專利名稱：一種高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法
技術領域：
本發明涉及結核桿菌藥物，具體地說是一種高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法。
背景技術：
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起人類結核病的致病菌。結核病，尤其是肺結核，在歷史上曾經是一種烈性傳染病，由于醫藥科技的發展，結核病一度不再被認為是難治之癥；然而自1985年以來，全球結核病疫情大有卷土重來之勢，結核病的發病率及由此引起的死亡率都在顯著增加；據世界衛生組織(WHO)統計，每年全世界約有八百萬人患肺結核病，其中兩百萬人死于該病，全世界三分之一的人口已被結核分枝桿菌所感染，其中10％感染者可能成為肺結核病的患者。WHO已宣布全球結核病疫情處于緊急狀態，并指出結核病現在已經成為人類傳染病中的第一殺手。造成全球結核病疫情回升的主要原因是具多耐藥性的結核分枝桿菌菌株(MDR-TB)的出現；因此，對于治療結核病的有效新藥的研制迫在眉睫。
目前，開發新的抗生素的戰略是尋找靶標(酶蛋白)→克隆目標基因→證明靶標的重要性(基因敲除)→表達目標酶蛋白→建立酶催化反應方法→建立高通量藥物篩選方法及分析酶蛋白的晶體結構→開發新的抗生素。因此，RmlB，RmlC，RmlD酶是開發抑制結核分枝桿菌生長抗生素的理想靶標。
結核分枝桿菌細胞壁可作為新藥開發的靶標，因為細胞壁是分枝桿菌賴以生存的結構基礎(文獻1Young，D.B.and K.Duncan(1995)，Prospectsfor new interventions in the treatment and prevention of mycobacterial disease，Annual Review of Microbiology 49641-673)。目前國外對分枝桿菌細胞壁的結構及其生物合成已有較深入的研究；其細胞壁核心部分主要由聚阿拉伯糖聚半乳糖、肽聚糖以及分枝菌酸三種成分組成(參見圖1所示)(文獻2McNeil，M.(1996)，Target preclinical drug development for Mycobacteriumavium complexa biochemical approach，InMycobacterium avium-ComplexInfection，pp 263-283，Edited by Korvick，J.A.and C.A.Benson，MarcelDekker，Inc.，New York)；分枝菌酸和聚阿拉伯糖聚半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價連接到肽聚糖大分子上，因此銜接雙糖是一個重要的結構成分(參見圖2所示)；銜接雙糖中的鼠李糖殘基的供體為dTDP-鼠李糖；結核分枝桿菌中有四種酶催化由底物葡萄糖-1-磷酸合成dTDP-鼠李糖的過程(文獻3Ma，Y.，Mills，J.，A.，Belisle，J.T.，et al.(1997)，Determination of the pathway for rhamnose biosynthesis inmycobacteriacloning，sequencing and expression of the Mycobacteriumtuberculosis gene encoding α-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase，Microbiology 143937-945)，并且在分枝桿菌中不存在dTDP-鼠李糖生物合成的補救代謝途徑。
由于人體中不存在鼠李糖分子，鼠李糖可作為研發新一代抗結核藥物的重要靶標。對鼠李糖生物合成催化機理的深入研究將有助于建立篩選合成阻斷劑的方法，以篩選抗結核新藥。

發明內容
本發明的目的是提供一種高度專一性并且無毒副作用高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為在含有25～60mM HEPES、0.2～2mM NADPH、2～10mM Mg2+、0.4～2mMdTDP-Glc、0.05～0.2mg/mlRmlB酶蛋白、0.02～0.08mg/ml RmlC酶蛋白、0.01～0.15mg/ml RmlD酶蛋白的溶液中加入中藥、藏藥、天然產物的有效成分或組合化學產物，20～30℃培育，以水調零，在340nm處測定OD值(每隔10min)，檢測340nm下吸光值的變化根據體系吸光值的變化，確定所加入物質是否是以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物。
此過程是以RmlB、C、D酶蛋白為靶標，以dTDP-葡萄糖為底物，純化的RmlB、C和D酶蛋白與dTDP-葡萄糖進行酶促反應，并在反應體系中加入NADPH；酶促反應發生后，在產物dTDP-鼠李糖生成的同時NADPH被轉化為NADP，導致NADPH在340nm的光吸收值下降。如果某些化合物在反應中阻止產物dTDP-鼠李糖的生成并減少NADP的生成，可以得知這些化合物對酶活性有抑制作用，根據這個酶活性測定方法，根據加入中藥、藏藥及天然產物的有效成分以及組合化學產物后RmlB、C和D酶的活性大小或有無建立了抗結核藥物的模型。
RmlC酶蛋白通過如下方法制得，從結核分枝桿菌基因組文庫中調出rmlC基因，然后利用pET表達系統構建pET16b-Tb rmlC，轉化在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中；菌株經過超聲破碎細胞，離心，取上清液，利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術純化得到RmlC酶蛋白；RmlD酶蛋白是通過如下方法制得，從結核分枝桿菌基因組文庫中調出rmlD基因，然后利用pET表達系統構建pET16b-Tb rmlD，轉化在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中；菌株經過超聲破碎細胞，離心，取沉淀，利用30-100％(較好為66％)濃度乙酸溶出RmlD酶蛋白(形成包涵體)，而后用較低濃度的乙酸對其透析，最后利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術純化得到RmlD酶蛋白，用SDS-PAGE鑒定蛋白純度以及其分子量。
本發明具有如下優點1.本發明建立了結核桿菌細胞壁為靶點的藥物篩選模型。rmlB、C、D是結核桿菌的生長相關基因，其基因所表達的蛋白(酶)是結核桿菌細胞壁形成過程中必需的；本發明從結核分枝桿菌基因組文庫中克隆了rmlC、D基因，其編碼dTDP-4-酮基-6-脫氧-D-葡萄糖3，5表異構酶(RmlC)及dTDP-4-酮基-鼠李糖還原酶(RmlD)，并在大腸桿菌中表達了結核分枝桿菌的RmlC、D酶蛋白，建立了酶催化反應測試方法；RmlB、C、D酶是開發抑制結核分枝桿菌生長抗生素的理想靶標。
2.本發明篩選得到的抗結核新藥將具高度專一性并且無毒副作用。結核分枝桿菌細胞壁可作為新藥開發的靶標，因為細胞壁是分枝桿菌賴以生存的結構基礎，目前國外對分枝桿菌細胞壁的結構及其生物合成已有較深入的研究；其細胞壁核心部分主要由聚阿拉伯糖聚半乳糖、肽聚糖以及分枝菌酸三種成分組成；分枝菌酸和聚阿拉伯糖聚半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價連接到肽聚糖大分子上，因此銜接雙糖是一個重要的結構成分；由于人體中不存在鼠李糖分子，鼠李糖可作為研發新一代抗結核藥物的重要靶標；對鼠李糖生物合成催化機理的深入研究將有助于建立一種篩選合成阻斷劑的方法，以篩選抗結核新藥。所選的靶酶RmlB、C和D酶為人體缺乏的酶，以后研發的抗結核新藥將對人體無害，克服了抗菌藥物也殺害正常細胞的缺點。
3.本發明利用結核桿菌生長過程中所必須的3個酶為藥篩靶標，擴大了藥物篩選的范圍，如某化合物抑制其中任意一個或幾個酶的活性，該化合物即可能是具有抑制結核桿菌生長的物質；因為所選的靶酶為結核分枝桿菌生存所必需的，保證了將來研發的抗結核新藥具有高藥效性。
4.本發明所建立的藥篩模型可于酶標儀上酶標板內進行反應，藥物用量少，速度快，是高通量的藥篩模型。


圖1中A為分枝桿菌中dTDP-鼠李糖(dTDP-Rhamnose)的合成代謝途徑示意圖RmlA，α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉移酶；RmlB，dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫氫酶；RmlC，dTDP-4-酮基-6-脫氧-D-葡萄糖3，5表異構酶；RmlD，dTDP-4-酮基-鼠李糖還原酶；Wbbl，鼠李糖基轉移酶；B為分枝桿菌細胞壁的核心結構示意圖，其中分枝菌酸(Mycolic acid)與聚阿拉伯糖(Arabinan)和聚半乳糖(Galactan)通過L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺銜接雙糖(Linker)共價連接到肽聚糖(Peptidoglycan)上；C為結核分枝桿菌中分別編碼RmlA、B、C和D酶蛋白的rmlA、B、C、D基因在基因組中的位置。
圖2為NADPH減少法檢測分枝桿菌中dTDP-葡萄糖轉變成dTDP-鼠李糖的反應譜圖；在體外模擬分枝桿菌中dTDP-葡萄糖(dTDP-Glc)在RmlB，RmlC，RmlD三種酶的催化下生成dTDP-鼠李糖(dTDP-Rhamnose)的反應過程，伴隨著NADPH的減少，NADP的生成。反應體系中加入dTDP可抑制反應的進行。其中NADPH在340nm下有吸光值，OD340值的下降表明反應的發生。
具體實施例方式
應用現代分子生物學技術從結核分枝桿菌基因組文庫中克隆了rmlB，rmlC，rmlD基因，并在大腸桿菌中表達了結核分枝桿菌的RmlB，RmlC，RmlD酶蛋白，超聲破碎細胞，離心，取上清液(因RmlD酶蛋白形成了包涵體，取沉淀，而后采用變性再復性的方法制備)，利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術純化得到RmlB、RmlC、RmlD酶蛋白。測定得到的酶液中酶的濃度，建立了RmlB、C和D酶反應體系。
實施例1 rmlC基因的克隆應用現代分子生物學技術，設計5’CATATGAAAGCACGCGAACTCG3’、5’CTCGAGGGTGCCGCGCATCTCCCC 3’基因片斷為引物，從結核分枝桿菌基因組文庫中利用PCR擴增rmlC基因，擴增產物連接到pMD18-T載體上，重組質粒轉化Novablue并篩選鑒定，純化rmlC基因片段，測序，rmlC與pET16b連接，連接產物rmlC-pET16b轉化DH5α并鑒定，陽性質粒轉化大腸桿菌BL21。
實施例2 rmlD基因的克隆應用現代分子生物學技術，設計5’CATATGGCGGGCAGGTCAGAAAGGC 3’、5’CTCGAGTCAGTCACGCGTTGAGGGTAACCG 3’基因片斷為引物，從結核分枝桿菌基因組文庫中利用PCR擴增rmlD基因，擴增產物連接到pMD18-T載體上，重組質粒轉化Novablue并篩選鑒定，純化rmlD基因片段，測序，rmlD與pET16b連接，連接產物rmlD-pET16b轉化DH5α并鑒定，陽性質粒轉化大腸桿菌BL21。
實施例3 RmlC酶蛋白的誘導表達與分離純化取少量所得菌株(冷凍保存)pET16b-Tb rmlC in BL21(DE3)于3ml LB液體培養基內搖床培養，25℃，轉速150rpm，過夜，OD值約為0.6～0.7時取出，從中再取少量接入200ml LB液體培養基內，培養至OD值約為0.6～0.7時加入0.1mM IPTG([PTG為異丙基-β-D硫代半乳糖苷)，繼續培養3hr，取出，離心，棄上清，沉淀用1×Binding Buffer(8×＝40mM imidazole，4MNaCl，160mM Tris-HclpH7.9)重懸(加入1mM的PMSF)，超聲破碎細胞，離心，取上清，利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術(在此親和層析用的為Novagen公司的His Bind Kits試劑盒，是一較成熟的純化帶組氨酸標記酶蛋白的方法)純化得到RmlC酶蛋白，用SDS-PAGE鑒定蛋白純度以及其分子量。RmlC酶蛋白分子量為22299.1Kda。
實施例4 RmlD酶蛋白的誘導表達與分離純化取少量所得菌株(冷凍保存)pET16b-Tb rmlD in BL21(DE3)于3ml LB液體培養基內搖床培養，37℃，轉速150rpm，過夜，OD值約為0.6～0.7時取出，從中再取少量接入200ml LB液體培養基內，培養至OD值約為0.6～0.7時加入5mM IPTG，繼續培養10hr，取出，離心，棄上清，沉淀用1×BindingBuffer(8×＝40mM imidazole，4M NaCl，160mM Tris-HclpH7.9)重懸(加入1mM的PMSF)，超聲破碎細胞，離心，取沉淀，利用66％濃度乙酸溶出RmlD酶蛋白(形成包涵體)，而后用較低濃度的乙酸對其透析，最后利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術(在此親和層析用的為Novagen公司的His Bind Kits試劑盒，是一較成熟的純化帶組氨酸標記酶蛋白的方法)純化得到RmlD酶蛋白，用SDS-PAGE鑒定蛋白純度以及其分子量。RmlD酶蛋白分子量為32030.5Kda。
實施例5 一種高通量抗結核桿菌藥物篩選模型—RmlB、C和D酶反應體系的建立一種高通量抗結核桿菌藥物篩選模型的建立方法，如表1，其中HEPES(pH7.6)為50mM，NADPH為1mM，MgCl2為100mM，dTDP為100mM，dTDP-Glc為10mM，RmlB酶蛋白為0.5mg/ml，RmlC酶蛋白為0.5mg/ml，RmlD酶蛋白為0.1mg/ml，總體積為50μl。反應在96孔酶標板上進行，在無振蕩的情況下于室溫下培育，以水調零，每隔10min在340nm處測定OD值，在有dTDP的體系里，OD值無明顯變化，無dTDP的體系里，OD值變化較為明顯(如圖)，加入中藥、藏藥及天然產物的有效成分或組合化學產物后，在無dTDP的體系里，OD值無明顯變化，則表明該化合物具有抑制RmlB、C、D催化dTDP-葡萄糖形成dTDP-鼠李糖的反應，因此此化合物有可能是以結核桿菌細胞壁為靶點的一種藥物。
實施例6 一種高通量抗結核桿菌藥物篩選模型—RmlB、C和D酶反應體系的建立一種高通量抗結核桿菌藥物篩選模型的建立方法，如表1，其中HEPES(pH7.6)為70mM，NADPH為5mM，MgCl2為300mM，dTDP為300mM，dTDP-Glc為30mM，RmlB酶蛋白為1mg/ml，RmlC酶蛋白為1.5mg/ml，RmlD酶蛋白為0.8mg/ml，總體積為50μl。反應在96孔酶標板上進行，在無振蕩的情況下于室溫下培育，以水調零，每隔10mim在340nm處測定OD值，在有dTDP的體系里，OD值無明顯變化，無dTDP的體系里，OD值變化較為明顯(如圖)，如加入中藥、藏藥及天然產物的有效成分或組合化學產物后，在無dTDP的體系里，OD值無明顯變化，則表明該化合物具有抑制RmlB、C、D催化dTDP-葡萄糖形成dTDP-鼠李糖的反應，因此此化合物有可能是以結核桿菌細胞壁為靶點的一種藥物。
實施例7 一種高通量抗結核桿菌藥物篩選模型—RmlB、C和D酶反應體系的建立一種高通量抗結核桿菌藥物篩選模型的建立方法，如表1，其中HEPES(pH7.6)為100mM，NADPH10mM，MgCl2為500mM，dTDP為500mM，dTDP-Glc為50mM，RmlB酶蛋白為2mg/ml，RmlC酶蛋白為2mg/ml，RmlD酶蛋白為1.5mg/ml，總體積為50μl。反應在96孔酶標板上進行，在無振蕩的情況下于室溫下培育，以水調零，每隔10min在340nm處測定OD值，在有dTDP的體系里，OD值無明顯變化，無dTDP的體系里，OD值變化較為明顯(如圖)，如加入中藥、藏藥及天然產物的有效成分或組合化學產物后，在無dTDP的體系里，OD值無明顯變化，則表明該化合物具有抑制RmlB、C、D催化dTDP-葡萄糖形成dTDP-鼠李糖的反應，因此此化合物有可能是以結核桿菌細胞壁為靶點的一種藥物。
表1

權利要求
1.一種高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法，其特征在于在含有25～60mM HEPES、0.2～2mM NADPH、2～10mM Mg2+、0.4～2mM dTDP-Glc、0.05～0.2mg/mlRmlB酶蛋白、0.02～0.08mg/ml RmlC酶蛋白、0.01～0.15mg/mlRmlD酶蛋白的溶液中加入中藥、藏藥、天然產物的有效成分或組合化學產物，20～30℃培育，測定OD值，檢測340nm下吸光值的變化，根據體系吸光值的變化，確定所加入物質是否是以結核桿菌細胞壁為靶點的藥物。
2.按照權利要求1所述高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法，其特征在于所述RmlC、RmlD酶蛋白是通過如下方法制得，將含有rmlC、rmlD基因利用pET表達系統轉化在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，得到的pET16b-Tb rmlC-BL21(DE3)、pET16b-Tb rmlD-BL21(DE3)菌株在IPTG誘導下可表達出RmlC、RmlD酶蛋白。
3.按照權利要求2所述高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法，其特征在于所述的rmlC、rmlD基因是利用基因工程的方法克隆獲得，具體過程如下，從結核分枝桿菌基因組文庫中利用PCR擴增rmlC、rmlD基因，擴增產物連接到pMD18-T載體上，重組質粒轉化Novablue并篩選鑒定，純化基因片段，測序，rmlC、rmlD與pET16b連接，連接產物轉化DH5α并鑒定，陽性質粒轉化大腸桿菌BL21。
4.按照權利要求3所述高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法，其特征在于所述的rmlC引物為基因片斷為5’CATATGAAAGCACGCGAACTCG3’、5’CTCGAGGGTGCCGCGCATCTCCCC3’；rmlD引物為基因片斷為5’CATATGGCGGGCAGGTCAGAAAGGC3’、5’CTCGAGTCAGTCACGCGTTGAGGGTAACCG 3’。
5.按照權利要求2所述高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法，其特征在于所述的RmlC酶在大腸桿菌中誘導表達的條件是25～37℃，用IPTG0.1～2mM誘導表達2～6小時，超聲破碎細胞，離心，取上清液，利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術純化得到RmlC酶蛋白。
6.按照權利要求2所述高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法，其特征在于所述的RmlD酶在大腸桿菌中誘導表達的條件是25～37℃，用IPTG0.1～2mM誘導表達2～10小時，超聲破碎細胞，離心，取沉淀，利用30-100％濃度乙酸溶出RmlD酶蛋白，而后用較低濃度的乙酸對其透析，最后利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni+親和層析技術純化得到RmlD酶蛋白。
全文摘要
本發明是一種高通量抗結核桿菌藥物的篩選方法，在含有25～60mMHEPES、0.2～2mM NADPH、2～10mM Mg
文檔編號C12Q1/04GK1580276SQ0313361
公開日2005年2月16日 申請日期2003年7月30日 優先權日2003年7月30日
發明者杜昱光, 馬郁芳, 陸海峰, 李曙光, 趙小明, 白雪芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所