專利名稱：：一種治療結核桿菌感染的人工合成多肽藥物的制備和應用的制作方法
技術領域：
：-本發明提供一種合成抗菌肽藥物及其制備方法，用于治療包括多耐藥結核桿菌在內的結核桿菌的感染，屬于生物醫學
技術領域：
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背景技術：
：(一)多耐藥結核病現狀結核病是對人類健康威脅最大的傳染性疾病之一。據WHO統計，目前全球約有20億人口感染結核桿菌，每年新發病例達800萬左右，死亡人數約3百萬，占人口死亡率的7%。結核病發病率及死亡率上升的最主要原因之一就是結核桿菌耐藥株的出現和傳播。據報道，全球結核病人中約有36%感染了耐藥菌，這種現象在發展中國家及AIDS病人中尤為重要。此外，全球五大洲35個國家和地區報告的各常用抗結核藥原發耐藥率為異煙肼(7.3%)，鏈霉素(7.3%),利福平(1.8%),乙胺丁醇(1.0%),而獲得性耐藥率還原高于此值。因此，研發一種新型的治療多耐藥結核桿菌感染的藥物有著十分重要的意義。(二)抗菌肽的應用抗菌肽(antimicrobialpeptides)是生物體中經誘導而合成的一種內源性多肽，在機體抵抗病原微生物的入侵方面起著重要的作用，更被認為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽的作用機理與常用的抗生素明顯不同，它主要通過在細胞膜表面形成離子通道來殺死細菌，現在有報道廣泛被研究應用于抗菌、抗結核、抗癌。在目前結核菌的耐藥性明顯增強，而尋找新的抗生素又極為困難的情況下，尋找一種新的抗結核菌多肽藥物具有非常重要意義。(三)兩棲類動物提取中藥研究現狀兩棲類動物在中國屬于傳統中藥和民族藥而廣泛應用，如中華蟾蜍、大蹼鈴蟾、黑斑蛙、沼蛙和澤蛙。這些兩棲類動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，已報道的有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮痛、免疫調節、心血管系統作用。在國外，從兩棲類動物尋求藥理活性單體化合物己是新藥發明的熱點，國外報道，從爪蟾皮膚分泌液獲得的抗菌肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時具有抗腫瘤活性，在美國已獲準作為廣譜抗菌藥物，Magainin制藥公司宣布，他們生產的爪蟾皮膚抗菌肽Magainin類似物MSI-78用于治療糖尿病患者足部潰瘍與ofloxacin有同樣的效果，但產生更小的副作用。國外學者也已報道從東方鈴蟾和花鈴蟾中分離出若干具廣譜抗微生物活性的多肽類物質，如Bombinin和BLP-like多肽。我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質的研究主要集中于生物堿等，有機小分子多肽類物質的研究還較少。天龍屬爬行綱，蜥蝎目，壁虎科，其又名守宮、壁虎等，現代醫藥書籍或雜志上收載品種為無蹼壁虎(GekkoswinhonisGunther)和多痣壁虎(多疣壁虎Gjaponicus)及其它幾種壁虎的干燥全體。壁虎，咸寒有小毒，入心、肝經，具有補肺腎、養精血、止咳平喘、祛風定驚、解毒通絡散結等功效。早在1978年，駱和生等人經實驗證明天龍對結核桿菌有抑制作用，對致病性真菌有抑制作用，此后關于天龍在臨床結核病的應用日漸增多，并顯示出很好的療效。主要用于肺結核、脊柱結核、胸腰椎結核、淋巴結核、頸淋巴結核或腫大以及骨與關節結核(骨癆)等。如焦起周等用回生膏外敷加服復方中藥湯劑治療結核病355例；李守信等用攻瘰丹、化離散加消核膏埋入或外貼治療淋巴結核1239:例，治愈率98.3%總有效率99.9%。于立君等人的專利申請"治療結核病的中藥及其制作方法"(專利號03132605.6)報道了天龍用于治療瘰疬結核，雖然天龍治療結核有效，但是關于天龍抗結核的藥理活性成分未有相關的文獻報道。
發明內容本發明目的在于提供一種抗多耐藥結核桿菌的抗菌多肽及其制備方法和在制藥中的應用。本發明所述抗菌肽用于但不限于結核分枝桿菌的抑制。本發明所述抗菌肽用于但不限于多耐藥結核菌感染的治療。本發明所述天龍抗菌肽全序列結構經蛋白質數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同多肽。使用本發明所述的天龍抗菌肽，對于結核分支桿菌生長有抑制作用。本發明所述的抗菌肽、多耐藥結核病、結核分枝桿菌，是本領域的技術人員所熟知的，現代的醫學書籍中有其準確的定義。通過以下實施例對本發明的天龍抗菌肽的制備和應用進行描述。需說明的是，下述實施例只是用來說明而非限制本發明，本領域技術人員所熟知的其他常用制備方法及其他引起結核病的分支桿菌均在本發明的范圍內。實施例一天龍抗菌肽的制備方法將天龍干藥材粉碎過80目篩，稱取2500g藥粉，用4500ml用蒸餾水混勻泡脹，4度冰箱靜置24hr，低溫高速離心得上清800ml,0.45um膜過濾即得到天龍抗菌肽粗提液，將粗提液過固相萃取柱ODS-SPE(C18，封端)，分別用水和甲醇洗脫，凍干得到水溶部分和醇溶部分，經HPLC色譜分析(0DSC18柱，SHIMADZU150L*4.6),甲醇溶部分經凝膠過濾柱層析，透析脫鹽和反相高壓液相色譜分離純化即得多肽。其中凝膠過濾柱層析為將收集的天龍凍干粉溶于蒸餾水后上樣于SephadexG-50凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長1000mm，直徑26mm，用0.01MNa2HPO4—NaH2PO4pH6.5緩沖液洗脫,收集70分鐘以后的峰。反相高壓液相色譜為:凝膠過濾柱層析得到的活性成分峰上樣于經含0.1%三氟醋酸的超純水平衡的C18反相柱，柱長250mm直徑10mm,用含0.1%三氣醋酸的甲醇從10%到100%的梯度洗脫，收集時間為16.2分鐘處的峰。然后用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。在上述制備所得的天然提取抗菌肽的序列、結構分析的基礎h設計合成，即得到一種合成抗菌肽，肽一級全序列結構為綴氨酸一半胱氨酸一精氨酸一蘇氨酸一甘氨酸一精氨酸一絲氨酸一精氨酸一色氨酸一精氨酸一天冬氨酸一纈氨酸一半胱氨酸一精氨酸一天冬酰胺一苯丙氨酸一甲硫氨酸一組氨酸一色氨酸一天冬酰^~半胱氨酸一絲氨^~精氨酸(NH2-VCRTGRSRWRDVCRNFMHWNCSR-COOH)。天然抗菌肽衍生物的制備過程包括首先設計合成編碼抗菌肽基因，將抗菌肽的編碼基因克隆到載體pPIC9載體中，然后轉化畢氏酵母菌株，甲醇誘導表達蛋白。有關的DNA分離、純化、PCR擴增、質粒轉化宿主菌、片段回收、連接等分子克隆操作均按照J.沙穆克魯克等編著的《分子克隆試驗指南》進行。實施例二抗菌肽對分支桿菌的抑菌作用研究1.培養基7H9瓊脂半流培養基Middlebrook7H9干粉(SIGMAM0178)4.7g,丙三醇4ml，瓊脂粉0.5g,加蒸餾水至900ml,15磅12rC高壓滅菌IO分鐘，冷卻后加入OADC至1000ml,待用。蘇通半流體培養基稱取谷氨酸鈉4.0g，枸櫞酸1g,K2HP0A25g,MgSO"7H200.25g，枸櫞酸鐵銨0.025g,甘油15ml，瓊脂粉0.25g,加入蒸餾水后加熱使其完全溶解，冷卻后以8%NaOH調pH至7.2，用蒸餾水定容至500ml,分裝，121'C高壓滅菌20分鐘，待用。2.藥物對照藥品為異煙肼；測試藥品為天龍抗菌肽。3.菌株結核分枝桿菌標準株O!KC0ibactei^uffl"6ercWos"H"Rv，ATCC27294);金色分枝桿菌沐ayrOT,J7iTi"5J^^;耐異煙肼結核桿菌株；多耐藥結核桿菌株:耐利福平結核桿菌株4.藥效評價標準肉眼觀察各個培養管中分支桿菌的生長，并同麥氏比濁管l號、2號、3號、4號比濁，無分支桿菌生長表示"-"；有分支桿菌生長并同1號比濁管相近表示"+";同2號比濁管相近表示"++"，依次類推,其中+號的多少反映出分支桿菌相對生長的多少。操作步驟將藥液倍比稀釋為3個梯度，分別為20fig/ml，10|xg/ml，5Mg/ml,2.5ng/ml，1.25jig/m。接種菌株取分枝桿菌新鮮分支桿菌，加0.5%TAveen-80生理鹽水磨菌稀釋，與1號麥氏比濁管比濁，制成lmg/ml菌液上述新鮮菌落，稀釋成10—3mg/nil菌液，每管培養基接種0.lml。最終接種量為10、g。37'C溫箱孵育15天觀察結核菌生長實驗為雙管平行操作，每次實驗重復兩次，取平均值，結果如表一表一天龍抗菌肽抑制結核菌生長的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>耐利福平結核桿菌株5.0多耐藥結核桿菌株2.5實施例三女，41歲，2000年時因咳嗽、咳痰，拍片檢査診斷為肺結核，用異煙肼、利復平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇治療后病情無明顯好轉，藥敏試驗為多耐藥難治性結核(耐異煙肼、利復平)，咳嗽、咳痰，痰菌陽性，且肺上有空洞。口服所述抗菌肽20mg，tid，維持3周，空洞閉合，痰菌陰轉，臨床癥狀消失，遂停藥。實施例四男，59歲。2001年時因咳嗽、咳痰、乏力不適，拍片檢査發現患空洞型肺結核，用異煙肼、利福平、乙胺丁醇等抗結核治療，病情無明顯好轉，經常咳嗽、咳痰、盜汗、納差，痰菌3(+)，且藥敏試驗為多耐藥難治性結核，胸片顯示兩肺繼發型肺結核伴空洞。2004年用天龍抗菌肽40mg，tid，治療4周，患者無不適癥狀，痰菌陰轉，空洞閉合，胸片上病灶穩定，遂停藥。序列表<110>王鶴堯<120>—種治療結核桿菌感染的人工合成多肽藥物的制備和應用<歸1<1ValCysArgThr1AspValCysArgCysSerArg<210>1<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAINGlyArgSer5AsnPheMet15ArgTrpArgJOHisTrpAsn20權利要求1.一種合成抗菌肽，其特征在于該抗菌肽是依據天龍中天然分離多肽而衍生合成得到的一種單鏈多肽。2.權利要求1所述多肽全序列結構為纈氨l半胱氨酸一精氨酸一蘇氨酸——甘氨酸一精氨酸^^氨酸一精氨酸一色氨酸一精氨酸一天冬氨酸一纈氨酸一半胱氨酸一精氨^"天冬酰胺一苯丙氨酸一甲硫氨酸一組氨酸一色氨酸一天冬酰胺一半胱氨酸一絲氨酸一精氨酸(NHrVCRTGRSRWRDVCRNFMH麗CSR-COOH)。3.權利要求1所述的合成抗菌肽在治療包括多耐藥結核桿菌在內的結核桿菌感染疾病的藥物中的應用。4.權利要求1所述的合成抗菌肽在制備治療多耐藥結核桿菌包括多耐藥結核桿菌在內的結核桿菌感染疾病的藥物中的應用。全文摘要本發明屬于生物醫學領域，提供一種天龍抗菌肽衍生物制備方法，用于治療結核桿菌的感染。天龍抗菌肽衍生物，為依據中國兩棲類動物天龍中分離得到的天然多肽而合成的一種單鏈多肽，多肽一級全序列結構為纈氨酸—半胱氨酸—精氨酸—蘇氨酸—甘氨酸—精氨酸—絲氨酸—精氨酸—色氨酸—精氨酸—天冬氨酸—纈氨酸—半胱氨酸—精氨酸—天冬酰胺—苯丙氨酸—甲硫氨酸—組氨酸—色氨酸—天冬酰胺—半胱氨酸—絲氨酸—精氨酸(NH₂-VCRTGRSRWRDVCRNFMHWNCSR-COOH)。天龍抗菌肽衍生物藥物可顯著抑制包括多耐藥結核桿菌在內的結核桿菌生長，可應用于治療包括多耐藥結核桿菌在內的結核桿菌感染的藥物。文檔編號A61P31/00GK101293927SQ20071009728公開日2008年10月29日申請日期2007年4月29日優先權日2007年4月29日發明者孔繁翠,王鶴堯,葵邱,鄭文婕,昊顧申請人:王鶴堯;鄭文婕