專利名稱：：鏈球菌莢膜糖的偶聯的制作方法
技術領域：
：本發明涉及將細菌莢膜糖與運載體偶聯而形成糖偶聯物(glycoconjugate)的領域。糖偶聯物可用于免疫接種。
背景技術：
：用細菌莢膜糖疫苗抵御有莢膜細菌已有多年。然而，由于糖是不依賴T細胞的抗原，它們的免疫原性不佳。與運載體偶聯(conjugation)能將不依賴T的抗原轉變成依賴T的抗原，從而增強記憶應答并產生保護性免疫力。因此，最有效的糖疫苗以糖偶聯物為基礎，原型偶聯疫苗能抵御乙型流感嗜血桿菌(//^附0//7//1/"/7we"zae)("Hib")[例如，見參考文獻78的第14章]。報道己有偶聯疫苗的另一種細菌是無乳鏈球菌(&w;^ococcwaga/acn'ae)，也稱為"B群鏈球菌"，或簡稱為"GBS"。DennisKasper及同事從事了該疫苗的大部分工作，見例如參考文獻l-9。GBS糖轉化的Kasper方法通常包括還原胺化純化的糖與運載體蛋白，例如破傷風類毒素(TT)或CRM197[2]。還原胺化涉及運載體中氨基酸側鏈上的胺基與糖中的醛基。如圖1所示，由于天然形式的GBS莢膜糖不包含醛基，則應在用過碘酸鹽氧化糖的唾液酸殘基以產生醛基再偶聯[2，10]。雖然以此方式制備的GBS各血清型(Ia、Ib、II、III和V)的偶聯疫苗已顯示在人體內安全且有免疫原性[ll]，但仍需要其它和更好的方法來制備GBS莢膜糖偶聯物。
發明內容本發明依據三種偶聯方法，采用這些方法可替代現有技術公開的直接還原胺化，所有這些方法的目的在于(a)與現有技術相比，能使保留的唾液酸殘基形式更接近天然多糖所見的形式，和(b)可在偶聯反應中用接頭來提高與運載體的偶聯。■在第一種方法中，采用還原胺化已氧化的唾液酸殘基側鏈，但先胺化醛基，再將該胺通過接頭與運載體偶聯。該方法描述于圖2的"途徑A"中。■在第二種方法中，唾液酸殘基和/或N-乙酰基-葡糖胺殘基脫-N-乙酰化得到胺基，將該胺基通過接頭與運載體偶聯。該方法描述于圖2的"途徑B"中。■第三種方法是通過莢膜糖的半乳糖殘基而不是唾液酸殘基進行連接。該方法可避免破壞唾液酸殘基所形成的關鍵表位。因此，在第一方面，本發明提供制備無乳鏈球菌莢膜糖與運載體分子的偶聯物的方法，包括以下步驟(a)氧化無乳鏈球菌莢膜糖以在該糖的至少一個末端唾液酸殘基中引入醛基；(b)用氨或伯胺還原胺化該醛基得到-CH2-連接的胺；(c)使該-CH2-連接的胺與雙功能接頭反應得到活化的糖；和(d)使該活化的糖與運載體分子反應，從而得到偶聯物。本發明也提供無乳鏈球菌莢膜糖部分通過接頭部分與運載體相連的偶聯物，其中所述接頭部分與莢膜糖部分中的唾液酸殘基相連。在第二方面，本發明提供制備無乳鏈球菌莢膜糖和運載體分子的偶聯物的方法，包括以下步驟(a)使莢膜糖脫-N-乙酰化得到脫-N-乙酰化的莢膜糖；(b)使該脫-N-乙酰化的莢膜糖與雙功能接頭反應得到活化的糖；(C)使該活化的糖與運載體分子反應，從而得到偶聯物。該方法可在步驟(a)和(b)之間包括使糖部分再-N-乙酰化的步驟。在第三方面，本發明提供制備莢膜糖和運載體分子的偶聯物的方法，包括以下步驟(a)氧化莢膜糖在該糖的至少一個半乳糖殘基中引入醛基，得到修飾的半乳糖殘基；和(b)將該修飾的半乳糖殘基與運載體分子偶聯。步驟(b)的偶聯可以直接進行，或經接頭分子進行。本發明也提供莢膜糖部分通過接頭部分與運載體相連的偶聯物，其中所述接頭部分與該莢膜糖部分中的半乳糖殘基相連。氧化半乳糖殘基特別可用于偶聯無乳鏈球菌莢膜糖，但也適用于具有含半乳糖的莢膜糖的其它細菌，例如腦膜炎奈瑟球菌(W"wen'flmem'"g/"^s)(血清群W135)、霍亂弧菌(F/6Woc/zo/erae)(包括0139)、月市炎克雷伯菌(A7e6j7'e〃cr/weMmom'ae)(包括K21)、大腸桿菌(五sc/2e〃'c/z/flco//)(包括K52)、肺炎鏈球菌OS"印tococcw，e謂o"^)(包括18C型)等。該方法也可用于含半乳糖的脂多糖和脂寡糖。當半乳糖是糖的末端殘基時，該方法特別有用。黃纖本發明以無乳鏈球菌的莢膜糖為基礎。所述莢膜多糖與GBS的肽聚糖骨架共價相連，其不同于B群抗原，B群抗原是與肽聚糖骨架相連的另一種糖。GBS的各莢膜多糖在化學上相關，但抗原性極為不同。所有GBS莢膜多糖共有以下三糖核心卩-D-Glc/NAc(l—3)l3-D-Ga1/7(1—4)卩-D-Glc;。各種GBS血清型的區別在于該核心的修飾。例如，該核心中是用GlcNAc(Ia)還是用Gal(m)來連接連續的三糖核心造成血清型Ia和ni之間的差異(圖4)。血清型Ia和Ib均具有與核心中GlcNAc相連的[a-D-Neu/NAc(2—3)p-D-Gal(l—)二糖，但連接鍵是1—4(Ia)或1—3(Ib)。GBS-相關疾病主要由血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII導致，其中超過90%的疾病由五種血清型Ia、Ib、II、III和V導致。本發明宜利用這五種血清型之一的糖。如圖3所示，這五種血清型各自的莢膜糖包含(a)末端N-乙酰基-神經氨酸(NeuNAc)殘基(通常稱為唾液酸)，在所有五種莢膜糖中該殘基均是2—3連接于半乳糖殘基；和(b)三糖核心內的N-乙酰基-葡糖胺殘基(GlcNAc)。所有五種糖在三糖核心中包含半乳糖殘基，但血清型Ia、Ib、II和III在各自的重復單元中也包含其它半乳糖殘基，血清型II糖中每個重復單元含有3個半乳糖殘基。在本發明的第三方面，參與偶聯反應的半乳糖殘基可以是三糖核心中的殘基或三糖核心外的殘基。當一個糖分子與多個運載體分子相連時，連接鍵最好涉及各種相連重復單元中相同位置的半乳糖，但在不同重復單元中也可能與不同位置的半乳糖相連。本發明所用的糖可以是其天然形式，或者可經修飾。例如，糖可以短于天然莢膜糖，或者可以化學修飾。因此，本發明所用的糖可以是自然界中發現的基本上全長的莢膜多糖，或者可以短于該天然長度。可以解聚全長多糖從而得到本發明所用的較短片段，例如通過溫和的酸水解，加熱，分子大小排阻層析等。據報道，鏈的長度可影響GBS糖在家兔體內的免疫原性[4]。已有報道說可用內切-(3-半乳糖苷酶解聚血清型III莢膜糖[參考文獻1和4-6〗，包括用解聚的物質與破傷風類毒素運載體形成偶聯物。也用臭氧分解GBS血清型II、III和VIII的莢膜糖來解聚[12]。優選用分子量〉30kDa的糖，可以使用基本上全長的莢膜糖。對于血清型Ia，優選用分子量高達約145kDa的多糖。對于血清型Ib，優選用分子量高達約50kDa的多糖。對于血清型ni，優選用分子量高達約50kDa的多糖。可根據葡聚糖標準品(例如購自PolymerStandardService的那些)，用凝膠過濾測定這些糖的分子分子量[13]。與自然界發現的莢膜糖相比，可化學修飾所述糖。例如，糖可以脫-O-乙酰化(部分或全部)、脫-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酸化(部分或全部)等。可以在偶聯之前、期間或之后進行脫-乙酰化，但優選在偶聯前進行。根據具體的糖，脫-乙酰化可以影響或不影響免疫原性，例如NeisVac-CTM疫苗用脫-0-乙酰化的糖，而MenjugateTM是乙酰化的，但二者均有效。參考文獻14討論了各種血清型的GBS糖上O-乙酰化的相關性，優選能在偶聯之前、期間或之后保留7、8和/或9位唾液酸殘基的O-乙酰化，例如通過保護/脫保護，再乙酰化等。可用常規試驗評估脫-乙酰化等的作用。如本文參考文獻所述，可通過已知技術純化莢膜糖。常規方法包括堿提取、離心、過濾、RNA酶/DNA酶處理、蛋白酶處理、濃縮、分子大小排阻層析、超濾、陰離子交換層析和進一步超濾。也可用酶變溶菌素處理GBS細胞，該酶切割細菌細胞壁以釋放細胞壁組分。或者，可用參考文獻15所述的純化方法。該方法包括堿提取、乙醇/CaCl2處理、CTAB沉淀和再溶解。然而，本發明不限于從天然來源純化的糖，可以通過其它方法，例如全合成或部分合成獲得這些糖。運載沐本發明包括利用通常是蛋白質的運載體分子。共價偶聯糖與運載體通常能增強糖的免疫原性，因為將糖從不依賴T的抗原轉化為依賴T的抗原，從而能引發免疫記憶。偶聯對兒科疫苗特別有用[例如，參考文獻16]并且是熟知的技術[例如，參考文獻17-25的綜述]。優選的運載體蛋白是細菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風類毒素。特別優選白喉毒素的CRM197突變體[26-28]，因為它是一種白喉類毒素。其它合適的運載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌(A^.mem'"g衍i)外膜蛋白[29]、合成肽[30，31]、熱激蛋白[32，33]、百日咳蛋白[34，35]、細胞因子[36]、淋巴因子[36]、激素[36]、生長因子[36]、人血清白蛋白(優選重組體)、含各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細胞表位的人工蛋白[37](例如N19[38])、流感嗜血桿菌的D蛋白[39，40]、肺炎球菌表面蛋白PspA[41]、肺炎球菌溶菌素[42]、離子攝取蛋白[43]、艱難梭菌(CJ驕"7e)的毒素A或B[44]、GBS蛋白(參見下文；特別是GBS67)[195]等。優選通過-NH2基團(例如運載體蛋白的賴氨酸殘基或精氨酸殘基側鏈中的氨基)與運載體連接。當糖具有游離醛基時，其能通過還原胺化與運載體的胺基反應形成偶聯物。本發明的第三方面以還原胺化為基礎，涉及糖中已氧化的半乳糖(從中可形成醛)和運載體或接頭中的胺基。也可以通過-SH(例如半胱氨酸側鏈中的巰基)連接。可利用多種運載體蛋白來，例如降低運載體抑制的風險。因此，不同GBS血清型可用不同運載體蛋白，例如血清型Ia糖可與CRM197偶聯，而血清型Ib糖可與破傷風類毒素偶聯。具體的糖抗原也可用多種運載體蛋白，例如血清型III糖可以分成兩組，其中一些與CRM197偶聯，其它與破傷風類毒素偶聯。然而，所有糖通常優選利用相同的運載體蛋白。一種運載體蛋白可攜帶多種糖抗原[45，46]。例如，一種運載體蛋白可與血清型Ia和Ib的糖偶聯。為實現此目標，可先混合不同的糖再進行偶聯反應。然而，一般優選各血清型有不同偶聯物，先偶聯再混合不同的糖。不同偶聯物的運載體可相同。優選糖蛋白質之比(w/w)在1:5(即，過量的蛋白)和5:l(即，過量的糖)之間的偶聯物。優選1:2和5:1之間的比例，例如1:1.25和1:2.5之間的比例。也優選l:l和4:l之間的比例。糖鏈較長，則糖的重量通常過量。如實施例所示，不難實現1:1和4:1之間的重量比，特別是1:1和3:l(之間)的重量比。總體上，本發明提供的偶聯物包含的無乳鏈球菌莢膜糖部分與運載體相連，其中糖運組合物可包含少量游離運載體[47]。當本發明組合物中給定的運載體蛋白同時存在游離和偶聯形式時，未偶聯形式優選不超過組合物中所有運載體蛋白總量的5%，更優選低于2%(以重量計)。偶聯后，可以分離游離和偶聯的糖。合適的方法有許多，包括疏水層析、正切超濾、滲濾等。[也見參考文獻48和49等]。當本發明組合物包含解聚的寡糖時，優選先解聚再偶聯。本發明第一方面包括氧化唾液酸形成醛，第三方面包括氧化半乳糖形成醛。然后可將醛用于，例如還原胺化的反應。可通過化學或酶方法氧化羥基得到醛基。這些反應通常在水性條件下進行。本領域已知氧化GBS糖中的唾液酸來引入醛基的方法[例如，參考文獻50]。在唾液酸中產生醛基的常規反應包括用過碘酸鹽，特別是偏過碘酸鹽(例如，偏過碘酸鈉或鉀，如Nal04)氧化鄰位羥基[10]。至少血清群I1[3，50]、III[2]和V[50]的過碘酸鹽氧化已有報道。可用其它氧化條件，例如用四氧化鋨等。在本發明的第三方面，被氧化的-OH優選是與C-6相連的伯-OH(即，不是仲或端基異構-OH基團)。因此，優選將半乳糖轉變成半乳己二醛糖(galactohexodialose)。這可用任何合適來源(例如，鏈孢菌CPzwan'"w)真菌或樹狀指孢霉(Dac(y"wmAm^oW^))的半乳糖氧化酶方便地實現。可利用重組形式的酶，或從其天然來源純化。半乳糖氧化酶的EC編號1丄3.9，也稱為D-半乳糖氧6-氧化還原酶。該酶用銅離子輔因子，而氰化物、二乙基二硫代氨基甲酸酯、疊氮化物和羥胺可抑制它，因此，氧化前最好避免使用這些試劑。樹狀指孢霉的最佳pH約為中性，因此這是氧化的優選pH。該酶反應的產物是11202(還原的氧)，可以控制該產物的濃度，例如，如果其存在破壞了糖。因此，對于唾液酸和半乳糖，優選的氧化反應涉及單糖中的末端碳原子，即按照標準命名編號最高的碳。可采用各種反應條件控制糖鏈中要轉變為醛基的單糖亞單位比例。例如，參考文獻50報道通過氣相色譜-質譜分析檢測到受控過碘酸鹽氧化血清型IIGBS多糖修飾的唾液酸殘基為7%，而在血清型VGBS多糖中觀察到更高百分比。參考文獻2報道血清型111轉變了25%。可初步研究反應條件(例如，時間、溫度、濃度等)以找到獲得任何所需結果的最佳條件。總之，通常在糖的5%和50%之間(例如，10-40%，優選15%-30%之間；或5%-20%之間)的所有唾液酸或半乳糖單糖單元中引入醛基。更高的百分比造成糖難以控制，而且免疫原性也不會有任何相應提高。還縦眾在本發明的第一方面，采用還原胺化新醛基得到與接頭相連的基團。在本發明的第三方面，也可在產生醛基后用還原胺化來連接接頭或直接連接運載體。還原胺化是有機化學的標準技術，已廣泛應用于生產疫苗用的莢膜糖偶聯物。在第一方面，還原胺化涉及(利用)氨基或伯胺(NH2R)。聯用銨鹽(例如，氯化銨)和合適的還原劑(例如，氰基硼氫化物，例如氰基硼氫化鈉NaBH3CN;硼烷-吡啶；三乙酰氧基硼氫化鈉；硼氫化物交換樹脂；等等)不難實現還原胺化。還原胺化的結果是唾液酸中的C-8攜帶-NHR而不是K)。然后可利用該基團與偶聯用的雙功能接頭相連。在第三方面，氧化的半乳糖在C-6上有一個醛基。該基團以上述相同方式(即，涉及氨基或伯胺)通過還原胺化與雙功能接頭偶聯。或者，可不用接頭而是利用運載體上的胺基，采用還原胺化直接連接該醛基與運載體。還原胺化通常在極性質子溶劑，例如水或醇中進行。及勸激麥義本發明的第一和第二方面(及任選的第三方面)包括利用雙功能接頭。雙功能接頭可提供與修飾的莢膜糖中胺基偶聯的第一基團以及與運載體偶聯的第二基團(通常與運載體中的胺基偶聯)。因此，雙功能接頭中的第一基團能與修飾的唾液酸(或半乳糖)殘基上的胺基(-NHR)反應。該反應通常包括親電取代該胺基中的氫。雙功能接頭中的第二基團能與運載體上的胺基反應。該反應通常也包括親電取代該胺基中的氫。本發明可用異雙功能接頭和同雙功能接頭。當與糖和運載體二者的反應涉及胺時，優選用式X-L-X所示的雙功能接頭，其中兩個X基團彼此相同，可與所述胺反應；L是接頭中的連接部分。優選的X基團是N-氧基琥珀酰亞胺(N-oxysuccinimide)。L優選式-lJ-lAL、所示，其中L'是羰基。優選的I基團是1-10個碳原子的直鏈烷基(例如，d、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C1Q)，例如-(012)4-。因此，優選的接頭是己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯(SIDEA):其它X基團是能與HO-L-OH結合形成酯的那些基團，例如正硼烷、對硝基苯甲酸和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。本發明所用能與胺反應的其它雙功能接頭包括丙烯酰鹵(例如，丙烯酰氯)[54]、鹵酰基鹵(haloacylhalide)[55]、戊二酸二琥珀酰亞胺酯(disuccinimidylglutarate)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(disuccinimidylsuberate)、乙二醇二[琥珀酸琥珀酰亞胺酯]等。通常加入過量的接頭(以摩爾計)來修飾糖。接頭/糖反應通常在質子惰性溶劑(例如，DMSO、乙酸乙醇酯等)中進行，因為這種接頭通常不溶于水。然而，當使用水溶性接頭時，可用的溶劑范圍更廣，包括質子溶劑，例如水。合適的溶劑包括磺化形式，例如磺化SIDEA:應-tv-z:廣眾界界;v-z;糜眾如三糖核心中的葡糖胺殘基一樣，GBS莢膜糖中的唾液酸殘基被N-乙酰化。雖然本發明第一方面通過醛基中間體在唾液酸的C-8引入了胺基，本發明第二方面利用唾液酸和/或N-乙酰基-葡糖胺殘基脫-N-乙酰化產生的胺基。以此方法產生胺的反應方案通常與本發明第一方面所述的一樣。用堿處理糖不難實現GBS糖的脫-N-乙酰化。由于可采用包括堿提取的方法純化GBS糖[51]，則脫-N-乙酰化可以是純化期間的副反應。由于N-乙酰化可能是GBS糖重要表位的一部分，不希望完全脫-N-乙酰化，但該過程難以控制。因此，如果脫-N-乙酰化的程度大于所希望的，本發明可包括受控再-N-乙酰化的步驟。可用例如5。/。碳酸氫銨配制的乙酸酐(CH3CO)20試劑方便地再-N-乙酰化[52]。然而，本發明人發現如果進行得足夠快并且糖的保存時期不長的話，用堿從細菌中提取糖能得到脫-N-乙酰化低于25%的糖，而無需再-N-乙酰化。脫-N-乙酰化和任選的再-N-乙酰化得到的糖中至少有1個唾液酸殘基或葡糖胺脫-n-乙酰化。GBS糖中通常至少有60Q/q，例如>70%、>75%、>80%、>85%、〉90。/。等的唾液酸和葡糖胺殘基是N-乙酰化的。其余脫-N-乙酰化的基團(即，-NH2基團)可通過與本發明第一方面所述相同的方法進行偶聯，除了最終偶聯物中的-NH-源自初始的糖而不是在偶聯反應期間加入的。可在水性條件下進行這些脫-乙酰化和再-乙酰化反應。在還原胺化醛基的本發明第一和第三方面的實施方式中，優選先將糖基本上完全再-N-乙酰化，然后還原胺化(優選在第三方面的氧化半乳糖之前)，從而能避免唾液酸上存在游離胺基，否則會讓其它基團連接胺化的醛基。微欽在合適的反應條件下混合修飾的GBS糖與運載體來制備本發明偶聯物。如圖5所示，總體上可制備兩種類型的偶聯物(a)—種糖與一種運載體相連(例如通過其還原性末端)的偶聯物；和(b)—種糖與多種運載體相連的偶聯物，例如由于幾種單糖亞單位均具有反應性。在兩種情況中，一個運載體蛋白可與多個糖分子相連，因為運載體具有多個暴露的賴氨酸側鏈。(b)型偶聯物在本發明中更常見，因為本發明的修飾的唾液酸或半乳糖殘基出現在一個糖(分子)的多個位點[50]。因此，在本發明優選的偶聯物中，一個糖分子平均與多個運載體分子偶聯。在本發明的第一種和第三種方法中，當利用氧化的糖偶聯時，與糖相連的運載體分子數目取決于所存在的游離醛基數目。如上所述，優選氧化糖中5-50%的唾液酸(第一種方法)或半乳糖(第三種方法)殘基。在本發明的第一和第二方面(及任選的第三方面)，偶聯物包含接頭部分。該接頭部分既不源自糖也不源自運載體，而是在偶聯物制備期間所用的第三種分子，不難與最終偶聯產物中的糖和運載體蛋白相區別。接頭部分包含例如碳、氫、氧和/或氮的原子。優選含有碳和氫的接頭，也優選還含有氧和/或氮的接頭。包含氮原子的接頭可以包含與氮原子鍵合的碳原子，該氮原子進而可以與第二個碳原子鍵合(-C-N-C-)。包含氧原子的接頭優選該氧原子是羰基的一部分。優選分子量在30-500Da之間的接頭部分。優選含有兩個羰基的接頭。特別優選的接頭部分是-NH-C(0)-(CH2VC(0)-，其中n是l、2、3、4、5、6、7、8、9或10。n值優選4。該接頭的末端-NH-優選與糖部分的碳原子相連。末端-C(O)-優選與運載體中氨基酸側鏈的氮原子相連。通過以下方法不難引入優選的接頭部分，包括還原胺化已氧化的唾液酸中的醛基；得到的-NH2基團與雙功能接頭(二元酸，例如己二酸，HOOC-(CH2)4-COOH的二酯，例如二琥珀酰亞胺酯)反應；和還原胺化該產物(參見圖6[53])。其它可用于連接接頭與糖中已引入的末端-NH2(例如本發明第一方面)或作為脫-N-乙酰化單糖殘基一部分(例如本發明第二方面)的末端-NH2的化學方法包括-丙烯酰化(例如與丙烯酰氯反應)，然后與氨基酸側鏈的s-NH2或半胱氨酸側鏈的-SH進行邁克爾型加成反應。如圖8所示，得到的接頭是->^-(:(0)-(012)2-(丙酰胺基)，或者如果己有的-NH2參與反應，得到-C(0)-(CH2)2-。-與鹵酰基鹵反應，然后與與氨基酸側鏈的s-NH2或半胱氨酸側鏈的-SH反應。根據是已有的還是加入的-NH2參與反應，接頭是-:^^-(:(0)-(:1"12-(如圖9所示)或-C(0)-CH2-。另一優選的接頭部分是-C(0)-(CH2)n-C(0)-，其中n是l、2、3、4、5、6、7、8、9或10。n值優選4。該接頭一端的-C(O)-優選與糖部分的氮原子相連，另一端-C(O)-優選與運載體中氨基酸側鏈的氮原子相連。通過以下方法不難引入優選的接頭部分，包括脫-N-乙酰化單糖亞單元中的-NH2基團與雙功能接頭(二元酸，例如，己二酸，HOOC-(CH2)4-COOH的二酯，例如，二琥珀酰亞胺酯)反應；和還原胺化該產物(圖7)。其它選擇包括通過糖的羥基偶聯。可先活化(例如，通過CNBr或CDAP)羥基，再偶聯。錄微與將貧層資合除了提供上述各偶聯物，本發明還提供包含本發明偶聯物和一種或多種其它抗原的組合物。其它抗原包括本發明其它偶聯物，因此，本發明提供的組合物含有多種本發明偶聯物。所述其它抗原可以是通過除本發明那些方法以外的方法制備的GBS糖偶聯物，因此本發明提供的組合物包含第一種GBS糖偶聯物和第二種GBS糖偶聯物，其中所述第一種偶聯物是本發明偶聯物，所述第二種偶聯物不是本發明偶聯物。不同的GBS偶聯物可包括同一GBS血清型的不同類型偶聯物和/或不同GBS血清型的偶聯物。例如，本發明提供的組合物包含血清型Ia、Ib和III中的兩種或三種偶聯物。可通過先制備不同偶聯物(例如，各血清型的不同偶聯物)，再混合這些偶聯物來產生組合物。如下所述，其它抗原可包含GBS的氨基酸序列。其它抗原可包括非GBS病原體的抗原。因此，本發明組合物還可包含一種或多種非-GBS抗原，包括其它細菌、病毒或寄生蟲抗原。這些抗原可選自以下抗原-腦膜炎奈瑟球菌(Mmem'"g"^fo)血清群B的蛋白質抗原，例如參考文獻56-62所述的那些，其中特別優選蛋白質287'(見下文)和衍生物(例如，G287，)。-腦膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜囊泡制品(OMV)，例如參考文獻63、64、65、66等公開的。-腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如參考文獻67公開的血清群C的寡糖或參考文獻68的寡糖。-肺炎鏈球菌(S^epfococcz^/7"ewwom'fle)的糖抗原[例如，參考文獻69-71;參考文獻78的第22和23章]。-甲肝病毒抗原，如滅活病毒[例如，72、73;參考文獻78的第15章]。-乙肝病毒抗原，例如表面和/或核心抗原[例如，73、74;參考文獻78的第16章]。-丙肝病毒抗原[例如，75]。-百日咳博德特菌(SoW^〃aperto^)抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3聯用[例如，參考文獻76和77;參考文獻78的第21章]。-白喉抗原，如白喉類毒素[例如，參考文獻78的第13章]。-破傷風抗原，如破傷風類毒素[例如，參考文獻78的第27章]。-B型流感嗜血桿菌(Wflemop/n7^/^/7we"zaeB)的糖抗原[例如，參考文獻78的第14章]。-淋病奈瑟菌(A^o"o"/zoeae)的抗原[例如，56、57、58]。-肺炎衣原體(Oz/amy^a/"ewmom'ae)的抗原[例如，79、80、81、82、83、84、85]。-砂眼衣原體(C/z/aw;^/afrac/zomfl"力的抗原[例如，86]。-牙齦卟啉單胞菌(尸0^)/2>^0附0加5<^^/^7//15)的抗原[例如，87]。-脊髓灰質炎抗原[例如，88、89;參考文獻78的第24章]，如IPV。-狂犬病抗原[例如，90]，如凍干的滅活病毒[例如，91，RabAvert]。-麻疹、流行性腮腺炎和/或風疹抗原[例如，參考文獻78的第19、20和26章]。-流感抗原[例如，參考文獻78的第17和18章]，如血球凝集素和/或神經氨酸酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌(Moraxe〃acflfa廳/zafe)抗原[例如，92]。-釀膿鏈球菌(6^印^cocc^"oge"e力(A型鏈球菌)抗原[例如，93、94、95]。-金黃色葡萄球菌(&ap/y;/ococcwawrew)的抗原[例如，96]。利用糖或碳水化合物抗原時，優選與運載體偶聯以增強免疫原性。熟知乙型流感嗜血桿菌、腦膜炎球菌和肺炎球菌糖抗原的偶聯物。可視需要使有毒的蛋白抗原解毒(例如通過化學和/或遺傳方法使百日咳毒素解毒[77])。組合物包含白喉抗原時，優選也包含破傷風抗原和百日咳抗原。類似地，組合物包含破傷風抗原時，優選也包含白喉和百日咳抗原。類似地，組合物包含百日咳抗原時，優選也包含白喉和破傷風抗原。可將抗原吸附到鋁鹽上。一種類型的優選組合物包含性傳播病原體，例如皰疹病毒、淋病奈瑟菌、乳頭瘤病毒、砂眼衣原體等其它抗原。另一種類型的優選組合物包含能影響老年人和/或免疫力受損人士的其它抗原，因此，本發明GBS抗原可與以下非GBS病原體的一種或多種抗原混合流感病毒、糞腸球菌(五Werococcws/aeca&)、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌CSM;/^/ococcwe;Werm/力、銅綠假單胞菌aerwg/"(wa!)、侵月市軍團菌(丄egz'owe〃a/wewmop/n7a)、單核細胞增生禾U其萬特菌(丄/Wen'amo"ocj^ogewe51)、腦膜炎奈瑟球菌(7Vez'5^en'amem'"g〖"flfc)禾口副流感病毒。組合物中各抗原的濃度通常是至少1嗎/ml。任何給定抗原的濃度通常足以引發針對該抗原的免疫應答。或者，可用編碼抗原的核酸作為本發明組合物所用的蛋白抗原[例如，參考文獻97-105]。因此，可用編碼該蛋白質的核酸(優選DNA，例如質粒形式)替代本發明組合物的蛋白質組分。實際上，本發明組合物中抗原的種類數有上限。本發明組合物中抗原(包括GBS抗原)種類數可小于20、小于19、小于18、小于17、小于16、小于15、小于14、小于13、小于12、小于11、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4或小于3。本發明組合物中GBS抗原種類數可小于6、小于5或小于4。微資合欽微法本發明提供的藥物組合物包含(a)本發明偶聯物和(b)藥學上可接受的運載體。"藥學上可接受的運載體"通常包括本身不誘導產生對接受組合物的個體有害的抗體的任何運載體。合適的運載體一般是大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質、多糖、多聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[106]、海藻糖[107]、乳糖和脂質聚集體(例如油滴或脂質體)。本領域普通技術人員熟知這種運載體。疫苗也可含有稀釋劑，例如水、鹽水、甘油等。此外，可存在輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。滅菌無熱原的磷酸鹽緩沖生理鹽水是典型的運載體。藥學上可接受的賦形劑的詳盡討論見參考文獻108。本發明組合物可以是水性形式(即，溶液或混懸液)或干燥形式(例如，凍干的)。如果要用凍干疫苗，則可先用液體介質重建再注射。凍干偶聯物疫苗是本領域己知的，例如Menjugate產品以凍干形式提供，而NeisVac-CTM和Meningitec以水性形式提供。為在凍干期間穩定偶聯物，優選在組合物中加入，例如1mg/ml-30mg/ml(如，約25mg/ml)之間的糖醇(例如，甘露醇)或二糖(例如，蔗糖或海藻糖)。組合物可裝在小瓶中，或者可裝在預填充的注射器中。注射器可以配或不配針頭。注射器含有單劑量的組合物，而小瓶可含有單劑量或多劑量。本發明水性組合物也適用于重建凍干形式的其它疫苗。本發明組合物用于這種臨時重建時，本發明提供一種裝有兩個小瓶或者裝有一個預填充注射器和一個小瓶的試劑盒，先用注射器的內含物活化藥瓶的內含物再注射。本發明組合物可包裝成單位劑型或多劑劑型。對于多劑劑型，小瓶優于預填充注射器。可常規設定有效劑量體積，但該組合物的典型人用劑量體積是0.5ml，例如肌肉內注射時。所述組合物的pH優選6和8之間，更優選約7。可用緩沖液維持穩定的pH。如果組合物含有氫氧化鋁鹽，則優選使用組氨酸緩沖液[109]。組合物可以是滅菌和/或無熱原的。本發明組合物對于人體應是等滲的。本發明組合物是免疫原性組合物，更優選疫苗組合物。本發明疫苗可以是預防性(即為防止感染)或治療性(即，為治療感染)的，但通常是預防性的。用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫學有效量的抗原以及所需的任何其它組分。"免疫學有效量"指給予個體能有效治療或預防的用量(單一劑量或作為系列劑量的一部分)。該用量取決于所治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類學分組(例如非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗制劑、主治醫生對醫療狀況的評估以及其它相關因素而不同。估計該用量應處于可通過常規試驗確定的相對較寬范圍內。在各劑量中，各糖抗原的含量通常在l-50叫之間(以糖的質量檢測)，例如約1ng、約2.5pg、約4(ig、約5嗎或約10嗎。GBS影響身體的各部位，因此本發明組合物可以制備成各種形式。例如，這些組合物可以制備成可注射的(液體溶液或混懸液)。對于肺部給藥，該組合物可以制備成例如使用細粉或噴霧的吸入劑。該組合物可以制備成栓劑或陰道栓劑。對于鼻、耳或眼睛給藥，該組合物可以制備成，例如噴霧劑、滴劑、凝膠或粉末[例如，參考文獻110和lll]。已有報道說肺炎球菌糖[112，113]、Hib糖[114]、MenC糖[115]和Hib與MenC糖偶聯物的混合物[l16]的鼻部給藥獲得成功。本發明組合物可包含抗微生物劑，特別是當包裝成多劑量形式時。本發明組合物可含有洗滌劑，例如吐溫(聚山梨醇酯)，如吐溫80。洗滌劑通常處于低水平，例如<0.01%。本發明組合物可含有鈉鹽(例如，氯化鈉)以得到一定張力。NaCl的濃度通常為10±2mg/ml。本發明組合物通常包含緩沖液。典型的緩沖液是磷酸鹽緩沖液。本發明組合物通常與其它免疫調節劑聯合給予。具體地說，組合物通常含有一種或多種佐劑。這種佐劑包括但不限于-A^存f激質游邀合激適合用作本發明佐劑的含礦物質組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發明包括礦物鹽，例如氫氧化物(如過氧化物(oxyhydroxide))、磷酸鹽(如羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[如參見參考文獻117的第8和9章]，或不同礦物質化合物的混合物(如磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選磷酸鹽過量)，這些化合物可采取任何合適的形式(如凝膠、晶體、無定形等)，優選(具有)吸附性。含礦物質的組合物也可配制成金屬鹽顆粒[118]。本發明疫苗中可包含鋁鹽，Al"的劑量在每劑0.2-1.0mg之間。典型的磷酸鋁佐劑是P04/A1摩爾比在0.84和0.92之間的無定形羥基磷酸鋁，包含0.6mgAl3+/ml。可用低劑量磷酸鋁吸附，例如每劑每種偶聯物50-100pgAl3+。當使用磷酸鋁時，由于溶液中含有游離的磷酸根離子(例如，用磷酸鹽緩沖液)，無需將抗原吸附到佐劑上。及適合用作本發明佐劑的油乳劑組合物包括角鯊烯-水乳劑，例如MF59(5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%司盤85，用微流化儀配制成亞微米顆粒)[參考文獻17的第10章；也可參見參考文獻119-121]。MF59用作FLUADTM流感病毒三價亞單位疫苗的佐劑。特別優選用于組合物的佐劑是亞微米水包油乳劑。本文所用優選的亞微米水包油乳劑是任選含有不同含量的MTP-PE的角鯊烯/水乳劑，例如含4-5%w/v角鯊烯、0.25-1.0%w/v吐溫80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)和/或0.25-1.0%司盤85(失水山梨醇三油酸酯)和任選的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亞微米水包油乳劑。參考文獻119和122-123詳細描述了用于組合物中的亞微米水包油乳劑、其制備方法和免疫刺激劑，例如胞壁酰肽。完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)也可用作本發明佐劑。C.凌存劍淑A參考Uf/77游第"章7皂苷制劑也可用作本發明的佐劑。皂苷是在許多植物種類的樹皮、葉、莖、根、甚至花中發現的固醇糖苷和三萜系糖苷的異質混合物(heterologousgroup)。從皂樹(2"/〃"/asopo^n'aMolina)樹皮中分離的皂苷是已廣泛研究的佐劑。皂苷也可從麗花菝葜(5附//^(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、錐花絲石竹(G^;wo//n'〃a/wm'cw/am)(婚紗花(bridesveil))禾口月巴阜草OSapo"ar/aoj^i'c/awa//s)(皂根(soaproot))獲得。皂苷佐劑制劑包括純化的制劑，例如QS21，以及脂質制劑，例如ISCOM。也可利用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。己經鑒定了用這些技術專門純化的各組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B禾QQH-C。皂苷優選QS21。參考文獻124公開了QS21的制備方法。皂苷制劑也可含有固醇，例如膽固醇[125]。可聯用皂苷和膽固醇來形成稱為免疫刺激復合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻117的第23章]。ISCOM—般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM優選含有一種或多種QuilA、QHA和QHC。參考文獻125-127進一步描述了ISCOM。ISCOM任選不含其它洗滌劑[128]。皂苷佐劑開發的綜述見參考文獻129和130。Z).嫁毒體莉嫁毒存厭教病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發明的佐劑。這些結構通常含有任選與磷脂混合或用磷脂配制的一種或多種病毒蛋白。它們通常無病原性、無復制性，通常不含任何天然病毒基因組。可重組產生或從完整病毒分離病毒蛋白。適用于病毒體或VLP中的這些病毒蛋白包括源自以下病毒的蛋白質流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣殼蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、QP-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如逆轉錄轉座子Ty蛋白pl)。參考文獻131-136進一步討論了VLP。例如，參考文獻137進一步討論了病毒體。五.一欲葸或微主^欲主激適用于本發明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，例如腸細菌脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及它們的解毒衍生物。LPS的無毒衍生物包括單磷酰基脂質A(MPL)和3-0-脫酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是含有4、5或6條酰化鏈的3脫-O-酰化單磷酰基脂質A的混合物。參考文獻138公開了3脫-O-酰化單磷酰基脂質A的優選"小顆粒"形式。這種"小顆粒"的3dMPL足夠小從而可經0.22pm膜除菌過濾[138]。其它無毒的LPS衍生物包括單磷酰基脂質A模擬物，例如氨基垸基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[139、140]。脂質A衍生物包括大腸桿菌的脂質A衍生物，例如OM-174。例如，參考文獻141和142描述了OM-174。適合用作本發明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通過磷酸鍵與鳥苷相連的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示有免疫刺激性。CpG可含有核苷酸修飾/類似物，例如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈的。參考文獻H3、144和145公開了可能的類似物取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻146-151進一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑效力。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[152]。CpG序列，例如CpG-AODN可特異性誘導Thl免疫應答，或者，例如CpG-BODN能更特異性誘導B細胞應答。參考文獻153-155討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優選CpG-AODN。優選將CpG寡核苷酸構建為5'端易于為受體識別。任選將兩條CpG寡核苷酸序列在它們的3'端相連以形成"免疫聚物"(immunomer)。參見，例如參考文獻152和156-158。細菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本發明佐劑。蛋白質優選源自大腸桿菌(大腸桿菌熱不穩定腸毒素"LT")、霍亂(弧菌)("CT")或百日咳(桿菌)("PT")。參考文獻159描述了解毒ADP-核糖基化毒素作為粘膜佐劑的應用，參考文獻160描述了其作為胃腸外佐劑的應用。該毒素或類毒素優選含有A和B亞基的全毒素形式。A亞基優選含有解毒性突變；B亞基優選不突變。該佐劑優選解毒的LT突變體，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72作為佐劑的應用見參考文獻161-168。氨基酸取代的數字基準優選以參考文獻169所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亞基比對為基礎，該文獻專門全文納入本文作為參考。F.乂免疫^^淑適合用作本發明佐劑的人免疫調節劑包括細胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL國12[170]等)[171]、干擾素(如，干擾素-力、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。G.生激薪合淑浙歉漠薪合淑生物黏合劑(bioadhesive)和粘膜黏合劑(mucoadhesive)也可用作本發明佐劑。合適的生物黏合劑包括酯化的透明質酸微球[172]，或者粘膜黏合劑，例如聚(丙烯酸)的交聯衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、多糖和羧甲基纖維素。殼多糖及其衍生物也可用作本發明佐劑[173]。i/,微微粒也可用作本發明佐劑。可從生物可降解和無毒的材料(例如，聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內酯等)，優選聚(丙交酯-共-乙交酯)制備微粒(即，直徑約100nm到150pm，優選約200nm到約30pm，最優選約500nm到約10pm的顆粒)，任選將這些微粒處理成帶負電的表面(例如，用SDS)或帶正電的表面(例如，用陽離子洗滌劑，如CTAB)。/.游處^r參考文就7/7游第/J莉〃章)參考文獻H4-176描述了適合用作佐劑的脂質體制劑的例子。J.覆奪Z諒發或覆奪乙諒磨劍淑適用于本發明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[177]。這種制劑還包括與辛苯聚醇聯用的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑[178]以及與至少一種其它非離子表面活性劑，例如辛苯聚醇利用的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑[179]。優選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。層微C用PCPP制劑描述于，例如參考文獻180和181中。丄.應虔魔箭適合用作本發明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基曙D-異谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(r-2'-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。M.銀贈岸壁諾源眾合激適合用作本發明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物包括參考文獻182和183中進一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")。〃裙彖基蔬嚴眾會激縮氨基硫脲化合物的例子以及配制、制備和篩選所有適合用作本發明佐劑的這類化合物的方法包括參考文獻184所述的那些。縮氨基硫脲能特別有效地刺激人外周血單核的細胞產生細胞因子，例如TNF-a。a色麗眾合欽色胺酮化合物的例子以及配制、制備和篩選所有適合用作本發明佐劑的這類化合物的方法包括參考文獻185所述的那些。色胺酮化合物能特別有效地刺激人外周血單核的細胞產生細胞因子，例如TNF-a。本發明各方面也包括聯用一種或多種以上鑒定的佐劑。例如，以下組合物可用作本發明佐劑組合物(1)皂苷和水包油乳劑[186];(2)皂苷(例如QS21)十無毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[187];(3)皂苷(例如QS21)+無毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)[188];(5)聯用3dMPL與例如QS21和/或水包油乳劑[189];(6)含10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化為亞微米乳劑或漩渦振蕩產生較大粒度的乳劑；(7)RibiTM佐劑系統(RAS)，(RibiImmunochem)，含有2%角鯊烯、0.2%吐溫80和由單磷酸酰脂質A(monophosphorylipidA)(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)，優選MPL+CWS(DetoxTM)組成的一種或多種細菌細胞壁組分；和(8)一種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(例如3dMPL)。參考文獻117的第7章公開了用作免疫刺激劑的其它物質。特別優選使用鋁鹽佐劑，抗原通常吸附到這種鹽上。Menjugate和NeisVacTM偶聯物利用氫氧化物佐劑，而Meningitec利用磷酸鹽佐劑。對于本發明組合物，可將一些抗原吸附到氫氧化鋁上而使其它抗原與磷酸鋁結合。然而通常優選只使用一種鹽，例如氫氧化物或磷酸鹽，而不是兩種。不需要吸附所有偶聯物，即一些或所有偶聯物可游離在溶液中。治#贈本發明也提供引起哺乳動物免疫應答的方法，包括給予哺乳動物本發明藥物組合物。免疫應答優選有保護性并優選涉及抗體。該方法可引起加強應答。哺乳動物優選人。當疫苗用于預防應用時，人優選兒童(例如，學步兒童或嬰兒)或青少年；當疫苗用于治療應用時，人優選成人。兒童用疫苗也可給予成人，例如用于評價安全性、劑量、免疫原性等。用于治療的一類人優選育齡婦女(例如，青少年和更年長的)。另一類優選的人是妊娠期婦女。本發明也提供可用作藥物的本發明組合物。所述藥物優選能引起哺乳動物的免疫應答(即免疫原性組合物)，更優選疫苗。本發明也提供本發明偶聯物在制備用于引起哺乳動物免疫應答的藥物中的應用。這些應用和方法優選用于預防和/或治療由無乳鏈球菌引起的疾病，例如新生兒敗血癥或菌血癥、新生兒肺炎、新生兒腦膜炎、子宮內膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎等。要預防疾病的對象可以與接受本發明偶聯物的對象不同。例如，可將偶聯物給予婦女(妊娠前或期間)來保護后代(稱為"母體免疫接種"[190-192])。檢測治療性治療效果的一種方法包括監測給予本發明組合物后的GBS感染。檢測預防性治療效果的一種方法包括監測給予組合物后針對GBS抗原的免疫應答。本發明優選組合物在可接受百分比的人對象中賦予患者的抗體滴度優于各抗原性組分的血清保護標準。熟知抗原的相關抗體滴度(高于該滴度則認為宿主對該抗原已血清陽轉)，這種滴度由諸如WHO等組織發布。優選超過80%的對象的樣本有統計學有意義的血清陽轉，更優選超過90%，還更優選超過93%,最優選96-100%。本發明組合物通常應對患者直接給藥。可通過胃腸外注射(例如皮下、腹膜內、靜脈內、肌肉內或組織間隙注射)實現直接遞送，或通過直腸、口服、陰道、局部、透皮、鼻內、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜給藥實現。優選大腿或上臂的肌肉內給予。注射可以通過注射針(例如皮下注射用針)，但也可采用無針注射。典型的肌內注射劑量是0.5ml。可采用本發明引發全身性和/或粘膜免疫力。劑量療法可以是單劑量方案或多劑量方案。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強免疫方案。初次劑量方案之后可以是加強劑量方案。可以常規確定致敏劑量之間(例如4-16周之間)以及致敏和加強之間的適當時間安排。激艦如上所述，本發明組合物中可包含GBS蛋白。這些蛋白可用作本發明偶聯物的運載體蛋白、其它偶聯物的運載體蛋白或未偶聯的蛋白抗原。本發明所用的GBS蛋白抗原包括參考文獻93和193-195中公開的那些。本發明所用的5種優選GBS抗原稱為GBS67;GBS80;GBS104;GBS276和GBS322[參見參考文獻93]。這5種抗原的其它細節見下文。這5種GBS蛋白的全長序列見本文的SEQIDN01-5。因此，本發明組合物可包含(a)含有選自SEQIDNO1-5的氨基酸序列的多肽，和/或(b)含有(i)與SEQIDNO1-5中一條或多條具有序列相同性的氨基酸序列和/或(ii)SEQIDNO1-5的片段的多肽。根據具體的SEQIDNO,(i)的序列相同性程度優選大于50%(例如，60%、70%、75%、80%、85%、90%、9P/o、92%、93%、94。/。、95%、96%、97%、98%、99%或更高)。這些多肽包括同源物、直向同源物、等位變體和功能突變體。通常認為兩條多肽序列之間有50%或更高的相同性表明其功能上等同。優選采用MPSRCH程序(OxfordMolecular)執行的Smith-Waterman同源性檢索算法測定多肽之間的相同性，該程序利用仿射空位檢索，參數是空位開放罰分=12，空位延伸罰分=1。根據具體的SEQIDNO，(ii)的片段應含有這些序列的至少n個連續氨基酸，根據具體的序列，n是7或更大(例如，8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更大)。片段可含有該序列的至少一個T細胞或優選B細胞表位。可以憑經驗鑒定T-細胞和B-細胞表位(例如，采用PEPSCAN[196，197]或相似的方法)，或者可預測這些表位(例如，采用Jameson-Wolf抗原指數[198]、矩陣方法[199]、TEPITOPE[200]、神經網絡[201]、OptiMer&EpiMer[202，203]、ADEPT[204]、Tsites[205]、親水性[206]、抗原性指數[207]或參考文獻208公開的方法等)。其它的優選片段是不含N-末端氨基酸殘基或不含N-末端信號肽的SEQIDNO1-5。可除去一個或多個結構域，例如前導序列或信號序列區、跨膜區、胞質區或細胞壁錨定基序。優選的片段如下文所示(SEQIDN06-19)。與SEQIDNO1-5相比，這些多肽可包含一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守性氨基酸取代，即用具有相似側鏈的另一氨基酸取代某一氨基酸。遺傳學編碼的氨基酸通常可分為4個家族(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性，即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不荷電極性，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時一起分為芳香族氨基酸。這些家族內的單一氨基酸取代不會對生物學活性造成重要影響。與SEQIDNOl-5相比，這些多肽也可包含一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)單氨基酸缺失。與SEQIDNO1-5相比，這些多肽也可包含一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(例如，各有l、2、3、4或5個氨基酸插入)。可采用許多方法，例如通過化學合成(全部或部分)、用蛋白酶消化較長的多肽、從RNA翻譯、從細胞培養物(例如，重組表達)純化、從生物自身純化(例如，細菌培養后或直接從患者純化)等來制備本發明多肽。產生長度<40個氨基酸的肽的優選方法包括體外化學合成[209，210]。特別優選固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc化學試劑的方法[211]。也可部分或完全采用酶促合成[212]。或者，可采用生物合成替代化學合成，例如可通過翻譯產生多肽。這可在體外或體內進行。生物學方法通常局限于產生基于L-氨基酸的多肽，但可利用對翻譯機制(例如，氨酰基tRNA分子)的操控來引入D-氨基酸(或非天然氨基酸，例如碘酪氨酸或甲基苯丙氨酸、疊氮基高丙氨酸(azidohomoalanine)等)[213]。然而，當包含D-氨基酸時，優選采用化學合成。本發明多肽可在C-末端和/或N-末端具有共價修飾。如果本發明組合物中包含這些GBS蛋白，則它們可采取各種形式(例如，天然的、融合體、糖基化的、非糖基化的、脂化的、非脂化的、磷酸化的、非磷酸化的、豆蔻酰化的、非豆蔻酰化的、單體的、多聚的、顆粒化的、變性的等)。它們優選以純化或基本上純化的形式使用，即基本上不含其它多肽(例如，不含天然產生的多肽，特別是不含其它GBS或宿主細胞多肽)。G雄7測序的血清型V菌株2603V/R的GBS67核苷酸序列和氨基酸序列見參考文獻93的SEQIDNO3745和3746。在本文中其氨基酸序列是SEQIDNO:1:FILIGGAMMSIAGGIYIWKRYKKSSDMSIKKDGBS67含有C-末端跨膜區，該區域在最接近以上SEQIDNO:1的C-末端區域以下劃線標出。可除去跨膜區的一個或多個氨基酸，或者可截短跨膜區前的氨基酸。這種GBS67片段的一個例子見下文的SEQIDNO:18。GBS67含有表示細胞壁錨定的氨基酸基序，其在以上SEQIDNO:l中以斜體字顯示。在一些重組宿主細胞系統中，優選除去該基序而有利于重組GBS67蛋白從宿主細胞分泌。因此，在本發明所用一優選GBS67片段中，除去了GBS67的跨膜和細胞壁錨定基序。這種GBS67片段的一個例子見下文的SEQIDNO:19。DliKDGKYQIjIEAVSPEDYQKITNKPIlLTFEWKGSIKNIIAWKQISEYHEEGDKHIjITNTHIPPKGIGS，GBS80指推定的細胞壁表面錨定家族蛋白。分離的血清型V菌株2603V/R測序的GBS80核苷酸序列和氨基酸序列見參考文獻93的SEQIDNO8779和8780。在本文中其氨基酸序列是SEQIDNO:2:GBS80含有N-末端前導序列區或信號序列區，該區域在以上序列中以下劃線標出。可除去GBS80的前導序列區或信號序列區的一個或多個氨基酸。這種GBS80片段的一個例子見下文的SEQIDNO:6.-TIKNNKRPS工酸GG工GTAII"VAIGAAVMAFAVKGMKKRT咖GBS80含有C-末端跨膜區，該區域在靠近以上SEQIDNO:2的末端以帶下劃線的序列標出。可除去跨膜區和/或胞質區的一個或多個氨基酸。這種片段的一個例子見下文的SEQIDNO:7:PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSJPWTOGBS80含有表示細胞壁錨定的氨基酸基序，其在以上SEQIDNO:2中以VpRKKSsFDEAGGAADNQTGpKsDVKGDEKIETDV!wTEKFDGssDAKpfvLY二GTNsDpGsJIDKEpKFTpQNDpKERYGTKGADGVIAAT=-工GAEIGrDwHJRTDs_LEH:INpGTHVDADsDTINDDDTIKDYwTGFDEsILDpF工EVGGGE斜體字顯示。在一些重組宿主細胞系統中，優選除去該基序而有利于重組GBS80蛋白從宿主細胞分泌。因此，可除去GBS80的跨膜區和/或胞質區及細胞壁錨定基序。這種片段的一個例子見下文的SEQIDNO:8。pegyvipdkeieetvsqtsyntkptd工tvdsadm"pd:t工knnkrps或者，在一些重組宿主細胞系統中，優選用細胞壁錨定基序將重組表達的蛋白錨定到細胞壁上。可在純化期間切除所表達蛋白的胞外結構域，或者最終組合物中的重組蛋白可維持連接于滅活的宿主細胞或細胞膜上。在一個實施方式中，可除去GBS80序列的前導序列區或信號序列區、跨膜區和胞質區及細胞壁錨定基序。這種GBS80片段的一個例子見下文的SEQIDNO:9:tiknnkrps尤其(具有)免疫原性的GBS80片段位于該蛋白的N-末端，在本文以SEQIDNO:10表示ehytideptvdnqntlkitfkpekfkeiaellkgG肌似GBS104指推定的細胞壁表面錨定家族蛋白。稱為em^4。分離的血清型V菌株2603V/R測序的GBS104核苷酸序列和氨基酸序列見參考文獻93的SEQIDNO8777和8778。在本文中其氨基酸序列是SEQIDNO:3:YILVGSTFMIIiTICSFRRKgLGBS104含有N-末端前導序列區或信號序列區，該區域在以上SEQIDNO:3的起始處以帶下劃線的序列標出。可除去GBS104的前導序列區或信號序列區的一個或多個氨基酸。這種GBS104片段的一個例子見下文的SEQIDNO:11:GBS104含有C-末端跨膜區和/或胞質區，該區域在靠近以上SEQIDNO:3的末端以帶下劃線的區域標出。可除去跨膜區和/或胞質區的一個或多個氨基酸。這種GBS104片段的一個例子見下文的SEQIDNO:12:DGNYKIjYEISSPDGYIEVKTKPVVTFTIQNGEVTNIjKADPNANKNQ工GYIjEGNGKHLITNT可除去前導序列區或信號序列區的一個或多個氨基酸和跨膜區或胞質區的一個或多個氨基酸。這種GBS104片段的一個例子見下文的SEQIDNO:13:qngevt肌kadpnanknqigy;legngkh:litntGBS104的其它片段包括GBS104氨基酸28-858(按照SEQIDNO:3編號)的830個氨基酸的片段，GBS104氨基酸28-387的359個氨基酸的片段，GBS104氨基酸28-609的581個氨基酸的片段或GBS104氨基酸28-768的740個氨基酸的片段。GBS276指C5a肽酶。GBS276的其它描述見參考文獻214-217。分離的血清型V菌株2603V/R測序的GBS104核苷酸序列和氨基酸序列見參考文獻93的SEQIDNO8941和8942。在本文中其氨基酸序列是SEQIDNO:4:rdglpttndkdtnrlhklklvmttff;lgGBS276含有N-末端前導序列區或信號序列區，該區域在以上SEQIDNO:4的起始處以帶下劃線的序列標出。可除去GBS276的前導序列區或信號序列區的一個或多個氨基酸。這種GBS276片段的一個例子見下文的SEQIDNO:14:FLGGBS276含有C-末端跨膜區和/或胞質區，該區域在靠近以上SEQIDNO:4的末端以帶下劃線的序列標出。可除去GBS276的跨膜區或胞質區的一個或多個氨基酸。這種GBS276片段的一個例子見下文的SEQIDNO:15:可除去GBS276的前導序列區或信號序列區的一個或多個氨基酸和跨膜區或胞質區的一個或多個氨基酸。這種GBS276片段的一個例子見下文的SEQIDNO:16:EQDGSGQTPDKKKETKPEKDSSGQTPGKTPQ卿SSRTLEKRSSKRALATKG艦"GBS322指表面免疫原性蛋白，也稱為"sip"。分離的血清型V菌株2603V/R測序的GBS322核苷酸序列和氨基酸序列見參考文獻93的SEQIDNO8539和8540。在本文中其氨基酸序列是SEQIDNO:5:YSNTNSIYGPANTWNAMPDRGGVTANHYDHVHVSFNKGBS322含有N-末端前導序列區或信號序列區，該區域在以上SEQIDNO:5的起始處以帶下劃線的序列標出。可除去GBS322的前導序列區或信號序列區的一個或多個氨基酸。這種GBS322片段的一個例子見下文的SEQIDNO:17:鄉術語術語"含有"包括"包含"以及"由……構成"，例如"含有"X的組合物可僅由X構成或可包含其它物質，例如X+Y。與數值x相關的術語"約"表示，例如灶10%。"基本上"不排除"完全"，例如"基本上不含"Y的組合物可完全不含Y。"基本上"可視需要從本發明定義中省去。當本發明提供的方法包括多個連續步驟時，本發明也提供包括的步驟總數較少的方法。例如，在本發明的第一方面，本發明提供包括以下步驟的方法(a)氧化GBS莢膜糖以在末端唾液酸殘基中引入醛基；和(b)還原胺化該醛基。屬于本發明的范圍包括無需進行額外步驟(C)和(d)，因為步驟(C)和(d)的產物已用作制備偶聯物的中間體，并且可在分別和隨后的應用(例如用于步驟(C)和(d)中)中使用、保存、運輸等。類似地，當起始糖物質早已部分加工過，則本發明所包括的方法只包括該方法的后幾步。例如，在本發明的第三方面，本發明包括的方法包括將修飾的半乳糖殘基與運載體分子偶聯的步驟，其中該方法的起始物質是己氧化而在半乳糖殘基中引入了醛基的糖。可在不同時間由不同的人在不同地點(例如，在不同國家)進行這些不同的步驟。應該知道糖環可存在開放和封閉形式，雖然本文結構式顯示封閉形式，但開放形式也屬于本發明。類似地，應該知道糖可以存在吡喃和呋喃形式，雖然本文結構式顯示吡喃形式，但也應包括呋喃形式。也應包括不同端基異構形式的糖。式NH2R代表伯胺。R基團優選供電子基團，包括(318烴基，更優選ds烷基，特別是甲基。R優選-CH3、《2115或-(:3117。烴基可以用一個或多個基團取代，例如鹵素(如Cl、Br、F、1)、三鹵甲基、-n02、-CN、-N+(C16烷基)20陽、-s03H、-sod6烷基、-802<:1.6烷基、-803<:16烷基、-oc^coocw烷基、-c(=o)h、-<:(0)<:1.6垸基、-0<:(=0)(:1-6垸基、-N(d-6垸基)2、Q.6烷基、^(<:1_6烷基)2、-C(-O)N(Cw烷基)2、-NWm烷基)C^O)0(d.6垸基)、-N(C"烷基)C^O)N(d.6垸基)2、-c02H、-OC^CONCC^烷基)2、-N(d.6烷基)C^O)d.6垸基、-N(d.6烷基)c^s)CL6烷基、^(<31.6烷基)80^(<:1.6烷基)2、-(:02(^.6烷基、-sg^no:"烷基)2、-C(=0)NH2、-C^S^CCw烷基)2、-N(Cw烷基)S02d.6垸基、-N(Cw烷基)c^s)N(cl6烷基)2、->^-(:1.6垸基、-8-<:1.6烷基或-0-(:1.6烷基。術語"烴基"包括碳和氫構成的線形、支鏈或環狀單價基團。因此，烴基包括烷基、烯基和炔基、環垸基(包括聚環垸基(polycycloalkyl))、環烯基和芳基及它們的組合，例如垸基環垸基、烷基聚環垸基、垸基芳基、烯基芳基、環垸基芳基、環烯基芳基、環烷基垸基、聚環垸基烷基、芳基垸基、芳基烯基、芳基環垸基和芳基環烯基。優選的烴基是Cw4烴基，更優選d.3烴基。附圖簡述圖1顯示了用過碘酸鹽氧化末端唾液酸殘基。圖2顯示了本發明的第一和第二方面。圖3顯示了GBS血清型Ia、Ib、II、III和V莢膜糖的重復結構。圖4顯示了GBS血清型Ia和III的重復結構之間的差異。圖5顯示了可以制備的兩類偶聯物。圖6顯示了根據本發明第一方面，使用己二酸的琥珀酰亞胺二酯的優選偶聯反應。圖7顯示了根據本發明第二方面，使用己二酸的琥珀酰亞胺二酯的優選偶聯反應。圖8和9顯示了在還原胺化末端唾液酸殘基氧化形成的醛基后，利用(8)丙烯酰化和(9)鹵代酰鹵制備偶聯物。本發明實施方式織微餘教如參考文獻15所述純化GBS血清型Ib的莢膜糖，然后如上所述重乙酰化。糖經脫-N-乙酰化得到用于連接的胺基。利用這些胺基通過直接還原胺化(如現有技術所述，唾液酸的C8上)或通過SIDEA間隔基團(如參考文獻218所述的腦膜炎球菌糖)共價偶聯糖與單體破傷風類毒素(TT)。按照參考文獻219所述的比色方法測定偶聯物中的唾液酸含量。從唾液酸含量外推得到糖總含量(以聚合物的重量計，唾液酸平均為31%)。用MicroBCA蛋白質測定試劑盒(Pierce)測定偶聯物中的蛋白質濃度。目標是多糖蛋白質重量比在l-4之間，結果如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>為研究如何影響偶聯物的交聯比，將純化的GBSIa和Ib糖氧化至不同程度，然后與CRM197偶聯。結果如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>采用相似的實驗研究不同的蛋白質運載體。CRM197和破傷風類毒素均用作GBSIII型糖的運載體，結果如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>對于GBSII型和V型糖，比較了三種不同的運載體破傷風類毒素；CRM197和人血清白蛋白。V型糖的氧化程度是15.3%，II型糖是6.9%。結果是<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>分別檢驗人血清白蛋白作為Ia型(6.7。/。氧化)、Ib型(8.2o/o氧化)和III型(4.10/0氧化)糖的運載體<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>因此，GBS運載體能提供針對V型菌株的一定保護作用，所以利用GBS蛋白作為運載體能賦予背景水平的蛋白質介導保護作用，糖與蛋白質偶聯能補充這種保護作用。檢驗各種偶聯物中的游離糖水平，結果如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>應該知道只是通過實施例描述了本發明，可對其作出改進而仍維持在本發明的范圍和構思內。參考文獻(其內容納入本文作為參考)Paoletti等，(1990)JBiolChem265:18278-83.[2]Wessels等，(1990)JClinInvest86:1428-33.[3]Paoletti等，(1992)Infectlmmun60:4009-14.[4]Paoletti等，(1992)JClinInvest89:203-9.Wessels等，(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:9170-4.Wang等，(2003)Vaccine21:1112-7.Wessels等，(1993)InfectImmun61:4760-6Wessels等，(1995)JInfectDis171:879-84.Baker等，(2004)JInfectDis189:1103-12.美國專利4356170.Paoletti和Kasper，(2003)ExpertOpinBiolTher3:975-84.[12]美國專利6027733和6274144.www.polymer.deLewis等，(2004)PNASUSA101:11123-8.國際專禾U申請PCT/1B05/_，"PURIFICATIONOFSTREPTOCOCCALCAPSULARPOLYSACCHARIDE"(鏈球菌莢膜多糖的純化)，要求GB-0502096.1的優先權(CHIRONSRL).Ramsay等，(2001)Lancet357(9251):195-196.Lindberg，(1999)Vaccine17增刊2:S28-36.Buttery和Moxon，(2000)JRCollPhysiciansLond34:163-168.Ahmad和Chapnick，(1999)InfectDisClinNorthAm13:113-33，vii.Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47:563-567.[21]歐洲專利0477508.[22]美國專利5,306,492.[23]W098/42721.Dick等，刊于ConjugateVaccines(《偶聯物疫苗》)，(Cruse等編)Karger，Basel,1989，10:48-114.Hermanson，BioconjugateTechniques(《生物偶聯技術》)，AcademicPress,SanDiego(1996)ISBN:0123423368.匿名，(2002年l月)，ResearchDisclosure,453077.Anderson(1983)InfectImmun39(1):233-238.Anderson等，(1985)JGunInvest76(l):52-59.EP-A-0372501.EP-A-0378881.EP-A-0427347.W093/17712WO94/03208.W098/58668.EP-A-0471177.WO91/01146Falugi等，(2001)EurJIimmunol31:3816-24.[38]Baraldo等，(2004)InfectImmun72:4884-87.[39]EP-A-0594610.[40]WO00/56360.[41]WO02/091998.Kuo等，(1995)InfectImmun63:2706-13.WOO1/72337WO00/61761WO99/42130.WO2004/011027.WO96/40242,[48[49[50Vaccines(《疫苗》)，(2004)，Plotkin和Orenstein編，ISBN0-7216-9688-0.[79]WO02/02606.Kalman等，(1999)NatureGenetics21:385-389.Read等，(2000)NucleicAcidsRes28:1397-406.Shirai等，(2000)J.Infect.Dis.181(增刊3):S524-S527.WO99/27105.WO00/27994.WO00/37494.W099/28475.Ross等，(2001)Vaccine19:4135-4142.Sutter等，(2000)PediatrClinNorthAm47:287-308.Dreesen(1997)Vaccine15增刊:S2-6.MMWRMorbMortalWklyRep1998年1月16;47(1):12,19.[92]McMichael(2000)Vaccine19增刊1:S101-107.[93]WO02/34771.Dale(1999)InfectDisClinNorthAm13:227-43,viii.[95]Ferretti等，(2001)FNASUSA98:4658-4663.Robinson禾口Torres(1997)SeminarsinImmunology9:271-283.Donnelly等，(1997)AnnuRevImmunol15:617-648.Scott-Taylor和Dalgleish(2000)ExpertOpinInvestigDrugs9:471-480.Apostolopoulos和Plebanski(2000)CurrOpinMolTher2:441-447.Ilan(1999)CurrOpinMolTher1:116-120.Dubensky等，(2000)MolMed6:723-732.Robinson和Pertmer(2000)AdvVirusRes55:1-74.Donnelly等，(2000)AmJRespirCritCareMed162(4部分2):S190-193.Davis(1999)Mt.SinaiJ.Med.66:84-90.[106]Paoletti等，(2001)Vaccine19:2118-2126.[107]WO00/56365.Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(《雷明頓藥物科學與實踐》)，第二十版，ISBN:0683306472.[109]WO03/009869.Almeida和Alpar(1996)J.DrugTargeting3:455-467.[Ill]Agarwal和Mishra(1999)IndianJExpBiol37:6-16.[112]WO00/53221.Jakobsen等，(2002)InfectImmun70:1443-1452.[114]Bergquist等，(1998)APMIS106:800-806.[115]Baudner等，(2002)Infectlinmun70:4785-4790.[116]Ugozzoli等，(2002)JInfectDis186:1358-1361.VaccineDesign(《疫苗設計》)，(1995)，Powell和Newman編，ISBN:030644867X.Plenum.[118]WO00/23105.[119]WO90/14837.Podda(2001)Vaccine19:2673-80.Frey等，(2003)Vaccine21:4234-7.美國專利6,299,884.美國專利6,451,325.美國專利5,057,540.W096/33739.EP-A-0109942.W096/11711.WO00/07621.Barr等，(1998)AdvancedDrugDeliveiyReviews32:247-271.[130]Sjolanderet等，(1998)AdvancedDrugDeliveiyReviews32:321-338.[131]Niikura等，(2002)Virology293:273-280.[132]Lenz等，(2001)JImmnunol166:5346-5355.604:505593):654Pinto等，(2003)JJnfectDis188:327-338.Gerber等，(2001)Virol75:4752-4760.WO03/024480WO03/024481Gluck等，(2002)Vaccine20:B10-B16.EP-A-0689454.Johnson等，(1999)BioorgMedChemLett9:2273-2278.Evans等，(2003)ExpertRevVaccines2:219-229.Meraldj等，(2003)Vaccine21:2485-2491.Pajak等，(2003)Vaccine21:836-842.Kandimalla等，(2003)NucleicAcidsResearch31:2393-2400.WO02/26757.W099/62923.Krieg(2003)NatureMedicine9:831-835.McCluskie等，(2002)FEMSimmunologyandMedicalMicrobiologyWO98/40100.美國專禾ij6,207,646.美國專利6,239,116.美國專利6,429,199.Kandimalla等，(2003)BiochemicalSocietyTransactions31(部分Blackwell等，(2003)JImmunol170:4061-4068.Krieg(2002)TrendsImmunol23:64-65.WO01/95935.Kandimalla等，(2003)BBRC306:948-953.Bhagat等，(2003)BBRC300:853-861.WO03/035836.W095/17211.[160]W098/42375.Beignon等，(2002)InfectImmun70:3012-3019.Pizza等，(2001)Vaccine19:2534-2541.Scharton-Kersten等，(2000)InfectImmun68:5306-5313.Ryan等，(1999)InfectImmun67:6270-6280.Partidos等，(1999)ImmunolLett67:209-216.Peppoloni等，(2003)ExpertRevVaccines2:285-293.Pine等，(2002)JControlRelease85:263-270.Domenighini等，(1995)MolMicrobiol15:1165-1167.WO99/40936.W099/44636.Singh等，(2001).JContRelease70:267-276.WO99/27960.美國專利6,090,406美國專利5,916,588EP-A-0626169.W099/52549.WO01/21207.WOO1/21152.Andrianov等，(1998)Biomaterials19:109-115.Payne等，(1998)AdvDrugDeliveryReview31:185-196.Stanley(2002)ClinExpDermatol27:571-577.Jones(2003)CurrOpinInvestigDrugs4:214-218.WO04/60308WO04/64759.W099/11241.W094/00153.H881W098/57659.[189]歐洲專利申請0835318、0735898和0761231.[190]Glezen和Alpers(1999)Clin.Infect.Dis.28:219-224[191]Madoff等，(1994)JClinInvest94:286-92.[192]Paoletti等，(1994)InfectImmun62:3236-43.[193]WO03/093306.[194]WO2004/018646.[195]WO2004/0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