專利名稱：表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因重組和基因治療領域，具體涉及一種重組腺相關病毒載體與人類激肽釋放酶基因重組體，該重組體的制備方法和用途，以及含有該重組體的藥物組合物。
背景技術：
高血壓病是一種多因素影響、多基因起源的慢性疾病，目前治療這種疾病的有效方法只能是長期，甚至是終身服用降壓藥物，這對于高血壓病患者來說無疑是一種負擔，長期服用降壓藥物還會對機產生一些不良影響。因此，探索高血壓病的基因治療方法和藥物成為當前的一項重要課題。
人類激肽釋放酶(human kallikrein，HK)是一類絲氨酸蛋白酶，可裂解激肽原生成血管活性肽-激肽。激肽在細胞水平上可促進氯離子和葡萄糖的轉運，促進神經元釋放遞質等。現在發現它還可EDRF/NO的釋放，刺激腎臟分泌腎素，促進腎上腺釋放血管加壓素，促進腎上腺髓質分泌兒茶酚胺。它的這些作用是通過與BK1(配體為kallidin)、BK2(配體為bradykinin)受體結合后發揮的，現在發現激肽可能以NO為第二信使分子而發揮作用。激肽分子C末端的精氨酸可作為NO合成的原料，在NOS作用下合成NO，再通過激活鳥苷酸環化酶，促進cGMP的形成；增加細胞內游離鈣；促進PIP2和IP3的形成進而影響多種基因的表達，實現自己舒張血管、增加血管通透性、調節平滑肌的收縮和舒張、等多種生理作用。從而可以治療高血壓，改善腎功能，預防中風。臨床研究顯示，原發性高血壓患者尿中HK顯著降低，而口服豬胰腺激肽釋放酶可明顯降低高血壓患者的血壓。另外，在SHR也觀察到尿HK減少。實驗研究已證明，敲除HK基因的大鼠血壓升高，而導入HK基因的不同的高血壓大鼠模型均出現持續的降壓作用。天然狀態的人類激肽釋放酶cDNA序列(錄自GENEBANK)在本說明書的后面。
腺相關病毒是一種動物單鏈DNA病毒，它屬于細小病毒科，細小病毒亞科，依賴病毒屬，自然缺陷、無包被和無致病原性。天然腺相關病毒(AAV)及重組腺相關病毒(rAAV)載體具有以下特點1.V基因組是一個線性、單鏈(ssDNA)分子，含4680個核苷酸(序列如附圖1)，其特點在于1)其基因組由4個開放閱讀寬讀框(ORF)組成，分稱rep區、1ip區、inf區和cap區(見本說明書后面的腺相關病毒序列及具體分區表和附圖1)。位于基因組DNA左端的一個大ORF由于移碼突變或缺失會阻止DNA復制，因而被稱為rep區，。右端的一個大ORF(cap)編碼合成3種外殼蛋白。另有兩個小ORF位于基因組DNA的中央區，即inf區和lip區，具體功能尚不清。
2)在分子單鏈每個末端含有一個145個堿基末端重復序列(ITR)(見本說明書后面的腺相關病毒序列及具體分區表)。ITR序列折疊成發卡結構作為DNA復制起始和包裝重組AAV基因組為感染性的病毒顆粒所需的唯一已知順式作用元件(見附圖2)。
3)腺相關病毒的復制和轉錄調節相當復雜，按有無輔助病毒的共轉染分，有增殖性和潛伏性兩種表達方式(如附圖3所示)。
在AAV的增殖性表達中，可轉錄生成6種mRNA，分別由啟動子P5、P19、P40啟動合成(如圖4)。在腺病毒(Ad)的共轉染的情況下，Ad的E1A基因負責AAV基因表達的反式激活；Ad E2A基因編碼單鏈DNA結合蛋白，可刺激AAV啟動子所啟動的轉錄，還可促進AAV轉錄本從胞核向胞質轉運；另外Ad VA1 RNA可能也有利于AAV蛋白合成的起始。而AAV也能夠正調節和負調節自身基因和輔助病毒基因表達。AAV的rep基因能夠正調節和負調節P5、P19、P40啟動子所啟動的轉錄，在有Ad的情況下，rep基因產物行使正調節功能，這是AAV基因大量合成所必須的；而在無輔助病毒共轉染的情況下，rep基因產物則起負調節作用。
在無輔助病毒的情況下，AAV DNA以雙鏈形式整合到宿主細胞基因組中，在那里以潛伏狀態持續存在，形成AAV的潛伏感染。AAV整合的特異位點是在人染色體的19q13.3-19q ter上。Rep基因產物除了負調節作用外，還可識別和結合特異的整合位點，即GGTC序列，并介導了ITR與整合位點的重組。而腺病毒的感染可使其進入增殖感染狀態。
AAV是目前已知的唯一能夠在宿主基因組特異染色體位點整合的真核細胞病毒。這個發現產生了基因治療的新希望，AAV基因治療載體不僅僅能夠和非整合載體(如腺病毒為基礎的載體)相比更持續穩定地表達轉基因，而且能夠減少理論上的由于轉基因的隨機整合導致的插入突變幾率。

發明內容
本發明的目的是提供一種表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒和該重組腺相關病毒的制備方法以及本發明表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒為活性成分的藥物組合物，用以實現對高血壓病的基因治療，使表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒具有能驅動人類激肽釋放酶基因在體內長期表達，具有長期高效降低血壓、改善腎臟功能、預防中風等良好的生理和病理生理作用，可用于原發性高血壓、慢性腎功能不全及其他相關疾病的治療，且無副作用(無免疫源性)和感染效率高等特點。
本發明提供的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，包括編碼腺相關病毒Rep蛋白和Cap蛋白編碼序列的包裝質粒pXX2、經刪除腺病毒致病基因序列而保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因所得的輔助質粒pXX6和插入了人類激肽釋放酶編碼序列的真核表達載體，在包裝質粒pXX2的上游和下游各有一個啟動子序列，所說的真核表達載體為含有CMV啟動子的pXXUF1或pXXUF3，所說的人類激肽釋放酶基因為天然狀態的人類激肽釋放酶基因，或者為天然狀態的人類激肽釋放酶基因的突變體或人工修飾體。
本發明使用的載體系統是將天然腺相關病毒和腺病毒用分子生物學方法經一系列剪切和修飾而成，它們保留了腺相關病毒復制和轉錄所必需的部分，也保留了腺病毒的晚期基因輔助成份，其他多余的部分均已刪除，既能實現病毒長期穩定的潛伏感染，又能避免腺病毒的致病危險，而且腺病毒晚期基因的表達可以保證被克隆基因的表達效率。本發明的載體系統的構成如下pXX2(見附圖5)保留了AAV的cap基因和rep基因(此時得到pACG-2)，并在下游區域又插入了一個p5啟動子(在原來區域用XbaI和PstI切下，再連接到pACG-2的適當位置)。另外我們對照組所使用的報告基因(1acZ)也連在pXX2的下游。方法是先在pXX2下游造一個ClaI的切口，再在其切口上加一個Sse8387I的接頭(5’-CGCCTGCAGG-3’)，把兩端為PstI切口的lacZ片段連接于其上。
PXX6(見圖5)在腺病毒改造質粒pBHl0(已切掉了E1、E3基因和包裝信號)上用PmeI和SgfI切下一個8kb的片段(得到pXX5)，而pXX6則是由pXX5上用ClaI和SalI切下一段克隆入pBS中得到的，僅僅留下E2A、E4和VA編碼區。
pXXUF1和pXXUF3(見圖6)rAAV包裝所用的質粒pXXUF1和pXXUF3含有CMV啟動子(箭頭)所驅動的人gfp基因，它是將腺相關病毒的編碼基因全部刪除后再由NotI位點導入的。而pXXUF3又含有一個IRES啟動子。為了便于基因克隆和表達，將其加工成環狀。
本發明提供的制備表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒的方法包括(a)提供腺相關病毒包裝所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列-pXX2質粒，和刺激腺相關病毒復制和轉錄所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因-pXX6質粒；(b)提供含腺相關病毒基因組的真核表達載體pXXUF1，在該真核載體中腺相關病毒缺失cap蛋白和rep蛋白編碼區，并插入人類激肽釋放酶基因(human kallikrein)，形成重組質粒pXXUF1-HK；(c)將步驟a)中的pXX2、pXX6和步驟b)中的pXXUF1-HK共轉染293細胞；(d)回收，分離純化重組體。
本發明提供的藥物組合物由含有有效量的本發明提供的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒和藥學上可接受的載體或賦形劑構成，所說的載體可以是生理鹽水，即以生理鹽水為載體，按常規方法制成含有本發明表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒的注射用藥劑。


圖1為腺相關病毒的基因組構造2為ITR的序列及二級結構3、圖4為腺相關病毒的轉錄和翻譯圖5為pXX2、pXX6質粒構成圖6為pXXUF1和pXXUF3質粒主要構成部分圖7為pXXUF1-HK的質粒構成圖8為rAAV雜交與放射自顯影結果，上排為待測樣品，按體積比對倍稀釋，從左到右依次為10μl、5μl、2.5μl……；下排為標準品，按分子數對倍稀釋，從左到右依次為1011、5×1010、2.5×1010……；圖9為rAAV-HK注射后對SHR血壓的影響圖10、11為rAAV-HK注射后對SHR尿微量白蛋白的影響具體實施方式
實施例1人類激肽釋放酶(HK)cDNA的克隆及其與rAAV的重組和構建。
1)人類激肽釋放酶(HK)cDNA的克隆設計引物P1，5’-GCAGAATTCATGTGGTTCCTGG-3’；P2，5’-GACAAGCTTTTACTGGGGGTA-3’。由武漢生物合成公司合成。用TRIZOL試劑盒(購自GIBCO公司)自人體肝臟標本中提取總RNA，進行RT—PCR(試劑盒購自日本TAKARA公司)。PCR儀購自英國TECONE公司。并將產物與pXXUF1相連。HKcDNA將pXXUF1中的gfp基因所取代，pXXUF1-HK的質粒構成，如附圖7所示。
將HKcDNA測序，所得結果與從GeneBank中的結果相同。但是根據Kozak序列原理首先是啟動子下游第一個ATG常作為翻譯起始密碼子，其次是ATG臨近的3位通常是A/G，+4位是G，將任何一個3或+4的嘌呤換成嘧啶，翻譯量會減少5～10倍，若均換成嘧啶，則翻譯水平下降20倍。據此，提出(GCC)GCCA/GCCATGG是高等真核基因起始密碼子附近的保守序列。因此，我們對HKcDNA作了修飾，將天然狀態的人類激肽釋放酶基因的起始密碼ATG后第1位堿基由T改換為G，得到修飾后的HKcDNA，見本說明書后面的修飾后的HKcDNA序列表。
2、表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒的制備1)rAAV-HK與rAAV-LacZ重組病毒的包裝與回收pXX2、pXX6、pXXUF1-HK、pdx-LacZ的質粒的大量提取，所用大提試劑盒購自Promega公司。方法依說明書所述。
將293細胞(人腎母胚胎腫瘤細胞系)傳入數個150mm培養板中，傳代培養需要0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培養基、新生小牛血清(購自Gibco公司)。待細胞生長到60％到70％聚集度時，按摩爾比1∶1∶1將pXX2、pXX6、pXXUF1-HK(pdx-lacZ)用鈣磷轉染法轉入293細胞。轉染后48-72小時吸棄所有培養基，加入少量PBS緩沖液，刮取盤中293細胞，后-80℃凍存。
2)AAV-HK與rAAV-LacZ回收病毒的純化為祛除細胞中的異型蛋白，須用氯化銫梯度離心法提純，方法如下回收物反復凍融三次后，3000轉離心，祛除沉淀，上清液加1/3體積的(NH4)2SO4，進一步祛除蛋白質，4℃、5000轉/分離心10min后去上清。加2/3體積的(NH4)2SO4，混勻、4℃培育20min，再4℃、12000轉/分離心20min，取沉淀溶于20ml1.37g/ml的氯化銫溶液中。后288,000轉/分超速離心48小時。將離心管中的內容物分12-16節段，每一段用21-G型的針插入，從中收取10滴左右的液體，均用斑點雜交法測定滴度。
3)rAAV-HK與rAAV-LacZ滴度的測定-斑點雜交a)cDNA探針的標記和純化同位素標記的核苷酸α-P32購自北京雅輝公司。用NotI切下PCDNA3.1-HK中的HK片段做為已知序列的探針。隨機引物法標記HK片段并純化(試劑盒購自QIAGEN公司，按說明書方法操作)。
b)收物和定量標準的準備回收物經適量DnaseI和RNAse消化，消化細胞基因組的DNA、RNA。反應終止后再加ProteinseK，消化病毒的蛋白質外殼(以上試劑均購自日本TAKARA公司)。酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，祛除沉淀，上清中為病毒中的DNA。將上清按體積比對倍稀釋。標準物采用目的基因片段，即HK片段，測定濃度后按分子數對倍稀釋，并作加熱和堿變性處理。
c)雜交與放射自顯影配好斑點雜交裝置，并按裝置大小安置一塊0.45μm的尼龍膜，將待測病毒樣品和標準樣品按體積梯度和分子梯度分別上樣，上樣后將膜80℃干烤2小時，后42℃預雜交1小時(預雜交液購自INTERGEN公司)。再加加熱處理的標記探針，45℃雜交12-16小時。洗膜后-80℃放射自顯影2-3天。結果如圖8。此結果說明本發明制備的rAAV-HK具備足夠的滴度(1×1011p.f.u.)，可以用于動物實驗和臨床治療。
上述方法制備的重組腺相關病毒被命名為“表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒(rAAV-HK)”，2001年9月29日保藏于位于中國武漢的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No.V200109。
實施例2rAAV-HK對自發性高血壓大鼠(SHR)模型的降壓作用自發性高血壓大鼠模型購自上海高血壓病研究所，共12只大鼠分兩組，分別經尾靜脈注射rAAV-HK與rAAV-LacZ病毒，每只所用量為1×1011p.f.u。注射后每周測血壓，每半月收24小時尿。發現注射后第3-4周實驗組大鼠血壓開始下降，直至五個月后處死全部動物，結果見圖9。
實施例3rAAV-HK預防中風的作用注射基因后8-16周，對照組(rAAV-lacZ組)6只動物中有2只發生中風(經解剖證實)，其中一只為腦出血，另一只為多發性腦梗塞。而實驗組則全部無中風現象。
實施例4rAAV-HK改善腎功能的作用同時用ELISA法測尿微量白蛋白，發現多數實驗組大鼠的尿微量白蛋白量呈階梯形下降，結果見附圖10、11。
而將動物腎臟固定后切片，均作HE染色和Van Gieson染色，則發現注射基因后16周左右的對照組動物腎臟的腎單位明顯比實驗組動物減少，而且多數腎臟組織被纖維組織替代，而實驗組動物腎臟則無明顯變化。
實施例5rAAV-HK逆轉心血管系統的重構取動物心臟、血管固定后切片，均作HE和Van Gieson染色，比較兩組動物發現1)對照組動物的心臟從組織切面上看心室壁明顯增厚，而心室腔則明顯減小2)鏡下觀察，實驗組動物的心室肌肌束增粗，部分被纖維組織取代。3)主動脈的V-G染色初步結果證明，對照組動物血管壁中的膠原纖維分布明顯比實驗組動物多且廣范。
以上結果說明本發明提供的rAAV-HK病毒具有長期高效降低血壓、改善腎臟功能、預防中風等良好的生理和病理生理作用，可用于原發性高血壓、慢性腎功能不全及其他相關性疾病的臨床治療。
以下為本發明涉及的核苷酸序列表1.腺相關病毒的序列及具體分區ITR區 61 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg121 gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag 241 gtggtcacgc tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga301 ggtttgaacg cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg361 accttgacgg gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg421 aatgggagtt gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga481 ccgtggccga gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc541 cggaggccct tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc601 tcgtggaaac caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg661 aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg721 tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc781 ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac841 agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga901 cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc961 cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca1021 aggggattac ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca1081 atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta1141 tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt1201 ccagcaatcg gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt1261 ccgtctttct gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg1321 ggcctgcaac taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct1381 acgggtgcgt aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg1441 tgatctggtg ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc1501 tcggaggaag caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga1561 ctcccgtgat cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga1621 ccttcgaaca ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc1681 tggatcatga ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa1741 aggatcacgt ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa1801 gacccgcccc cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc 1921 gttctcgtca cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga1981 atcagaattc aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg2041 tgtcagaatc tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc2101 atcatatcat gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt2161 tggatgactg catctttgaa caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat 2281 cctggcccac caccaccaaa gcccgcagag cggcataagg acgacagcag gggtcttgtg2341 cttcctgggt acaagtacct cggacccttc aacggactcg acaagggaga gccggtcaac 2461 agacaacccg tacctcaagt acaaccacgc cgacgcggag tttcaggagc gccttaaaga2521 agatacgtct tttgggggca acctcggacg agcagtcttc caggcgaaaa agagggttct2581 tgaacctctg ggcctggttg aggaacctgt taagacggct ccgggaaaaa agaggccggt2641 agagcactct cctgtggagc cagactcctc ctcgggaacc ggaaaggcgg gccagcagcc2701 tgcaagaaaa agattgaatt ttggtcagac tggagacgca gactcagtac ctgaccccca2761 gcctctcgga cagccaccag cagccccctc tggtctggga actaatacga tggctacagg2821 cagtggcgca ccaatggcag acaataacga gggcgccgac ggagtgggta attcctccgg2881 aaattggcat tgcgattcca catggatggg cgacagagtc atcaccacca gcacccgaac2941 ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaaacaa atttccagcc aatcaggagc3001 ctcgaacgac aatcactact ttggctacag caccccttgg gggtattttg acttcaacag3061 attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcaaagactc atcaacaaca actggggatt3121 ccgacccaag agactcaact tcaagctctt taacattcaa gtcaaagagg tcacgcagaa3181 tgacggtacg acgacgattg ccaataacct taccagcacg gttcaggtgt ttactgactc3241 ggagtaccag ctcccgtacg tcctcggctc ggcgcatcaa ggatgcctcc cgccgttccc3301 agcagacgtc ttcatggtgc cacagtatgg atacctcacc ctgaacaacg ggagtcaggc3361 agtaggacgc tcttcatttt actgcctgga gtactttcct tctcagatgc tgcgtaccgg3421 aaacaacttt accttcagct acacttttga ggacgttcct ttccacagca gctacgctca3481 cagccagagt ctggaccgtc tcatgaatcc tctcatcgac cagtacctgt attacttgag3541 cagaacaaac actccaagtg gaaccaccac gcagtcaagg cttcagtttt ctcaggccgg3601 agcgagtgac attcgggacc agtctaggaa ctggcttcct ggaccctgtt accgccagca3661 gcgagtatca aagacatctg cggataacaa caacagtgaa tactcgtgga ctggagctac3721 caagtaccac ctcaatggca gagactctct ggtgaatccg gccatggcaa gccacaagga3781 cgatgaagaa aagttttttc ctcagagcgg ggttctcatc tttgggaagc aaggctcaga3841 gaaaacaaat gtgaacattg aaaaggtcat gattacagac gaagaggaaa tcggaacaac3901 caatcccgtg gctacggagc agtatggttc tgtatctacc aacctccaga gaggcaacag3961 acaagcagct accgcagatg tcaacacaca aggcgttctt ccaggcatgg tctggcagga4021 cagagatgtg taccttcagg ggcccatctg ggcaaagatt ccacacacgg acggacattt4081 tcacccctct cccctcatgg gtggattcgg acttaaacac cctcctccac agattctcat4141 caagaacacc ccggtacctg cgaatccttc gaccaccttc agtgcggcaa agtttgcttc4201 cttcatcaca cagtactcca cgggacacgg tcagcgtgga gatcgagtgg gagctgcaga4261 aggaaaacag caaacgctgg aatcccgaaa ttcagtacac ttccaactac aacaagtctg4321 ttaatcgtgg acttaccgtg gatactaatg gcgtgtattc agagcctcgc cccattggca4381 ccagatacct gactcgtaat ctgtaattgc ttgttaatca ataaaccgtt taattcgttt4441 cagttgaact ttggtctctg cgtatttctt tcttatctag tttccatggc tacgtagata 4561 cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg4621 gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa2.人類激肽釋放酶cDNA序列(錄自GENEBANK)tcctccacctgctggcccctggacacctctgtcaccatgtggttcctggttctgtgcctcgccctgtccctgggggggactggtgctgcgcccccgattcagtcccggattgtgggaggctgggagtgtgagcagcattcccagccctggcaggcggctctgtaccatttcagcactttccagtgtgggggcatcctggtgcaccgccagtgggtgctcacagctgctcattgcatcagcgacaattaccagctctggctgggtcgccacaacttgtttgacgacgaaaacacagcccagtttgttcatgtcagtgagagcttcccacaccctggcttcaacatgagcctcctggagaaccacacccgccaagcagacgaggactacagccacgacctcatgctgctccgcctgacagagcctgctgataccatcacagacgctgtgaaggtcgtggagttgcccacccaggaacccgaagtggggagcacctgtttggcttccggctggggcagcatcgaaccagagaatttctcatttccagatgatctccagtgtgtggacctcaaaatcctgcctaatgatgagtgcgaaaaagcccacgtccagaaggtgacagacttcatgctgtgtgtcggacacctggaaggtggcaaagacacctgtgtgggtgattcagggggcccgctgatgtgtgatggtgtgctccaaggtgtcacatcatggggctacgtcccttgtggcacccccaataagccttctgtcgccgtcagagtgctgtcttatgtgaagtggatcgaggacaccatagcggagaactcctgaacgcccagccctgtcccctacccccagtaaaatcaaatgtgcatcc
3.修飾后的HKcDNAtcctccacctgctggcccctggacacctctgtcaccatggggttcctggttctgtgcctcgccctgtccctgggggggactggtgctgcgcccccgattcagtcccggattgtgggaggctgggagtgtgagcagcattcccagccctggcaggcggctctgtaccatttcagcactttccagtgtgggggcatcctggtgcaccgccagtgggtgctcacagctgctcattgcatcagcgacaattaccagctctggctgggtcgccacaacttgtttgacgacgaaaacacagcccagtttgttcatgtcagtgagagcttcccacaccctggcttcaacatgagcctcctggagaaccacacccgccaagcagacgaggactacagccacgacctcatgctgctccgcctgacagagcctgctgataccatcacagacgctgtgaaggtcgtggagttgcccacccaggaacccgaagtggggagcacctgtttggcttccggctggggcagcatcgaaccagagaatttctcatttccagatgatctccagtgtgtggacctcaaaatcctgcctaatgatgagtgcgaaaaagcccacgtccagaaggtgacagacttcatgctgtgtgtcggacacctggaaggtggcaaagacacctgtgtgggtgattcagggggcccgctgatgtgtgatggtgtgctccaaggtgtcacatcatggggctacgtcccttgtggcacccccaataagccttctgtcgccgtcagagtgctgtcttatgtgaagtggatcgaggacaccatagcggagaactcctgaacgcccagccctgtcccctacccccagtaaaatcaaatgtgcatcc
權利要求
1.一種表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，其特征在于，它包括編碼腺相關病毒Rep蛋白和Cap蛋白編碼序列的包裝質粒pXX2、經刪除腺病毒致病基因序列而保留了腺病毒E1A、E2A和VA1RNA基因所得的輔助質粒pXX6和插入了人類激肽釋放酶編碼序列的真核表達載體，在包裝質粒pXX2的上游和下游各有一個啟動子序列。
2.根據權利要求1所述的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，其特征在于，所說的在包裝質粒pXX2的上游和下游的啟動子序列為p5啟動子序列。
3.根據權利要求1、2所述的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，其特征在于，所說的真核表達載體為含有CMV啟動子的pXXUF1或pXXUF3。
4.根據權利要求1、2所述的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，其特征在于，所說的人類激肽釋放酶基因為天然狀態的人類激肽釋放酶基因或其突變體或人工修飾體。
5.根據權利要求3所述的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，其特征在于，所說的人類激肽釋放酶基因為天然狀態的人類激肽釋放酶基因突變體或人工修飾體。
6.根據權利要求4所述的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，其特征在于，所說的人類激肽釋放酶基因的人工修飾體是將天然狀態的人類激肽釋放酶基因的起始密碼ATG后第1位堿基由T改換為G后得到的核苷酸酸序列。
7.根據權利要求5所述的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，其特征在于，所說的人類激肽釋放酶基因的人工修飾體是將天然狀態的人類激肽釋放酶基因的起始密碼ATG后第1位堿基由T改換為G后得到的核苷酸酸序列。
8.根據權利要求6、7所述的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，其特征在于，它是保藏于中國典型培養物保藏中心的表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒rAAV-HK，CCTCC No.V200109。
9.一種制備表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒的方法，包括(a)提供腺相關病毒包裝所必需的Rep蛋白和Cap蛋白的編碼序列-pXX2質粒，和刺激腺相關病毒復制和轉錄所必需的腺病毒E1A、E2A和VAI RNA基因-pXX6質粒；(b)提供含腺相關病毒基因組的真核表達載體pXXUF1，在該真核載體中腺相關病毒缺失cap蛋白和rep蛋白編碼區，并插入人類激肽釋放酶基因(human kallikrein)，形成重組質粒pXXUF1-HK；(c)將步驟a)中的pXX2、pXX6和步驟b)中的pXXUF1-HK共轉染293細胞；(d)回收，分離純化重組腺相關病毒。
10.一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有有效量的權利要求1至8所述的任何一種表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒和藥學上可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發明提供了一種表達人類激肽釋放酶的重組腺相關病毒，該重組腺相關病毒的制備方法和用途，以及含有該重組腺相關病毒的藥物組合物，該重組腺相關病毒能驅動人類激肽釋放酶基因在體內長期表達，具有長期高效降低血壓、改善腎臟功能、預防中風等良好的生理和病理生理作用，可用于原發性高血壓、慢性腎功能不全及其他相關性疾病的臨床治療。
文檔編號A61P9/12GK1412303SQ0113357
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月18日 優先權日2001年10月18日
發明者汪道文, 李宏偉, 王濤 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院