專利名稱：含核酸的復合物的制作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及含核酸的復合物，其特征在于含有核酸和帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物，本發明還涉及控制復合物的核酸釋放速率的方法。
本發明還涉及包含有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物的吞噬細胞(phagocytic cells)(之后稱作吞噬細胞(phagocytes))。本發明還涉及含有該含核酸復合物作為活性成分并且可以用于吞噬細胞介導的基因治療的藥物。
相關領域描述近年來，隨著人類疾病的分子遺傳因素的明朗化，越來越多的重點被放在基因治療研究上。基因治療的目的是在靶位點或細胞表達DNA。對于該治療，有利的是，直接將DNA帶到靶位點或細胞處，使之有效地轉移至靶位點或細胞中，并在特異位點或在細胞中作功能性表達。已經報道了多種用于有效轉移和表達外源DNA的方法(Fumimaro Takaku編，“Idenshichiryo no SaizensenKisogijutu kara Rinsho Oyo made(基因治療前沿，從基礎技術到臨床應用)”，Experimental Medicine，第12卷，第15期，1994；Robert E.Sobol和Kevin J.Scanlon，基因治療的互聯網書籍(The Internet Book of Gene Therapy)，Appleton&LangeStamford，Connecticut，1995)。可以將它們粗略地分為(1)用于DNA轉移的物理方法(顯微注射、電穿孔)、(2)用于DNA轉移的化學方法(磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖轉染)、和(3)生物學方法(病毒載體，如逆轉錄病毒載體和腺病毒載體)。一般地，現有化學方法，如磷酸鈣轉染和DEAE-葡聚糖轉染，的基因轉移效率低。物理方法，如顯微注射和電穿孔，可能要求特殊的設備，并且它們對于常規臨床使用是不實際的。由于病毒載體的高基因轉移效率，人們期望發現它的臨床用途。然而，由于它們的病毒本質，這些載體有產生不良反應如免疫反應的危險。
為了克服以上缺點，已開發了新的技術。脂質體方法將基因摻入脂質體中以保護基因免遭失活或降解。脂質體不含病毒DNA，由此排除了發生潛在的危險重組事件的可能性。然而，它們對多種細胞類型具有的強毒性限制了脂質體作為DNA載體的用途。甚至現在新的基因遞送物質和手段仍在不斷的開發中。
在血管損傷的基因治療領域，還開發了所謂的水凝膠法，該方法包括將水凝膠附著在待導入血管的導管的表面、將質粒基因放置在該水凝膠中、并直接將該水凝膠涂在血管內(Marchall，E.，Science，269，1050-1055，1995)。根據該方法，質粒通過簡單擴散緩慢地從水凝膠中釋出。采用該方法，一般而言，緩釋期短，且難于控制該時期的釋放速率和時間長度。基因治療要求治療性基因的量或其供給期可以隨待治療的疾病或疾病的狀態得到調節。因此，需要一種方法能夠根據治療的要求控制治療性基因的緩釋期。
當在臨床背景如基因治療中使用外源基因時，以穩定水平持續向靶位點提供該基因是該基因進行功能性表達所必需的。
而且，對采用反義寡核苷酸進行的基因治療的研究近年來已吸引了人們的注意力。在受控的時間期內位點特異性地體內穩定提供這些核酸的手段將增加該方法的有效性。
發明概述本發明的一個目的是提供安全的、可以高效地將核酸導入細胞、并能夠向靶位點持續提供核酸的含核酸復合物，以及提供方法控制該含核酸復合物的核酸釋放速率。
本發明的另一目的是提供安全、易于操作且擅長體內位點特異性功能表達的含核酸復合物，以及采用該含核酸復合物可以特異地在靶位點展示核酸的功能的方法。
本文所用短語“核酸的功能”是指核酸所編碼的基因的表達，但它也可以指直接發揮作用的核酸。直接發揮作用的核酸的例子包括反義核苷酸(Robert E.Sobol和Kevin J.Scanlon，基因治療互聯網書籍，Appleton&Lange Stamford，Connecticut，1995)、核酶(美國專利6,127,173)、能夠發揮誘鉺作用的雙鏈DNA分子(Sobol，同上)、和DNA/RNA雜合體(Bartlett等，(2000)Nat.Biotech.18615)。
根據這些目的，本發明的發明人進行了深入的研究并獲得了下列發現。首先，通過將帶負電荷的核酸和帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物復合在一起形成穩定的復合物，可以抑制核酸的體內降解，并且可以在期望的靶位點或細胞處以恒定的速率釋放該核酸。其二，通過核酸和生物可降解聚合物的復合獲得的復合物，如本文所述含核酸的復合物，可以容易地被免疫系統中扮演著重要角色的吞噬細胞攝取(首先，復合物靶向吞噬細胞)。攝取了復合物的吞噬細胞遷移至靶位點(其次，吞噬細胞靶向靶位點)，由此吞噬細胞通過使所加入核酸的作用靶向靶位點而增加該技術的有效性。基于這些發現，本發明人完成了本發明。
一方面，本發明涉及含有核酸和帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸復合物，其中該核酸可以通過該生物可降解聚合物的降解得到釋放。
另一方面，本發明涉及含有核酸和在聚合物中加入了帶正電荷基團的帶正電荷水不溶性生物可降解聚合物的含核酸復合物。
在本發明的含核酸復合物中，該帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物含有至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和所有這些物質的衍生物。優選地，該衍生物是氨基衍生物。
在一個優選實施方案中，該帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物是具有引入的帶正電荷基團的交聯明膠。在另一優選實施方案中，該核酸是至少一個選自下組的成員質粒DNA、寡核苷酸、和雙鏈核酸化合物。
在一個優選實施方案中，該核酸編碼多肽，其包含至少一個選自下組的成員血管內皮生長因子基因、肝細胞生長因子基因、和成纖維細胞生長因子基因、以及其它基因如激酶、磷酸酶、轉錄因子、細胞因子、蛋白酶、細胞凋亡誘導因子和細胞凋亡阻滯因子。更優選地，該DNA包含序列表中SEQ ID NO.1所示編碼FGF4/HST1的堿基序列。
另一方面，本發明涉及包含本發明的含核酸復合物作為活性成分的藥物組合物。在一個優選實施方案中，該藥物組合物被用于基因治療，尤其是通過局部施用基因進行的基因治療。
再一方面，本發明涉及控制核酸釋放速率的方法，其特征在于將核酸摻入帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物中、并通過該生物可降解聚合物的降解釋放該核酸。
另一方面，本發明涉及控制核酸釋放速率的方法，其特征在于將核酸摻入具有引入的帶正電荷基團的帶正電荷水不溶性生物可降解聚合物中，并通過該生物可降解聚合物的降解釋放該核酸。
另一方面，本發明涉及增強核酸的功能性表達的方法，其特征在于將核酸摻入帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物中，并通過該生物可降解聚合物的降解釋放該核酸，以展示核酸的功能。本發明還涉及增強核酸的功能性表達的方法，其特征在于將核酸摻入具有引入的帶正電荷基團的帶正電荷水不溶性生物可降解聚合物中，并通過該生物可降解聚合物的降解釋放該核酸，以展示核酸的功能。
在一個優選實施方案中，帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物具有至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和所有這些物質的衍生物(例如氨基衍生物)。優選地，帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物是具有引入的帶正電荷基團的交聯明膠。核酸是至少一個選自下組的成員編碼基因的DNA、寡核苷酸、和雙鏈核酸化合物。核酸可以編碼血管內皮生長因子基因、肝細胞生長因子基因、和成纖維細胞生長因子基因、以及其它基因如激酶、磷酸酶、轉錄因子、細胞因子、蛋白酶、細胞凋亡誘導因子和細胞凋亡阻滯因子。在一個優選實施方案中，DNA分子包含序列表中SEQ ID NO.1所示堿基序列。
再一方面，本發明涉及包含有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物的吞噬細胞。在一個優選實施方案中，該生物可降解聚合物具有至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和所有這些物質的衍生物。
再一方面，本發明涉及在靶位點展現核酸功能的方法，該方法至少包括步驟(i)允許吞噬細胞攝取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物，(ii)使攝取的核酸能夠行使其功能或誘導核酸在吞噬細胞中表達，并將該吞噬細胞遞送至靶位點。優選地，該生物可降解聚合物是至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和所有這些物質的衍生物。
再一方面，本發明涉及含有含核酸復合物作為活性成分的基因治療用藥物組合物，該含核酸復合物中含有核酸和生物可降解聚合物，其中該基因治療至少包括步驟(i)允許吞噬細胞攝取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物，(ii)使攝取的核酸能夠行使其功能或誘導核酸在吞噬細胞中表達，和(iii)將該吞噬細胞遞送至靶位點。在一個優選實施方案中，該生物可降解聚合物具有至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和所有這些物質的衍生物。
附圖簡述

圖1是顯示明膠水凝膠的三維晶格與質粒DNA的離子鍵合的示意圖。
圖2顯示了隨著時間的推移lacZ質粒摻入明膠水凝膠的過程。
圖3顯示了在給ddY小鼠的右股肌肉施用后，明膠水凝膠結合的質粒DNA的體內存活情況研究結果。該存活通過放射性碘的殘存放射活性得到證實。
圖4顯示了顯微照片，這些照片證明，在施用顆粒性胺化明膠水凝膠結合的lacZ質粒后兩周lacZ基因在兔下肢缺血模型中表達。圖4A顆粒性胺化明膠水凝膠結合的lacZ質粒(lacZ質粒500μg)。圖4B未與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的裸lacZ質粒(500μg)。圖4C顆粒性胺化明膠水凝膠結合的lacZ質粒(lacZ質粒50μg)。
圖5顯示顯微照片，這些照片證明，借助腺病毒載體施用lacZ基因后lacZ基因在兔下肢缺血模型中表達。圖5A施用lacZ基因后3天。圖5B施用lacZ基因后兩周。
圖6A-D顯示放射顯影圖，這些圖證明，在施用FGF4/HST1質粒后兔下肢缺血模型中有血管生成。圖6A顆粒性胺化明膠水凝膠結合的FGF4/HST1質粒(500μg)。圖6B顆粒性胺化明膠水凝膠結合的FGF4/HST1質粒(5μg)。圖6C顆粒性胺化明膠水凝膠結合的lacZ質粒(500μg)。圖6D未與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的裸FGF4/HST1質粒(500μg)。
圖7是顯微照片，該照片顯示了lacZ在兔動脈管壁的巨噬細胞中的表達。并指出具有表達的lacZ的巨噬細胞(箭頭)。
圖8是通過放射微血管造影術獲得的出現在顯示器上的中間色調圖象照片，顯示了基線(頂圖)和血管舒張(腺苷處理)期間(底圖)的血管密度。給出了施用裸VEGF165質粒后的結果。
圖9是通過放射微血管造影術獲得的出現在顯示器上的中間色調圖象照片，顯示了基線(頂圖)和血管舒張(腺苷處理)期間的血管密度。給出了施用明膠水凝膠結合的VEGF165質粒后的結果。
圖10顯示了顯微照片，這些照片證明巨噬細胞攝取了交聯明膠顆粒-GFP質粒。圖10A顯示了相差圖像，而圖10B顯示了圖10A相同區域的熒光圖像。在巨噬細胞中觀察到熒光，這說明交聯的明膠顆粒-GFP質粒已進入巨噬細胞中。
圖11顯示了向人樹突細胞(DC)的基因轉移效率的FACS分析結果。圖11A與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的GFP質粒一起培養的DC的結果。圖11B與裸GFP質粒一起培養的DC的結果。
優選實施方案詳述可以摻入本發明復合物中的核酸并不受限制。然而，優選實施方案是導入可帶來治療效果的核酸，并且可以根據復合物的使用目的按意愿選擇它們。在本發明中，除了各種編碼基因的DNA外，還可以優選使用針對某些基因的反義寡核苷酸、和雙鏈核酸化合物如誘餌核酸(decoynucleic aid)(Sobol，同上)。還可以遞送核酸結構以糾正點突變(Bartlett等(2000)Nat.Biotech.18615)。更具體地，表1列出了可以摻入本發明的含核酸復合物中用于心血管領域的基因治療和癌癥的基因治療的核酸、以及它們的治療目的。然而，本發明并不局限于它們，且正如本領域技術人員已知的，可以將本發明應用于其它臨床領域。
表1
可摻入本發明含核酸復合物中的核酸的優選實例是血管內皮細胞生長因子基因、肝細胞生長因子基因、和成纖維細胞生長因子基因。其它的此類基因是本領域技術人員已知的，包括激酶、磷酸酶、轉錄因子、細胞因子、蛋白酶、細胞凋亡誘導因子和細胞凋亡阻滯因子。可以引用具有序列表中SEQ ID NO.1所示堿基序列的FGF4/HST1基因作為成纖維細胞生長因子基因的例子。
FGF4/HST1基因經分離后被確定是一種具有轉化NIH3T3細胞活性的基因(hst-1；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，833997-4001，1986)。之后，發現該基因與成纖維細胞生長因子(FGF)有同源性，并成為FGF家族的第4個成員(FGF4)。目前，已知FGF家族的20名成員，FGF 1-20。
FGF4/HST1蛋白是具有信號肽的分泌蛋白，已經報道它具有以下活性促進成纖維細胞和血管內皮細胞生長；血管生成；促進巨核細胞生長和分化；促進巨核細胞分泌細胞因子；促進巨核細胞和內皮細胞間的粘著；體外誘導外周血小板計數增加；在化療或放療引起的血小板減少癥模型中，通過預先施用減緩血小板的降低并縮短恢復期；和通過預先施用增加致死性放射劑量處理后的存活率。
當將FGF4/HST1基因應用于基因治療時，人們嘗試過使用其中整合了該基因的腺病毒載體治療動脈硬化引起的慢性穩定性心絞痛(間接療法，Collateral Therapeutics)。
在本發明中，核酸以可導入細胞并能夠在細胞中表現出功能的形式使用。例如，對于DNA，可以使用其中定位有該DNA的質粒，以便該DNA在其導入的細胞中得以轉錄，然后可以產生該DNA編碼的多肽，并通過該多肽展示出期望的功能。優選地，將啟動子區、起始密碼子、編碼具有目的功能的蛋白質的DNA、終止密碼子、和終止區連續地安排在質粒中。這些技術和DNA元件是本領域技術人員熟知的。
如果需要的話，可以在一個質粒中摻入兩個或更多個核酸。而且，如果需要的話，可以將兩個或更多個核酸獨立地與水不溶性生物可降解聚合物相連接(如下述)，以形成一種含核酸復合物。
方便地，可以借助適合的限制性酶位點，通過將期望的核酸插入本領域可獲得的質粒中，制備目的載體。還可以通過合成手段或半合成手段基于待導入的核酸的堿基序列，制備載體。這些技術均是本領域技術人員熟知的。例如“分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Sambrook，Fritsch和Maniatis編，1989中所述的技術，該書被完整地(包括所有的數字、表或圖)并入本文作為參考。
本發明中，待導入核酸的“細胞”優選是需要該核酸在其中作功能性表達的細胞，以及具有攝取細胞外物質(即吞噬作用)特性的細胞。在優選實施方案中，這些細胞是吞噬細胞如巨噬細胞，描述如下。可以例如根據所使用的核酸(即其功能)，以不同方式選擇核酸應當在其中進行功能性表達的細胞。實例是心肌細胞、骨骼肌細胞、和血管內皮細胞。吞噬細胞如單核細胞、樹突細胞、巨噬細胞、組織細胞、枯否細胞、破骨細胞、A型滑膜細胞(Synovial A cells)、小膠質細胞、郎格漢斯細胞、上皮樣細胞、和多核巨細胞；白細胞；成纖維細胞；和某些上皮細胞(胃腸道上皮細胞、腎小管上皮細胞)可以通過吞噬作用有效地將含核酸復合物攝入它們的內部(首先，使該含核酸復合物靶向吞噬細胞)，并且借助于它們的體內遷移性質它們有利于將該核酸遞送至目的位點(其次，使吞噬細胞靶向靶位點和細胞)。由此，所有的器官或組織，如心臟、肌肉、血管、血液、骨髓、淋巴組織、結締組織、肝、骨、滑膜、神經、皮膚、炎癥組織、或癌組織，均可以接受基因治療。
本發明中，“生物可降解聚合物”是指由于體內存在的生理活性物質，如酶，的作用而第一次被水解的聚合物。生物可降解聚合物的實例是多糖如殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和果膠，蛋白質如明膠、膠原、纖維蛋白和白蛋白，及這些物質的衍生物。優選的例子是明膠或其衍生物。為了本說明書的目的，“生物可降解聚合物”不包括核酸。在本發明中，如上所述，“生物可降解聚合物的降解”是指聚合物在體內存在的生理活性物質如酶的作用下、或在體內的非酶性作用下水解。
此處，“衍生物”是指適于形成含核酸復合物的生物可降解聚合物的修飾形式，包括例如在聚合物上引入了氨基基團的氨基衍生物，見下述。
本發明中，如果需要更強地控制含核酸復合物的核酸釋放，則與核酸形成復合物的生物可降解聚合物優選是水不溶性的。此處，水不溶性是指由于分子間的化學或物理交聯而不在水中溶解的性質。根據日本藥典的規定，水不溶性相當于“少量溶解”至“事實上不溶”。
生物可降解聚合物并不限于某一組分子，只要它可以與核酸形成復合物即可。如果希望獲得持續釋放，則聚合物應優選帶有正電荷，以便形成穩定的含核酸復合物。可以改變正電荷的攜帶程度，以便允許聚離子(polyion)與正常帶負電荷的核酸形成復合物。可以通過測量將水溶性狀態存在的成分在水中混合后獲得的混合物的混濁度增加，驗證聚離子復合物的形成。
核酸的負電荷和生物可降解聚合物的正電荷之間的強結合(離子鍵合)導致形成穩定的含核酸復合物。如果在本發明中使用中性或僅輕微帶正電荷的生物可降解聚合物，則可以通過預先在其中引入氨基基團或諸如此類的基團，使該聚合物陽離子化。甚至在已經帶有正電荷的生物可降解聚合物中，也可以引入正電荷基團如氨基基團。這樣，就增加了整個分子的正電荷，并增強了與核酸的結合，以致可以形成更為穩定的含核酸復合物。賦予陽離子的過程可以通過本領域技術人員已知的方法來實施。
賦予陽離子的方法并不受限制，只要該方法可以引入在生理條件下帶陽離子的官能團即可。一個優選方法是在溫和條件下，在已是生物可降解聚合物一部分的羥基基團或羧基基團上引入氨基基團或銨基。該方法的一個實例包括采用多種縮合劑中的任意種使聚合物與烷基二胺如乙二胺或N，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷、乙酰肼三甲基銨、精胺、亞精胺、或二乙基氨基氯反應，其中所述縮合劑的例子是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、氰尿酰氯、N，N’-碳化二咪唑(carbodiimidazole)、溴化氰、雙環氧化合物、甲苯磺酰氯、二酐化合物如二乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-戊酸二酐、或三苯甲基氯。在一個優選實施方案中，由于乙二胺的方便性和通用性，該方法涉及與乙二胺的反應。
本發明中，“引入帶正電荷基團”的步驟是指引入使生物可降解聚合物在生理條件下為陽離子的官能團。這就意味著在生物可降解聚合物上引入上述官能團。
而且，在本發明中，為了能夠控制核酸的釋放，還優選通過交聯處理或其它類似的有效處理使該生物可降解聚合物不溶于水。一般地，許多生物可降解聚合物都是水溶性的，因此所獲的含核酸復合物也是水溶性的。當體內施用該復合物時，核酸會快速地自復合物中釋出，由此難于獲得穩定而持久的局部核酸供應。本發明采用水不溶性生物可降解聚合物，這就使得可以根據體內該生物可降解聚合物的降解性以可控制的方式釋放核酸。即，可以根據生物可降解聚合物的降解控制核酸持續釋放的速率。而且，該持續釋放形式使得可以增加含核酸復合物的局部基因表達效率。
在優選實施方案中，用于本發明的水不溶性生物可降解聚合物是通過交聯形成的不溶于水的明膠水凝膠。在更優選的實施方案中，明膠水凝膠具有85％、88％、91％、94％、95％、97％、99％、或更多的水含量。
生物可降解聚合物的交聯可以通過本領域技術人員已知的方法進行。例子有使用交聯劑的方法、熱處理、和使用紫外輻射的方法。
可以根據采用的生物可降解聚合物的類型選擇優選的交聯劑。通常，使用以下交聯劑甲醛、戊二醛、水溶性碳二亞胺類[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、1-環己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺-N-甲基-對-甲苯磺酸鹽等]、表氯醇、和雙環氧化合物[雙環氧二乙二醇、1，4-雙-(2，3-環氧丙氧基)-丁烷等]。在交聯反應中，生物可降解聚合物的濃度按重量計為1-30％、優選按重量計為5-10％，而交聯劑的濃度按重量計為10-3-10％、優選按重量計為10-2-1％。反應在0-40℃，優選25-30℃，進行1-48個小時，優選12-24個小時。
還可以通過熱處理實現生物可降解聚合物的交聯。熱交聯的方法將以明膠為例子在以下實例中進行描述。
將明膠水溶液(優選地，按重量計約10％)澆注在塑料平皿中，并空氣干燥以獲得明膠膜。將該膜在110-160℃(優選120-150℃)的溫度、減壓(優選約10mmHg的減壓)下，放置1-48小時，優選6-24小時，籍此使膜發生熱交聯。
當采用紫外線使明膠膜交聯時，通常在0-40℃、優選室溫下將明膠膜放置在殺菌燈下。
所用明膠可以是具有不同物理性質，如溶解性、穩定性和溶脹性質，的明膠的混合物。也可以使用物理性質不同的交聯明膠的混合物。
待摻入本發明含核酸復合物中的帶正電荷水不溶性生物可降解聚合物可以以如下方式摻入該復合物中可以將具有上述特性的生物可降解聚合物單獨地摻入其中，或將兩種或更多種類型的生物可降解聚合物以混合物的形式摻入其中(將它們簡單地混合以便摻入相同的含核酸復合物中)。或者，可以通過化學方法預先將兩種或更多種類型的生物可降解聚合物鍵合在一起，然后摻入復合物中。本發明包括所有這些實施方案。
為了通過化學方法預先將兩種或更多種類型的生物可降解聚合物鍵合在一起，然后將該鍵合產物摻入復合物中，可以分別賦予各生物可降解聚合物水不溶性，然后通過化學方法將它們鍵合在一起；或者可以通過化學方式將這些聚合物鍵合在一起后再賦予其水不溶性。在優選實施方案中，首先通過化學方法將各生物可降解聚合物鍵合在一起，然后進行處理以使它們具有水不溶性。
本發明中，含有核酸和帶正電水不溶性生物可降解聚合物的復合物可以容易地通過混合前述核酸和前述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物來制備。核酸和帶正電荷水不溶性生物可降解聚合物的量之間的比例可以根據所用生物可降解聚合物的正電荷攜帶程度而不同。通常在混合過程中，相對于生物可降解聚合物，使用飽和濃度的核酸。
在一個優選實施方案中，為了制備在交聯明膠凝膠中含有核酸的含核酸復合物，直接將交聯劑加入按重量計5％-30％的明膠水溶液中，以制備交聯明膠凝膠。在一個更優選的實施方案中，將未交聯的明膠凝膠滴加在交聯劑水溶液中以制備交聯的明膠凝膠。然后直接將所獲交聯明膠凝膠滴加至含有核酸的溶液中。在一個優選實施方案中，干燥該交聯的明膠凝膠，然后使之在含有核酸的溶液中再次溶脹。
帶強負電荷的核酸與帶正電荷的生物可降解聚合物通過離子鍵結合，形成復合物。在本發明的該復合物中，摻入復合物中的核酸的特征在于其通過生物可降解聚合物在酶作用下、或其它生理過程作用下的降解從復合物中釋出。圖1顯示了復合物的示意圖，其中以DNA作為核酸的例子。
在核酸形成復合物的過程中，如果需要的話，為了例如所獲含核酸復合物的穩定性、核酸的持續釋放、和所釋放核酸的功能性表達，可以加入其它成分。這些其它成分的例子是氨基糖或它們的大分子化合物或脫乙酰殼多糖寡聚物、堿性氨基酸或它們的寡聚物或大分子化合物、和堿性聚合物如聚烯丙胺、聚二乙基氨基乙基丙烯酰胺、和聚乙烯亞胺。而且，還可以加入能夠和以器官特異性方式表達的受體結合的配體蛋白質、或特異指向所選靶標的抗體，籍此使得可能將含核酸復合物遞送至期望位點，最終實現核酸的定位釋放。這些配體和/或抗體是本領域技術人員熟知的。
本發明還涉及控制核酸釋放速率的方法，其特征在于將核酸摻入帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物中，并允許核酸在生理環境下釋放。
對于可以在根據本發明控制核酸釋放速率的方法中使用的核酸和帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物而言，此處指出的所有那些生物可降解聚合物和核酸，以及本領域技術人員已知的其它生物可降解聚合物和核酸均可以使用。
摻入復合物中的核酸由于水不溶性生物可降解聚合物在體內的降解而自復合物中緩慢釋出(換言之，降解速率決定釋放速率)。優選僅通過生物可降解聚合物的介導來實現該釋放，因為這樣將能夠使釋放速率的控制更具有可重復性。釋放速率與復合物中核酸和生物可降解聚合物之間的鍵合強度、以及復合物的穩定性、和所用生物可降解聚合物的生物可降解程度(這又可能取決于生物可降解聚合物的水含量)緊密相關。釋放速率還可以受復合物中正電荷和負電荷間的平衡所控制。通常，所用生物可降解聚合物的正電荷越高，所獲含核酸復合物中的核酸就保留得越久。因此，就通過水不溶性生物可降解聚合物的降解產生的核酸受控釋放而言，具有更高正電荷的生物可降解聚合物是更佳的。如果生物可降解聚合物的正電荷不足以使釋放受到控制時，可以再向聚合物中引入氨基基團或類似取代基以使聚合物陽離子化，籍此增加它的正電荷。
本發明還提供包含有含核酸復合物的吞噬細胞，其中該含核酸復合物含有核酸和生物可降解聚合物。其基礎是以下新發現該復合物可以容易地被免疫系統中起著重要作用的吞噬細胞所攝取(首先，使復合物靶向吞噬細胞)，而且這些吞噬細胞可以基于其正常的體內遷移被運至靶位點(其次，使吞噬細胞靶向靶位點)，因此使得可以容易地在靶位點穩定地展示核酸的功能。用于本發明的吞噬細胞不受限制，只要它們是具有吞噬作用并可遷移至損傷處(如炎癥部位、癌組織等)的細胞即可。例如，巨噬細胞和單核細胞是該細胞的優選實例。而且，樹突細胞、組織細胞、枯否細胞、破骨細胞、A型滑膜細胞、小膠質細胞、郎格漢斯細胞、上皮樣細胞、和多核巨細胞也是優選的，盡管它們僅有最低限度的遷移。含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物可以容易地通過吞噬作用被攝取至吞噬細胞中。吞噬細胞對含核酸復合物的攝取可以根據使用目的在原位發生、或體外進行。
對于摻入所用含核酸復合物中的核酸和生物可降解聚合物，本文列出的所有那些生物可降解聚合物均可以使用。生物可降解聚合物的電荷性質和溶解性均不受限制。從易被吞噬細胞攝取、攝取的效率和攝取的速度來看，該生物可降解聚合物優選具有水不溶性。鑒于與核酸牢固鍵合對于可靠結合核酸是理想的，該生物可降解聚合物優選帶正電荷。術語“水不溶性”和“帶正電荷”旨在具有前述的相同意義。
包含有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物的吞噬細胞可以用于實驗目的，也可以優選用作藥物。即，可以體外制備包含有含核酸復合物的吞噬細胞，然后體內施用所獲吞噬細胞，籍此可以通過利用吞噬細胞在損傷或其它患病部位的特征性聚集，使來自核酸的目的遺傳信息在靶位點表達。
本發明還提供以靶位點特異性方式展示核酸功能的方法，該方法至少包括步驟(i)允許吞噬細胞攝取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物，(ii)誘導該核酸在吞噬細胞中表達，和(iii)將吞噬細胞遞送至靶位點。以下將對每一步進行描述。(i)允許吞噬細胞攝取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物的步驟如前述，該步驟通過利用吞噬細胞固有的吞噬作用使含核酸復合物進入吞噬細胞中來實現。可以通過預先體外混合含核酸復合物和吞噬細胞、或通過體內施用含核酸復合物并利用體內吞噬細胞對它的攝取，來實現該步驟。在體外含核酸復合物與吞噬細胞的混合比例并不受限制，可以是吞噬細胞能夠攝取含核酸復合物的任何比例。通常，該步驟通過加入過量的含核酸復合物來進行。可以根據含核酸復合物和本發明藥物(見下述)的施用方式，體內施用含核酸復合物、或在體內條件下施用體外制備的吞噬細胞。為了本發明的目的，這些體外制備的具有含核酸復合物的吞噬細胞也可以被認為是藥物。當向活生物體施用包含有含核酸復合物的本發明吞噬細胞時，必需在施用的同時維持吞噬細胞生活力和活性。可以采用適用于骨髓移植或免疫治療的方法，這些方法是本領域技術人員已知的。優選地，施用方法的典型實例如下(a)向損傷或附近組織給藥；(b)向體腔(心包腔、胸腔、腹腔、腦脊髓腔)給藥；(c)向控制損傷部位的血管或淋巴組織給藥；(d)向損傷部位外的血管或皮膚組織、脂肪組織或骨骼肌組織給藥。由于吞噬細胞固有的遷移能力，可以預期所有這些給藥方法將在損傷部位而非給藥部位產生效果。(ii)誘導核酸在吞噬細胞中表達的步驟采用本領域技術人員已知的技術實施該步驟。即，采用核酸在導入吞噬細胞后能夠在這些細胞中展示其功能的方式，摻入該核酸以實現該步驟。在優選實施方案中，摻入的核酸的功能是核酸所編碼基因的表達。在其它優選實施方案中，核酸的功能可以通過包含在復合物中的核酸的直接作用來體現。在本發明中，核酸以含核酸復合物的形式被吞噬細胞攝取，在該含核酸復合物中該核酸與生物可降解聚合物結合形成復合物。因此，受到含核酸復合物的生物可降解性控制的核酸持續釋放增加了核酸導入細胞的效率，并促進了核酸在細胞中的表達或其它功能。(iii)將吞噬細胞遞送至靶位點的步驟該步驟可以容易地通過吞噬細胞的遷移安全地實現。優選地，根據期望的靶位點選擇吞噬細胞。例如，如果期望靶向癌組織或炎癥組織，則優選使用巨噬細胞、上皮樣細胞和多核巨細胞。優選使用單核細胞以靶向血液；使用樹突細胞以靶向骨髓和淋巴組織；使用組織細胞以靶向結締組織；使用枯否細胞以靶向肝；使用破骨細胞以靶向骨；使用A型滑膜細胞以靶向滑膜；使用小膠質細胞以靶向神經系統；使用郎格漢斯細胞以靶向皮膚。而且，在各種器官的表面施用吞噬細胞能夠使核酸(吞噬細胞中攜載的)向靶器官的深處轉運。
本發明還提供基因治療用新藥物，該藥物利用了以吞噬細胞的吞噬作用為基礎的含核酸復合物的攝取，并利用了以吞噬細胞固有遷移能力為基礎的復合物向靶位點的遞送，見以上詳述。該藥物具有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物作為活性成分。復合物中成分的預期范圍在上文和下文中作了描述。
本發明的含核酸復合物可以通過多種方法體內施用。為了在期望的特定位點獲得持續的局部核酸釋放，尤其優選腸胃外給藥。如果需要的話，可以將本發明的含核酸復合物與可藥用載體(穩定劑、防腐劑、增溶劑、pH調節劑、增粘劑等)混合來制備含有該復合物作為活性成分的藥物。這些載體是本領域技術人員已知的。還可以加入用于調節持續釋放效果的各種添加劑，這些添加劑是本領域技術人員已知的。
具有本發明含核酸復合物作為活性成分的藥物還可以包括兩種或更多種類型的含核酸復合物，其中這些復合物含有不同類型的核酸。具有多種治療目的的該藥物在變得多樣化的基因治療領域中是尤其有用的。
根據預期目的，本發明含核酸復合物可以通過制藥方式制成各種形式。這些形式的實例是顆粒、圓柱或棱柱、片、盤、糊等形式的固體和半固體制劑，或注射劑如混懸劑和乳劑。優選在期望的特定位點有優秀的緩釋效果的固體制劑，并優選局部給藥。例如，以片狀形式制備的本發明含核酸復合物適合于固定在局部血管的內壁上。更具體地，目前已有此類方法使片狀含核酸復合物纏繞在用于動脈成形術的支架上，借助導管將此支架插入適當的血管分支中，并在局部血管中給囊充氣以便將含核酸復合物固定在血管內壁上。該方法使得基因可以轉移至復合物固定處的血管壁中，并實現對固定位置周圍區域的基因治療。優選的實施方案包括癌癥的基因治療如抗血管生成治療，或循環系統疾病的基因治療如血管生成治療。
可以通過肌內途徑向脂肪組織中，通過皮下、皮內、靜脈內途徑向淋巴管中、淋巴結中，通過動脈內途徑向體腔(心包腔、胸腔、腹腔、腦脊髓腔)或向骨髓中，施用含核酸復合物的注射劑。優選肌內給藥。也可以直接向患病組織給藥。
對于固體和半固體制劑，引用以下方法作為例子將制劑直接包埋在期望核酸釋放的位置；通過注射器注射漿狀制劑；注射胃腸外懸浮液形式的顆粒制劑；以經皮跨腔方式插入導管，并通過該導管將附著在支架上的復合物本身保留在血管中；以及通過導管注射細小的復合物顆粒(顆粒大小約幾個微米至約15微米)，并將其定位在期望核酸釋放的位置。這些方法和其它方法均是本領技術人員已知的。
在通過制藥方式制備本發明復合物的過程中，還期望對其實施滅菌步驟如過濾滅菌。
根據本發明，給予動物、尤其是人的劑量隨各種因素而變，這些因素有例如目的核酸、所用生物可降解聚合物、給藥方式、待治療的具體位點。然而，劑量應是足以產生治療反應的量。這些劑量是本領域技術人員已知的。
本發明含核酸復合物優選用于基因治療。該復合物適用的疾病根據摻入復合物中的核酸的類型而不同。疾病的例子有心血管領域的疾病、如外周動脈疾病、冠狀動脈疾病、和動脈擴展術后引起損傷的疾病如再狹窄。其它例子有癌癥(惡性黑素瘤、顱內腫瘤、轉移性惡性腫瘤、乳腺癌等)、感染(HIV等)、和單基因疾病(囊性纖維化、慢性肉芽腫性疾病、α1-抗胰蛋白酶缺乏、戈謝病等)。
在優選實施方案中，當使用成纖維細胞生長因子基因，尤其是包含序列表SEQ ID NO.1所示堿基序列的DNA，作為摻入復合物的核酸時，可以將其應用于前述FGF4/HST1蛋白質的生理活性具有治療效果的各種疾病。實施例我們提供實施例和實驗實施例以便更詳細地描述本發明，但這些實施例不以任何方式限制本發明。實施例1(1)制備胺化明膠將具有9.0等電點的1g明膠(Nitta Gelatin公司)溶解在50ml 0.1M磷酸緩沖液(PB，pH5.0)中。然后，在該溶液中按每mol明膠羧基基團(分子量10,000，羧基含量95mol/明膠分子)50mol的量加入乙二胺(分子量60.1)，然后再按每mol羧基50mol的量加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(分子量191.7)。37℃攪拌所獲混合溶液12個小時。反應結束后，將反應混合物對水透析2天，并凍干以獲得胺化明膠。采用三硝基苯磺酸鈉對氨基作的比色定量分析顯示，56％的明膠羧基基團被胺化。
(2)制備顆粒性胺化明膠水凝膠將40℃預處理的100mg/ml胺化明膠水溶液(0.2ml)加入5ml橄欖油中。通過40℃接觸混合1分鐘，乳化該混合物。通過超聲40秒對該乳化的混合物作進一步乳化，之后在冰上快速冷卻。加入丙酮(1.43ml)，離心(5,000rpm，5min，4℃)混合物以回收未交聯的顆粒。采用丙酮對所獲顆粒進行離心洗滌(5,000rpm，5min，4℃)。然后將所獲顆粒懸浮在30μl 25％(w/v)戊二醛水溶液和20ml 0.1％(w/v)Tween 80水溶液的混合水溶液中。4℃攪拌該懸浮液40個小時，以通過化學方法使明膠顆粒發生交聯。然后，離心(5,000rpm，5min，4℃)回收所獲顆粒。之后，為了封閉未反應的醛基，將顆粒分散在含有100mM甘氨酸的0.1(w/v)％Tween 80水溶液(20ml)中，并37℃攪拌該分散體系1小時。反應結束后，用0.1％(w/v)Tween 80水溶液(兩次)、然后用蒸餾水(三次)離心洗滌該反應混合物，以回收顆粒。用丙酮徹底洗滌后，空氣干燥這些顆粒。從顯微照片上測量干燥顆粒的大小、和37℃在PB(pH7.0)中溶脹12小時后顆粒的大小。基于它們大小的比例，按體積計算的水含量為98.6％(顆粒性胺化明膠水凝膠)。所獲顆粒的平均大小在干燥狀態為100μm(溶脹狀態為200μm)。(3)制備與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的DNA所用DNA是通過將大腸桿菌的lacZ基因插在具有CAG啟動子(雞β-肌動蛋白啟動子；Gene，108193-200，1991)的pCAGGS表達載體的EcoRI位點中獲得的lacZ表達質粒DNA，該啟動子尤其在肌肉中具有高活性(該質粒被稱作pCAGGS-lacZ，或簡單地稱作lacZ質粒；由Miyazaki實驗室(Molecular Defense Medicine，Osaka Universtiy Faculty of Medicine)提供)。用TlCl3放射標記此DNA。即，將5μl Na125I溶液(0.1N NaOH水溶液中740MBq/ml，NEN Research Products，Dupont)與0.3mM Na2SO3水溶液(2μl)混合，使該混合物在25℃放置30分鐘。向該混合物中加入其中溶有5μg DNA的5μl 0.1M CH3COONa-40mM CH3COOH混合溶液(pH5.0)。再加入其中溶有0.3mg TlCl3的0.3ml 0.2M CH3COONa-1.0mM CH3COOH混合溶液(pH 4.0)。然后，將所獲混合物置于60℃40分鐘。然后，向該混合溶液中加入0.1ml 0.1mM Na2SO3水溶液，并再加入含有0.9ml 1mMEDTA的0.1mM NaCl-50mM tris鹽酸溶液(pH7.0)。所獲溶液在60℃加熱30分鐘。反應完成后，冷卻所獲溶液，并在PD-10凝膠層析柱上分離放射性碘化DNA和游離的放射碘。然后，向凍干的顆粒性胺化明膠水凝膠滴加10μl放射性碘化DNA水溶液，并使該系統在25℃放置1小時。此期間，顆粒被水溶液浸漬，獲得含有放射性碘化DNA的復合物。實施例2在明膠水溶液(終濃度按重量計5％)中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的水溶液(終濃度10.7mM)。然后，將該混合物傾入15cm×15cm大小的塑料平皿中，并4℃放置24小時以進行交聯反應。所用明膠是具有4.9等電點的經堿處理的明膠。反應結束后，從平皿中取出交聯的明膠凝膠，獲得厚200μm的明膠片。用水徹底洗滌所獲片，然后將其凍干。將干燥的交聯明膠片置于按實施例1相同方式制備的放射性碘化DNA(lacZ質粒)水溶液中，以獲得含放射性碘化DNA的交聯明膠片。實驗實施例1將基因摻入顆粒性胺化明膠水凝膠中對核酸被攝取至帶正電荷水不溶性生物可降解聚合物中進行證實。
將含500μg/ml濃度lacZ質粒的水溶液與實施例1-(2)中制備的顆粒性胺化明膠水凝膠混合，并通過紫外吸收法(波長260nm)測量隨著時間的過去水溶液中lacZ質粒的濃度。使用水(不含lacZ質粒)作為對照。結果顯示在圖2中。
水溶液中的lacZ質粒在1小時內快速地摻入顆粒性胺化明膠水凝膠中(通過lacZ質粒濃度在水溶液中的降低所測量到的)。lacZ質粒濃度在水溶液中的降低一直持續到24小時之后，說明lacZ質粒持續被吸收到明膠水凝膠中。參考實驗實施例1顆粒性胺化明膠水凝膠的生物可降解性驗證本發明含核酸復合物中的成分，顆粒性胺化明膠水凝膠，是可生物降解的。
在試管中加入0.1ml量的125I-Bolton-Hunter試劑(NEN-120X，無水苯中147MBq/ml，NEN Research Products，DuPont)的無水苯溶液。通過氮氣起泡蒸發苯。向該試管中加入5ml蒸餾水，在該蒸餾水中分散了濃度達10mg/ml的實施例1-(2)制備的顆粒性胺化明膠水凝膠。4℃攪拌該混合物12小時，以便放射性碘化標記該明膠水凝膠。用蒸餾水離心洗滌(5,000rpm，5min，4℃)所獲放射性碘化顆粒性胺化明膠水凝膠，以除去未參與標記的125I-Bolton-Hunter試劑。最后，用0.1M磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH7.0)將顆粒濃度調節至0.5mg/ml。
將所獲放射性碘化顆粒性胺化明膠水凝膠，按每只小鼠0.1ml的劑量，施用在ddy小鼠(雌性，6周齡，購自Shimizu Experimental Material公司)的右股肌肉中。預先確定的時間過后，切下右股肌肉，測量放射活性。將測量到的放射活性與最初施用的放射活性比較，以評價殘存的放射性活性。在每種實驗條件下均對3只小鼠進行這些實驗。顆粒性胺化明膠水凝膠在體內隨時間降解，由此證實其是可生物降解的。實驗實施例2評價DNA的體內存活情況將按參考實驗實施例1相似方式制備的放射性碘化胺化明膠水凝膠、和實施例1(3)制備的具有放射性碘化DNA的顆粒性胺化明膠水凝膠，都分散在0.1ml PBS中。然后，將此分散體系施用在ddy小鼠(雌性，6周齡，購自Shimizu Experimental Material公司)的右股肌肉內。作為對照，在90μl PBS中加入10μl放射性碘化DNA水溶液，然后將此混合物施用在小鼠的右股肌肉內。對于每種實驗條件，實驗小鼠的數目都是3，殘存放射活性表示為平均值±標準差。結果顯示在圖3。
明膠顆粒的殘存放射活性隨時間推移逐漸減少，由此說明這些顆粒在體內發生降解，換言之，它們是可生物降解的(-·-)。包含在明膠水凝膠中的DNA的殘存放射活性(-°-)也隨時間的過去而減少，并且其隨時間流逝的分布圖與顆粒性胺化明膠水凝膠本身的殘存放射活性的時間分布圖是相同的。這證實DNA由于顆粒的降解以持續方式自顆粒中釋出。當施用DNA水溶液時，殘存放射活性快速減少(-△-)。該發現說明，DNA在施用部位被快速排出或代謝，而不被保留。實驗實施例3胺化明膠水凝膠結合的DNA的基因表達除去兔股動脈，制備下肢缺血模型。10天后，在缺血部位的肌肉內施用lacZ質粒。施用后2周，對缺血部分的肌肉組織進行lacZ染色，以研究該基因的表達。結果顯示在圖4A-4C。
對實施例1(3)中制備的顆粒性胺化明膠水凝膠(溶脹時直徑200μm)結合的lacZ質粒(lacZ質粒的量為500μg圖4A)、未與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的裸lacZ質粒(500μg，對照圖4B)，進行這些研究。并對lacZ質粒的量減少至1/10(lacZ質粒的量為50μg圖4C)的顆粒性胺化明膠水凝膠(溶脹時直徑200μm)結合的lacZ質粒的施用進行了該研究。
按以下方式進行lacZ染色；
1.在37％甲醛-25％戊二醛混合溶液中4℃固定樣品5分鐘。
2.用PBS洗滌(3次)。
3.用染液(1mg/ml X-gal，5mM六氰基高鐵(III)酸鉀，5mM六氰基高鐵(II)酸鉀，1M氯化鎂)進行染色。
與單獨施用lacZ質粒相比，與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的lacZ質粒表現出更廣泛的基因表達(A與B的比較)。
與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的lacZ質粒，甚至在其劑量減少至1/10時，還表現出顯著的基因表達。參考實驗實施例2采用腺病毒載體進行的基因表達在兔下肢缺血模型中按實施例3相同方式研究使用腺病毒載體進行的基因轉移。
施用含有1×109pfu lacZ基因的腺病毒載體(由Saito實驗室提供，The Institute of Medical Science，The University of Tokyo)。施用后3天，與單獨施用lacZ質粒及施用與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的lacZ質粒相比，lacZ基因的表達更強(圖5A)。然而，施用后2周基因表達顯著下降(圖5B)。實驗實施例4兔下肢缺血模型中的血管生成在實驗實施例3相同的兔下肢缺血模型中研究施用成纖維細胞生長因子FGF4/HST1質粒導致的血管生成。
除了所用核酸是FGF4/HST1質粒(500μg或5μg)外，按實施例1相同方式制備顆粒性胺化明膠水凝膠結合的FGF4/HST1質粒。對于該質粒，使用的是通過將FGF4/HST1基因(序列表SEQ ID NO.1)插在pRc/CMV2載體(INVITORGEN)的HindIII位點中獲得的FGF4/HST1表達質粒DNA(之后簡稱FGF4/HST1質粒)。
使用裸FGF4/HST1質粒(500μg)、和與相同明膠水凝膠結合的lacZ質粒(500μg)，作為對照。
在下肢缺血模型制備后10天，通過肌內方式向缺血部位注射以上實施方案的各種質粒。在給藥后2周，對新生血管實施血管造影術(放射線照相術)。結果顯示在圖6A-6D。
圖6A和6B顯示了施用顆粒性胺化明膠水凝膠結合的FGF4/HST1質粒(FGF4/HST1質粒的量圖6A中500μg，圖6B中5μg)的結果。圖6C顯示了施用顆粒性胺化明膠水凝膠結合的lacZ質粒(500μg，對照)的結果。圖6D顯示了施用裸FGF4/HST1質粒(500μg，對照)的結果。施用與顆粒性胺化明膠水凝膠結合的FGF4/HST1質粒比施用裸形式的該質粒導致更多的新血管生長。由此，我們發現FGF4/HST1質粒的功能性表達得到增強(圖6A與圖6C及6D的比較)。甚至在其劑量減少至1/100時(圖6B)，仍觀察到此效果。而且，當以和明膠水凝膠結合的形式、而非以裸形式施用時，FGF4/HST1質粒可以局部地高效發揮功能。
使用VEGF165質粒(500μg)替代FGF4/HST1質粒進行的實驗給出了相似的結果。VEGF165質粒由東京大學Shibuya教授提供。該質粒是通過將VEGF165基因插入pCAGGS表達載體的XhoI位點獲得的(Shibuya M，Adv.Cancer Res.，67，281-316，1995)。實驗實施例5向兔動脈管壁進行基因轉移(1)lacZ質粒將實驗實施例2制備的干燥交聯明膠薄片放置在無菌支架(SynthesisCardio Vascular Dynamics，Inc.)上。向該交聯明膠薄片滴加lacZ質粒溶液(5-10μg/μl)，重復滴加2小時以避免干燥(滴加的總量50-100μl)。通過此手段，使交聯明膠與lacZ質粒結合。將此交聯明膠包被的支架植入兔髂動脈中。5天后，取出該髂動脈，包埋在Tissue-Tek(R)O.C.T.化合物中，然后在液氮中固定。樣品在使用前保存在-80℃。從該固定的樣品制備切片，并對其進行蘇木精-伊紅(HE)染色、DAB(二氨基聯苯胺)(diaminobenzenezidene)、和Xgal染色。結果顯示在圖7。
在血管平滑肌被膜的外層中，觀察到lacZ的表達，證實質粒被巨噬細胞攝取并且質粒得到表達。
(2)VEGF165質粒以上面(1)中所述相同的方式，向交聯明膠薄片滴加50μl-100μl量的1-2μg/μl VEGF165質粒溶液。通過免疫組織化學染色(使用抗人VEGF IgG組分(Austral Biologicals)作為一抗)驗證該質粒的表達。實驗實施例6通過放射微血管造影術研究新生血管網(Vasoganglia)的成熟(1)施用質粒在患有下肢缺血的兔(同實驗實施例3)的患病下肢股肌肉中肉眼施用含有未與交聯明膠結合的500μg裸VEGF165質粒的水溶液。
獨立地，在患有下肢缺血的兔的患病下肢股肌肉內肉眼施用含有與4mg交聯明膠微粒(直徑約200μm)結合的500μgVEGF165質粒的生理鹽水。
(2)輸入腺苷以100μg/kg/min的劑量向腹主動脈施用腺苷。
(3)測量和結果通過放射微血管造影術(間距分辨率25微米)，測量裸VEGF165質粒組和明膠水凝膠結合的VEGF165質粒組中新生血管網的成熟。圖8顯示了裸VEGF165質粒處理的結果，而圖9顯示了明膠水凝膠結合的VEGF165質粒處理的結果。在裸VEGF165質粒處理的組中，與基線比較(未輸入腺苷)，輸入腺苷后(血管舒張期間)血管密度降低。在明膠水凝膠結合的VEGF165質粒處理的組中，輸入腺苷后血管密度明顯增加。這些發現顯示，在明膠水凝膠結合的VEGF165質粒組中，基線血流被控制在一個低水平，且在腺苷輸入期間調動了血管舒張儲備能力。在裸VEGF165質粒組中，則相反，基線血流并不被控制在低水平，而且在腺苷輸入期間也沒有調動血管舒張儲備能力。新生血管中血管系統的成熟，如血管平滑肌和神經或體液調節機制的成熟，是腺苷輸入過程中血流和血管舒張控制所必需的。已經發現施用明膠水凝膠結合的VEGF165質粒能夠實現這些狀態。參考實施例3巨噬細胞對含核酸復合物的攝取體外制備吸收了含核酸復合物的巨噬細胞。向小鼠的腹膜內注射巰基乙酸鹽，4天后采取巨噬細胞。獨立地，將2mg綠色熒光蛋白(GFP)質粒(Prasher DC等，Gene，111，229-233，1992；Heim R等，Nature，373，663-664，1995)中的100μg與實施例1中制備的交聯明膠顆粒相結合。該質粒是通過將GFP的cDNA(購自Clontech)插入HIV-CS載體的多克隆位點制備的。使交聯明膠顆粒-GFP質粒與收集的巨噬細胞混合，并在PBS中33℃培養該混合物4天。培養4天后，采用熒光顯微鏡和熒光激活的細胞分選儀(FACS)，檢查GFP的熒光。結果顯示在圖10。在巨噬細胞中觀察到熒光，這證實攝取了交聯明膠顆粒-GFP。在采用浸在伊紅染液中的交聯明膠顆粒進行的實驗中，也證實了相似結果(證實巨噬細胞中的伊紅顆粒)。實驗實施例7向樹突細胞轉移基因并誘導針對特定抗原的CTL向分離自人外周血的樹突細胞(DC)施用GFP質粒，并檢測其抗原呈遞能力。
除了所用核酸是GFP質粒(見前述；20μg)外，按實施例1相同方式制備顆粒性胺化明膠水凝膠結合的GFP質粒。
從健康實驗對象的單核細胞中獲得CD14陽性組分，并與GM-CSF和IL-4一起加入合并的人血清/RPMI培養基中，以誘導DC。4-6天過后，在DC中加入顆粒性胺化明膠水凝膠結合的GFP質粒。將該混合物放置60分鐘，除去明膠水凝膠，然后再培養細胞3天。用CD1a-PE和CD83-PE作為DC的標志，染色培養后的DC，并通過FACS分析研究向DC轉移基因的效率。結果顯示在圖11A和11B。使用裸GFP質粒(20μg)作為對照。基因轉移效率是77％。
當使用WT1質粒(Call KM等，Cell，60，509-520，1990)替代GFP質粒時，獲得相似的高基因轉移效率。
通過CTL誘導能力，測定其中轉移了WT1基因的DC是否具有細胞呈遞基因產物的能力。將誘導了DC的相同健康實驗對象的T淋巴細胞與帶有WT1基因的DC一起共培養，以獲得激活的T淋巴細胞。使用51Cr標記這些細胞以形成靶細胞。使用這些靶細胞，進行CTL分析。誘導了針對轉移的WT1的CTL，這顯示出WT1基因轉化的DC具有呈遞該抗原的能力。
根據本發明，正如上述，核酸的負電荷和生物可降解聚合物的正電荷之間的穩定牢固結合導致復合物形成。核酸的釋放受到生物可降解聚合物體內降解的控制。由此，與在常規緩慢釋放制劑中觀察到的簡單擴散引起的緩慢釋放、以及采用水溶性生物可降解聚合物實現的核酸瞬時釋放相比，可以實現對釋放速率更為精確的控制。而且，改善了持續釋放，使其在一個更長的時間內進行。
對于本發明的含核酸復合物，該復合物是不溶性的，并且核酸在體內受到保護不被降解。因此，能夠使核酸維持在一種足夠有活性的狀態，直到核酸到達其應當通過基因表達或通過所包含核酸的直接作用表現出功能的位點。由此，可以實現核酸的局部表達和/或作用。即，可以使基因治療局限于需要治療的位點。
而且，核酸的釋放速率受到所用生物可降解聚合物的類型、以及正電荷和負電荷間的平衡的控制。因此，釋放速率是恒定的，在制備復合物的過程中無需特別關心其形狀。
連貫并持久地局部長期釋放核酸在基因治療領域是尤其有用的。由于可能要長期向需要治療的部位或活生物體施用目的基因，所以就愈需要調節基因轉移的時間安排、和導入核酸的時間安排，以便對基因表達和功能性表達而言最優。
根據本發明，可以預期使用通常劑量約1/10-1/100的核酸量即可得到期望效果。即，本發明起到增強核酸有效活性的作用。從可以施用低劑量的基因、以及可以降低基因在非目的位點的其它位點的附屬作用這些方面來看，該增強作用是優選的。
本發明含核酸復合物的另一實施方案是提供借助于吞噬細胞如巨噬細胞的吞噬作用、和吞噬細胞的遷移，能夠實現核酸的靶位點特異性功能表達的新方法。該方法使得可以更為安全、容易地進行基因治療。
序列表<110>CMIC Co.，Ltd.<120>含核酸的復合物<130>PCM-9001<150>JP <151>2000-9-13<150>JP11-318187<151>1999-11-09<160>1<210>1<211>3149<212>DNA<213>Homo sapiens<300><301>M.Taira，T.Yoshida，K.Miyagawa，H.Sakamoto，M.Terada and T.Sugimura<302>人轉化基因hst的cDNA序列和轉化活化所需編碼序列的鑒定<303>Proc.Natl.Acad.Sci.USA<304>84<306>2980-2984<307>1987<400>gcactgctcc tcagagtccc agctccagcc gcgcgctttc cgcccggctc gccgctccat 60gcagccgggg tagagcccgg cgcccggggg ccccgtcgct tgcctcccgc acctcctcgg 120ttgcgcactc ctgcccgagg tcggccgtgc gctcccgcgg gacgccacag gcgcagctct 180gccccccagc ttcccgggcg cactgaccgc ctgaccgacg cacggccctc gggccgggat 240gtcggggccc gggacggccg cggtagcgct gctcccggcg gtcctgctgg ccttgctggc 300gccctgggcg ggccgagggg gcgccgccgc acccactgca cccaacggca cgctggaggc 360cgagctggag cgccgctggg agagcctggt ggcgctctcg ttggcgcgcc tgccggtggc 420agcgcagccc aaggaggcgg ccgtccagag cggcgccggc gactacctgc tgggcatcaa 480gcggctgcgg cggctctact gcaacgtggg catcggcttc cacctccagg cgctccccga 540cggccgcatc ggcggcgcgc acgcggacac ccgcgacagc ctgctggagc tctcgcccgt 600ggagcggggc gtggtgagca tcttcggcgt ggccagccgg ttcttcgtgg ccatgagcag 660caagggcaag ctctatggct cgcccttctt caccgatgag tgcacgttca aggagattct 720ccttcccaac aactacaacg cctacgagtc ctacaagtac cccggcatgt tcatcgccct 780gagcaagaat gggaagacca agaaggggaa ccgagtgtcg cccaccatga aggtcaccca 840cttcctcccc aggctgtgac cctccagagg acccttgcct cagcctcggg aagcccctgg 900gagggcagtg ccgagagtca ccttggtgca ctttcttcgg atgaagagtt taatgcaaga 960gtaggtgtaa gatatttaaa ttaattattt aaatgtgtat atattgccac caaattattt 1020atagttctgc gggtgtgttt tttaattttc tggggggaaa aaaagacaaa acaaaaaacc 1080aactctgact tttctggtgc aacagtggag aatcttacca ttggatttct ttaacttgtc 1140aaaagttgtc acgagtgtgc tgctattctg tgttttaaaa aaaggtgaca ttggattccg 1200atgtcatccc ctgtagtatg gcgtggagca tctctgtctg gaaaggcccg cctgaggctt 1260gggcagccag ttcagggagc tcccaggctt ggctctcggc tagcatcctc agaggcccac 1320tccctttgtg ccctgttgct attaatcggg acatatcggt ttacttcggg tacagaaagt 1380gcggtgttga agtcctcgct gccactctgt ttttagatct gccaagactg acctttgaac 1440tttcctgtag tcaatcttcc tcgatctacc agatgggaga gacccttgga caactttata 1500aactcctgtt tgcctttttt ggatcagcga cagcccccat cgctgtgact attggggaaa 1560agacgaagct ctttcataaa ttccatggag aggaatcaat atcccactgg aaggctagaa 1620atggacaaga tagtgtattt gcaatcacaa acaaaaccct agtgatgaaa aataatttgt 1680gatggcagat gcttctgatg gtgtgataga atatgttttt gaaaacaaac catcgaaccc 1740cccgccccac ccccaaaacg ggcttccctg tgtttaggga gctttgggct agaactagct 1800acgattttta ggtgaaatgt ccttgtaatt gtacaaagca cttggtgcag tgtttgcgtg 1860gagcagcctg ctgctttctg atgcattccc tgtttaagtg cgtttaacat ctacctcaca 1920agccctgaaa ccccaggcaa aacccacaga aagctcatac ccggtgcagg agtttgccat 1980cccaagtggc tttttttcca tatgtagcca aaaaggattg cagatagcgt cggtgcgtcc 2040cattcgaacc ttgtcacgtt tgagctatct ttaccctgtg atttactttt agtaagggtg 2100atcatggtga aaatatttgc agacagctgt tacagtacac tatatggtca ccaagtaacc 2160ttatattttt ctttatatat tttacaaatg taacccctgt cattgaagca accgtggaag 2220aggcagggtc ggtgatgttt aaaaaaagtt ccgaggtgat ggcaaacatt taattttaat 2280gaatgacttt ttagagttta tacaaaatga ccttagcttg ctaccagaaa tgctccgaat 2340gtttcgtcaa gactttaata ctctcctagg atgtttctga actgtctccc gaattaactt 2400tatgggagtc tacagacagc aagactggaa aatctgattg gagtttttgt ctttcacatt 2460ccttttgaaa actctttgtt cgaatgcaaa tcatcgactt aaaatactat tcttaaccaa 2520ggcctggaag aaagaagaca cttgcaaagc cgctaagaca ggaccacaca tcttaaactg 2580ctgttcctac catgcactaa actgttttta agttttaaac cacaccctag gctccaggag 2640tgttcaggaa agatggtgtt tgtaggtctc catgctgttt ggcgttgggg ggtgtggagg 2700gatcatccgt cgactttctg aattttaatg tattcactta gtaacaaacc atgattgtct 2760taaatgcctt aaattattat gagatttctt gtctcagagc ccaatcagat tgtcaggaat 2820taacatgtgt taggtttgat cacccttgac cacttcttat agatatttct tcaacaaatc 2880atgtgtgatg cctgtaggaa cacaactgta cctttaaaat attgttttca tattgctgtg 2940atggggattc gaggttcctg tatgtgccac tgttttcaga atctgtagtt ttatacaggt 3000gccgaccctc gttgtgatgt atgtgctgtg cacattgaca tgctgaccga caatgataag 3060cgtttatcgt gtataaaaag acaccactgg actggatgta cacaactggg aaaggaatta 3120aaagctatta aaattgtgcc ttgaaatgc 3149
權利要求
1.包含核酸和帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸復合物，其中所述核酸可以通過生物可降解聚合物的降解得以釋放。
2.包含核酸和帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸復合物，其中該聚合物具有引入的帶正電荷基團。
3.權利要求1或2的含核酸復合物，其中所述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、和它們的衍生物。
4.權利要求3的含核酸復合物，其中所述衍生物包含氨基衍生物。
5.權利要求1或2的含核酸復合物，其中所述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的帶正電荷基團的交聯明膠。
6.權利要求1或2的含核酸復合物，其中所述核酸包含至少一個選自下組的成員質粒DNA、寡核苷酸、和雙鏈核酸化合物。
7.權利要求6的含核酸復合物，其中所述核酸包含至少一個選自下組的成員血管內皮細胞生長因子基因、肝細胞生長因子基因、和成纖維細胞生長因子基因。
8.權利要求7的含核酸復合物，其中所述成纖維細胞生長因子基因包含SEQ ID NO.1。
9.包含權利要求1-8之任一項的含核酸復合物作為活性成分的藥物組合物。
10.權利要求9的藥物組合物，其被用于基因治療。
11.權利要求10的藥物組合物，其中所述基因治療通過局部施用該基因來實現。
12.控制核酸釋放速率的方法，包括將核酸摻入帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物中；和允許核酸通過所述生物可降解聚合物的降解得到釋放。
13.控制核酸釋放速率的方法，包括將核酸摻入具有引入的帶正電荷基團的帶正電荷水不溶性生物可降解聚合物中；和允許核酸通過所述生物可降解聚合物的降解得到釋放。
14.權利要求12或13的方法，其中所述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和它們的衍生物。
15.權利要求14的方法，其中所述衍生物包含氨基衍生物。
16.權利要求12或13的方法，其中所述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的帶正電荷基團的交聯明膠。
17.權利要求12或13的方法，其中所述核酸包含至少一個選自下組的成員質粒DNA、寡核苷酸、和雙鏈核酸化合物。
18.權利要求17的方法，其中所述核酸包含至少一個選自下組的成員血管內皮細胞生長因子基因、肝細胞生長因子基因、和成纖維細胞生長因子基因。
19.權利要求18的方法，其中所述成纖維細胞生長因子基因包含含有SEQID NO.1的DNA。
20.增強核酸的功能的方法，包括將核酸摻入帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物中；和允許該核酸通過生物可降解聚合物的降解得以釋放，以表現出該核酸的功能。
21.增強核酸的功能的方法將核酸摻入具有引入的帶正電荷基團的帶正電荷水不溶性生物可降解聚合物中；和允許該核酸通過該生物可降解聚合物的降解得以釋放，以表現出該核酸的功能。
22.權利要求20或21的方法，其中所述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、海藻糖、和它們的衍生物。
23.權利要求22的方法，其中所述衍生物包含氨基衍生物。
24.權利要求20或21的方法，其中所述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的帶正電荷基團的交聯明膠。
25.權利要求20或21的方法，其中所述核酸包含至少一個選自下組的成員質粒DNA、寡核苷酸、和雙鏈核酸化合物。
26.權利要求25的方法，其中所述核酸包含至少一個選自下組的成員血管內皮細胞生長因子基因、肝細胞生長因子基因、和成纖維細胞生長因子基因。
27.權利要求26的方法，其中所述成纖維生長因子基因包含SEQ ID NO.1。
28.包含有含核酸復合物的吞噬細胞，其中該含核酸復合物含有核酸和生物可降解聚合物。
29.權利要求28的吞噬細胞，其中所述生物可降解聚合物包含至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和它們的衍生物。
30.權利要求28的吞噬細胞，其中所述含核酸復合物包含權利要求1或2的含核酸復合物。
31.在靶位點表現核酸的功能的方法，包括步驟(i)允許吞噬細胞攝取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物；(ii)誘導核酸在吞噬細胞中發揮功能；和(iii)將吞噬細胞遞送至靶位點。
32.權利要求31的方法，其中所述含核酸復合物包含權利要求1-8之任一項的含核酸復合物。
33.權利要求31的方法，其中所述生物可降解聚合物包含至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和它們的衍生物。
34.包含含核酸復合物作為活性成分的基因治療用藥物組合物，其中所述含核酸復合物包含核酸和生物可降解聚合物，并且其中基因治療包括步驟(i)允許吞噬細胞攝取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸復合物；(ii)誘導核酸在吞噬細胞中發揮功能；和(iii)將吞噬細胞遞送至靶位點。
35.權利要求34的藥物組合物，其中所述生物可降解聚合物包含至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和它們的衍生物。
36.權利要求34的藥物組合物，其中所述含核酸復合物包含權利要求1-8之任一項的含核酸復合物。
37.通過給需要治療的患者施用含核酸復合物治療疾病或病癥的方法，其中該含核酸復合物含有核酸和帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物。
38.權利要求37的方法，其中所述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一個選自下組的成員膠原、明膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖、透明質酸、褐藻酸、淀粉、和它們衍生物。
39.權利要求38的方法，其中所述衍生物包含氨基衍生物。
40.權利要求37的方法，其中所述帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的帶正電荷基團的交聯明膠。
41.權利要求37的方法，其中所述核酸包含至少一個選自下組的成員質粒DNA、寡核苷酸、和雙鏈核酸化合物。
42.權利要求37的方法，其中所述核酸包含至少一個選自下組的成員血管內皮細胞生長因子基因、肝細胞生長因子基因、和成纖維細胞生長因子基因。
43.權利要求42的方法，其中所述成纖維細胞生長因子基因包含含有SEQID NO.1的DNA。
44.權利要求37的方法，其中所述疾病或病癥選自癌癥、免疫相關疾病和病癥、心血管疾病、腦或神經相關疾病、代謝紊亂和單基因疾病。
45.權利要求44的方法，其中所述心血管疾病選自外周動脈疾病、冠狀動脈疾病、和引起損傷的疾病。
46.權利要求44的方法，其中所述單基因疾病選自囊性纖維化、慢性肉芽腫性疾病、α1-抗胰蛋白酶缺乏、和戈謝病。
47.權利要求37的方法，其中所述疾病或病癥選自癌癥；中樞神經系統疾病；外周神經系統疾病；阿爾茨海默病；帕金森病；多發性硬化；肌萎縮性側索硬化；病毒感染；朊病毒引起的感染；細菌引起的感染；真菌引起的感染；和眼病。
48.權利要求47的方法，其中所述癌癥選自惡性黑素瘤、顱內腫瘤、轉移性惡性腫瘤、和乳腺癌。
49.權利要求37的方法，其中所述疾病或病癥選自偏頭痛；疼痛；性功能障礙；心境障礙；注意力障礙；認知障礙；低血壓；高血壓；精神病性精神障礙；神經障礙；運動障礙；代謝紊亂；和器官移植排斥。
全文摘要
本發明公開了一種含核酸復合物,該復合物含有核酸和生物可降解聚合物,尤其是帶正電荷的水不溶性生物可降解聚合物。該復合物具有向需治療的位點持續釋放目的核酸,尤其是DNA的優秀性質。由于該復合物可以被吞噬細胞例如巨噬細胞攝取,并特異地遞送至靶位點,因此,可以以靶位點特異性方式展現核酸的功能,由此可以實現更特異的基因治療。該復合物無不良作用,例如采用病毒載體如腺病毒、或脂質體所可能導致的重組或毒性的發生。因此,對于基因治療領域,該復合物是尤其優選的。而且,該復合物可以增強導入細胞中的核酸的生物學作用,從而使得可以采用較低劑量的核酸進行基因治療。
文檔編號A61K47/26GK1390141SQ00815477
公開日2003年1月8日 申請日期2000年11月9日 優先權日1999年11月9日
發明者盛英三, 田畑泰彥, 安藤潔, 田中越郎, 井關治和, 坂本裕美, 福山直人, 笠原啟史 申請人:Cmic株式會社