含量明顯高于正常細胞。 且HPPCn本身能夠明顯促進腫瘤細胞的生長和遷移。

發明內容
本發明首次發現H印atopoietin PCn(HPPCn)在腫瘤細胞中的含量遠高于正常細 胞，通過檢測HPPCn蛋白、DNA或RNA的表達可以有效地診斷腫瘤的發生。本發明還發現， HPPCn是腫瘤細胞生長的主要活性因子，通過下調HPPCn的表達或抑制HPPCn的活性，能夠 使腫瘤細胞的生長和遷移受到抑制，而不影響正常細胞的生長和遷移，從而達到抗腫瘤的 目的。本發明公開了 HPPCn單克隆抗體的制備以及HPPCn相關的檢測方法，可以作為制備 腫瘤早期診斷試劑的主要成分和方法。本發明還公開了能夠有效抑制HPPCn在腫瘤細胞中 表達的干涉RNA、反義核苷酸及其衍生物，以及可以抑制HPPCn生物活性的中和抗體，它們 可以作為制備抗腫瘤藥物的活性成分，具有非常廣泛的臨床應用價值。因此，本發明首次提出以HPPCn為標志物的腫瘤檢測和診斷方法和通過抑制 HPPCn表達和活性達到腫瘤治療目的的理論，并公開了能夠特異抑制HPPCn表達的干涉RNA 和反義核苷酸以及能夠抑制HPPCn活性的中和抗體的制備，為人類戰勝惡性腫瘤提供了一 種新的思路。
本發明一方面涉及與HPPCn表達相關的檢測方法，包括利用酶聯免疫吸附、免疫 組化、PCR, Northern Blot, Western Blot等方法檢測HPPCn蛋白，DNA或RNA在腫瘤細胞 或血清中的表達。本發明另一方面涉及能夠下調HPPCn在腫瘤細胞中表達的反義核苷酸、干涉RNA 或攜帶上述序列的載體及其衍生物。本發明再一方面涉及一種藥物組合，其含有本發明所述以HPPCn為靶的反義核苷 酸、干涉RNA或攜帶上述序列的載體藥物及其衍生物，它們可以作為制備抗腫瘤藥物的活 性成分。本發明再一方面涉及HPPCn的中和抗體及其相關的藥物組合，他們能夠抑制 HPPCn的活性，從而抑制腫瘤細胞的生長，可以作為制備抗腫瘤藥物的活性成分。


結合附圖舉例說明本發明，不構成對本發明的限制。圖1為肝癌細胞(52，T)和正常肝細胞(52，N)中的HPPCn基因的Northern印跡 的實驗結果。其中，1 正常L02肝細胞系；2 :HepG2肝癌細胞系；3 原代培養的大鼠肝細 胞；4 :SMMC7721肝癌細胞系；5 :Bel7402肝癌細胞系；6 :HTC肝癌細胞系；7 :293細胞系；8 NIH3T3細胞系；9 =Hela細胞系；10 :HL60細胞系。
具體實施例方式下面的實施例用來進一步說明本發明，但并不意味著對本發明的任何限制。實施例1 肝癌細胞中HPPCn的含量通過Northern Blot實驗和免疫組化實驗檢測肝癌細胞和正常細胞中HPPCn含 量，具體如下UNorthern Blot 用TRIZOL (GIBC0 BR公司)提取肝癌細胞(52，T)和相應的正 常肝細胞(52，N)總RNA各30 μ g，用常規的Northen方法進行實驗用1 %的瓊脂糖凝膠進 行RNA電泳后，將膠轉到尼龍膜上，在80°C烘烤2小時。用預雜交液(配方6XSSC，0.5% SDS，5XDenhardt，100y g/ml變性的蛙精DNA)對尼龍膜在65°C預雜交3小時。用含有32P 標記的 HPPCn cDNA 的雜交液(配方:6XSSC，0. 5% SDS，5XDenhardt，100 μ g/ml 變性的蛙 精DNA)過夜雜交后，在65°C洗脫1小時。使尼龍膜在磷屏中放射自顯影后，掃描結果，并分 析數據。用18s的rRNA作為對照，結果見圖1。實驗結果說明，HPPCn基因在肝癌細胞總RNA中的含量遠高于其在正常肝細胞中 的含量。2.免疫組化法分別取肝癌病人的肝癌組織和癌旁組織，用4%的福爾馬林固定 48h以上，制備石蠟切片。將所得組織切片進行免疫組化染色，具體方法如下(1)脫蠟組織切片在二甲苯中浸泡15分鐘。(2)水化組織切片依次浸入無水乙醇，95%乙醇，80%乙醇中各3分鐘，在蒸餾水 中沖洗。(3)去除內源性過氧化物酶滴加3% H202室溫孵育10分鐘。磷酸鹽緩沖液(PBS) 洗滌。
(4)抗原修復在PBS中微波爐加熱5分鐘，自然冷卻。(5) 一抗孵育用PBS以1 300稀釋的抗HPPCn多克隆抗體(或單克隆抗體)， 37°C孵育1小時。PBS洗3次。(6) 二抗孵育加入用PBS以1 50稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，37°C孵 育30分鐘，PBS洗滌。(7)顯色加入新鮮配制的DAB顯色液，待顯色后自來水沖洗，光鏡下觀察并照相。結果表明肝癌組織樣本的細胞核和細胞漿中HPPCn顯色呈現強陽性，而大部分癌 旁組織樣本中HPPCn顯色呈弱陽性或陰性。對30例肝癌病人癌組織和癌旁組織樣本進行分 析，如表1所示，肝癌組織HPPCn顯色陽性有28例，而癌旁組織HPPCn顯色陽性僅有4例。 故HPPCn在肝癌組織中表達明顯高于癌旁組織或正常組織。表IHPPCn在肝癌組織和癌旁組織中的表達
權利要求
一種用于特異檢測HPPCn表達的單克隆抗體，多克隆抗體或DNA、RNA探針。
2.根據權利要求1所述抗體和探針在制備腫瘤診斷試劑中的應用。
3.一種用于特異抑制HPPCn表達干涉RNA，其特征在于所述的干涉RNA序列如SEQ ID NO :1和 2所示。
4.一種用于特異抑制HPPCn表達反義核苷酸，其特征在于所述的反義核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 和2 所示。
5.一種能夠用于中和HPPCn活性的單克隆抗體。
6.根據權利要求2，3，4所述的干涉RNA，反義核苷酸及單克隆抗體在制備抗腫瘤藥物 中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種HPPCn的單克隆抗體、反義核苷酸、攜帶其干涉序列的載體及其衍生物以及它們在肝癌診斷和治療中的用途。它們可以作為制備抗腫瘤藥物的活性成分，具有非常廣泛的臨床應用價值。
文檔編號A61K48/00GK101957379SQ200910158049
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月17日 優先權日2009年7月17日
發明者吳祖澤, 崔春萍, 常菁, 王立生 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所;北京三有利科技發展有限公司