一種雞用飼料添加劑產品的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種雞用飼料添加劑產品；重量份數組成如下：植物乳桿菌混合菌粉20?25，靈芝菌固體發酵培養物3?6,花椒粉0.5?1，黃芪提取物1?2，枯草芽孢桿菌菌粉5?10。本發明產品可以有效降低抗生素類藥物在飼養動物中的使用量，提高動物肉制品的安全性，提高動物的飼料利用效率，增強動物的免疫力，提高飼養效益。CGMCC No.940520140702CGMCC NO.30
【專利說明】
一種雞用飼料添加劑產品
技術領域：
[0001] 本發明屬于飼料領域，尤其涉及飼料添加劑。
【背景技術】：
[0002] 花椒的主要成分是黃酮類化合物、酚類、內酯、香豆精類、醛酮，少量的鐵、鈣、硅、 錳、鉛、鎳、鋁、銅、鋅等微量元素及維生素 B族、維生素 A，以及多種氨基酸、酶、多糖類及豐富 的阿散酸等。花椒還是國內外專家公認的"天然抗生物質"，因為它不僅具有防御外來的入 侵者及感染病原菌擴散的作用，還具有抗病毒、消炎、抗氧化、調節機體免疫功能等作用。
[0003] 黃芪又稱黃芪實、冬青子、白蠟樹子、鼠梓子。外果皮薄，中果皮較松軟，易剝離，內 果皮木質，黃棕色，具縱棱，破開后種子通常為1粒，腎形，紫黑色，油性。無臭，味甘、微苦澀。 黃芪果實含齊墩果酸(Oleanolic acid)、甘露醇、葡萄糖、棕櫚酸、硬脂酸、油酸及亞麻酸。 果皮含熊果酸(Ursolicacid)、齊墩果酸、乙酰齊墩果酸(Acetyloleanolic acid)。種子含 脂肪油14.9%，油中棕櫚酸與硬脂酸為19.5%、油酸及亞麻酸等為80.5%。黃芪中尚含銅、 鋅、鐵、猛等微量元素。
[0004] 黃芪烏須明目，現代醫學研究認為黃芪可以抑制幽門螺桿菌的作用可以治療胃 病，還具有抑制嘌呤異常代謝用于痛風和高尿酸血癥的治療。用于肝腎陰虛，腰酸耳鳴，須 發早白；眼目昏暗，視物昏暗；陰虛發熱，胃病及痛風和和高尿酸血癥。黃芪是一味臨床常用 中草藥，近幾年已經開始研究其作為飼料添加劑在畜禽生產中的作用。
[0005] 靈芝[Ganoderema lucidum(Leyss ex Fr. )karst]，又稱靈芝草，屬擔子菌亞門、 多孔菌目、靈芝科、靈芝屬。歷代的醫典把靈芝歸位于"上上藥"，其排位在人參之前。《神農 本草經》、《本草綱目》記載，靈芝可明目、補肝氣、安神、益精、益心氣、益脾氣、益肺氣、益腎 氣、通九竅、耳聰、目明、利關節、利尿、養顏美容，是上好的滋補佳品。靈芝多糖能促進蛋白 質、核酸的合成，對血清、肝臟及骨髓細胞蛋白質或核酸的更新、合成有促進作用，它是靈芝 扶正固本的主要有效成分之一。靈芝多糖主要存在于靈芝真菌子實體、菌核、菌絲體或發酵 液中；存在于靈芝中的靈芝酸有止痛、鎮靜、抑制組織胺釋放、解毒、保肝、毒殺腫瘤細胞的 功用，是靈芝的主要有效成分之一。
[0006] 一種復合飼料添加劑產品，申請號為201210182772.2,該專利公開了一種復合飼 料添加劑產品，組成如下：低聚果糖10-15%，大豆多肽10-20%，黃芪萃取物10-25%，枯草 芽孢桿菌凍干菌粉，靈芝菌固體發酵培養物;枯草芽孢桿菌(Baci I lus subti I is)為CGMCC 6012,上述比例為質量百分比;本發明產品可以有效降低抗生素類藥物在飼養動物中的使 用量，提高動物肉制品的安全性，提高動物的飼料利用效率，增強動物的免疫力，提高飼養 效益。
[0007] 如何有效開發以天然植物或真菌獲得綠色飼料添加劑產品對飼料添加劑行業發 展具有重要意義。

【發明內容】
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[0008] 本發明提供一種雞用飼料添加劑產品；重量份數組成如下：
[0009] 植物乳桿菌混合菌粉20-25，靈芝菌固體發酵培養物3-6，花椒粉0.5-1，黃芪提取 物1-2，枯草芽孢桿菌菌粉5-10;
[0010] 所述飼料添加劑產品制備方法為：將上述各原料粉碎混合后通過造粒機制為顆 粒。
[0011] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)為CGMCC No.6012。
[0012] 植物乳桿菌混合菌粉重量份數組成為:植物乳桿菌CGMCC No.9405 1-3份，植物乳 桿菌CGMCC No .11763 4-7份；
[0013] 本發明中植物乳桿菌CGMCC No.9405菌株特點如下：在顯微鏡下觀察，該菌株為短 桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛，不產芽孢;在固體培養基上，該菌菌落為白色，表面光滑， 致密，形態為圓形，邊緣較整齊。
[0014] 理化特征為:過氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實驗( + )，運動性(-)，發酵產氣 (_)，亞硝酸鹽還原(_)，發酵產氣(_)，產硫化氫氣體(_)，pH4.0 MRS培養基中生長(+ )。
[0015] 本發明植物乳桿菌采用下述流程進行選育：
[0016] 原始出發菌種4試管活化4硫酸二乙酯(DES)誘變4亞硝基胍(NTG)誘變4等離 子體誘變-平板初篩-搖瓶復篩-傳代穩定性試驗。
[0017] 本發明所采用的出發菌株在MRS葡萄糖培養基中，其乳酸的生產速率為1.5g/L/d， 當培養基pH為3.5時幾乎停止生長，對亞硝酸鈉的分解速率為0.34mg/h/kg白菜。出發菌株 為李政采集于寧夏鹽池縣育肥羊場的青儲飼料，采集時間2013年9月15日。
[0018] 為了提高其乳酸生產速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG 技術對該菌種進行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸鈣平板進行初篩，然后采用500mL搖瓶發 酵，生物傳感器分析儀對高產菌進行復篩，選育優良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實驗， 評價其遺傳穩定性。
[0019] 植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩定性結果表明：經過連續傳代十次，各項性能指標都 比較穩定，遺傳性較好，性狀沒有回復，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的菌 株。
[0020] 經驗證發現:該誘變菌株的乳酸生產速率可以達到35g/L/d，該菌株經過71小時發 酵后乳酸濃度達到95g/L;能夠在pH為1.80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解能力 達到9.8mg/h/kg(自然發酵過程亞硝酸鹽積累的速率大約為I. lmg/h/kg)，能夠耐1%膽鹽。
[0021] 因此采用該菌種生產泡菜，整個發酵過程中亞硝酸鹽濃度在5mg/kg以下，遠低于 國家標準GB2714-2003中規定的含量(20mg/kg)。
[0022] 植物乳桿菌（Lactobaci Ilus plantarum) tlj-2014，該菌株已于2014 年7月2 日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101)，保藏號為CGMCC NO.9405。
[0023] I. DES誘變選育
[0024] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌L 一環，接入裝有50mL培養基MRS(無瓊 月旨，葡萄糖20g/L)培養基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養12h左右，使菌體處于對數生 長前期。
[0025] 2)取5mL菌液，5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0026] 3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成IO7個/mL菌懸液。
[0027] 4)取32mL pH7.0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mL DES在預先放入轉子的150mL 三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1 % (v/v)。
[0028] 5)在37°C搖床中150rpm反應30min，取ImL混合液，加入0.5mL 25 %Na2S2O3溶液中 止反應。
[0029] 6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養基(含100g/L葡 萄糖的碳酸鈣MRS培養基)平皿中。在37°C培養2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養基(低pH值改性MRS培養基)上和亞硝酸鈉篩選培養 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養基)上。
[0030] 7)在37 °C培養2~3天后，挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養基、亞硝酸鈉篩選培 養基上生長并且在碳酸鈣篩選培養基上。經初步篩選，挑取出的菌落命名為植物乳桿菌L1。
[0031] 2.亞硝基胍誘變
[0032] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌Ll 一環，接入裝有50mL培養基MRS(無瓊 月旨)培養基(葡萄糖濃度為60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養12h左右，使菌體處于 對數生長前期。
[0033] 2)取5mL菌液5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0034] 3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成IO7個/mL菌懸液。
[0035] 4)取IOmL菌懸液轉移至IOOmL三角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0036] 5)在37 °C下200rpm振蕩反應30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無菌生理鹽水 洗滌數次，中止反應。
[0037] 6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養基(含100g/L葡 萄糖的碳酸鈣MRS培養基)平皿中。在37°C培養2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養基(低pH值改性MRS培養基)上和亞硝酸鈉篩選培養 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養基)上。
[0038] 7)挑選菌株方法:挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養基、亞硝酸鈉篩選培養基上 生長并且在碳酸鈣篩選培養基上。經初步篩選，挑取100支符合以上條件的菌落。
[0039] 3.搖瓶復篩
[0040] 1)在超凈臺上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環，接入裝有50mL培養基MRS (無瓊脂)培養基(葡萄糖濃度為l〇〇g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養15h左右，使菌 體處于對數生長中期。
[0041 ] 2)分別取5mL菌液，接入裝有50mL碳酸鈣篩選液體培養基(含250g/L葡萄糖的碳酸 鈣MRS培養基)平皿中、pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS液體培養基(低pH值改性MRS培養基）和 亞硝酸鈉液體篩選培養基（單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養基）上（注:采用 250mL三角瓶）。200印!11，37°(：培養3-4天，每天分別檢測碳酸鈣篩選液體培養基中L-乳酸產 生速率、LPHMRS液體培養基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養基中亞硝酸鹽的消耗速 率。發酵結束后，比較100株菌種的碳酸鈣篩選液體培養基中L-乳酸產生速率、LPHMRS液體 培養基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養基中亞硝酸鹽的消耗速率。
[0042] 3)選擇兼具高L-乳酸產生速率、耐受低pH(該菌種僅能在最低為pHl. 8的培養基中 生長)和亞硝酸鹽的消耗速率高的菌株，將其命名為L2菌。
[0043] 4.遺傳穩定性試驗
[0044] 將L2菌在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發酵情 況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說 明該菌種的遺傳穩定性較強。菌株命名為植物乳桿菌（LactobaciIlus plantarum)tIj-2014。
[0045] 5.5L發酵罐試驗
[0046] 1)取斜面上的植物乳桿菌L2-環，接入裝有50mL培養基MRS(無瓊脂）（葡萄糖濃度 為150g/L)培養基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養12h左右，使菌體處于對數生長中 期。
[0047] 2)將對數期的菌種接入裝有3L MRS液體培養基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發酵 罐中。接種量為10%，37°(：下100印111培養8小時，對數前期溶氧控制10%(通氣0.5171^11)，后 期厭氧培養63小時。發酵結束后，植物乳桿菌L2的乳酸產量達到95g/L。這樣的產乳酸速率 利于泡菜的快速發酵。
[0048] 3)將對數期的菌種接入裝有3L pH為1.8的LPHMRS液體培養基(初始葡萄糖為50g/ L)的5L發酵罐中。接種量為10%，37°C下IOOrpm培養8小時，對數前期溶氧控制10 % (通氣 0.5L/min)，后期厭氧，整個過程用0.5mol/L的氫氧化鈉將發酵液pH控制在1.8，總培養時間 為48小時。發酵結束后，檢測植物乳桿菌L2的生物量為2.5g/L，說明植物乳桿菌L2能夠在 pHl.8的環境中生存。
[0049] 4)將對數期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養基(單一氮源為2g/L亞硝酸 鈉的改性MRS篩選培養基）的5L發酵罐中。接種量為10 %，37 °C下IOOrpm培養8小時，對數前 期溶氧控制10% (通氣〇.5L/min)，后期厭氧，發酵過程根據亞硝酸鹽的消耗速率流加20g/L 的亞硝酸鈉溶液，培養2-3天。發酵結束后，計算發酵過程植物乳桿菌L2對亞硝酸鈉的降解 速率。結果發現:在該條件下，L2對亞硝酸鈉的降解速率可以達到563mg/h/L。
[0050] 5)將對數期的菌種IOmL接入裝有2kg預處理過的白菜中，按照傳統泡菜方法進行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結果發現，在整個發酵過程中，L2菌對亞硝酸 鈉的分解速率為9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于5mg/kg，遠低于國家標 準GB2714-2003中規定的含量(20mg/kg)。
[0051 ]靈芝菌固體發酵培養物制備方法如下：
[0052]斜面菌種活化培養：將保藏的靈芝斜面菌種轉接到斜面培養基上，22-28Γ培養 96-120小時左右，至菌絲長滿斜面即可;最佳培養溫度25°C。
[0053] 1.液體一級種子培養:將上述靈芝斜面菌種挑取一塊接入裝有100毫升培養基的 500毫升搖瓶中進行一級種子培養，培養條件：旋轉式搖床80-180轉/分，22-28°C培養96-130小時左右;旋轉式搖床150轉/分為宜，培養溫度以25 °C為宜。
[0054] 2.液體二級種子培養:將一級搖瓶種子以5-20 %接種量接入裝有100毫升培養基 的500毫升搖瓶中進行二級種子培養，培養條件:旋轉式搖床80-180轉/分，22-28°C培養96-130小時左右;合適接種量為10%，旋轉式搖床150轉/分為宜，培養溫度以25°C為宜。
[0055] 3.固體發酵培養:將二級搖瓶種子以5-10%接種量接入裝有滅菌后固體發酵培養 基的500L固體發酵罐中，培養條件：裝料量50 %，培養溫度20-27 °C，濕度75-90 %，通風量 0.3-1.0(V/V)，培養時間15-40天。每隔3-10天開啟攪拌10分鐘。采用SGF固體發酵罐。
[0056] 4.發酵培養結束，選擇流化床等多種干燥方法，將物料干燥到水分含量在7 %以 下。對固體發酵物料進行粉碎。
[0057]本發明固體發酵培養基的碳源主要選擇麩皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯 (粉碎后）等常用原料，氮源可以選擇花生餅粉、蛋白胨、脫脂大豆蛋白粉、豆餅粉、酵母粉 等;需要添加的無機鹽有磷酸二氫鉀，硫酸鎂。
[0058]所述黃芪提取物制備方法如下：
[0059]黃芪粉碎，過40-50目篩后，添加黃芪3-6倍重量無水乙醇浸漬提取，控制溫度為 60-65°C3-4小時，提取液濃縮、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的黃芪殘渣中添加75-85 °C熱水，熱水添加量為黃芪殘渣重量的2-4倍，處理時間30-50分鐘，連續提取2-3次，將提取 液真空濃縮后噴霧干燥，得到熱水提取物;將上述乙醇提取物和熱水提取物合并粉碎，過60 目篩，即得黃芪提取物。
[0060] 所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌CGMCC6012,凍干菌粉中活菌數量為4-8 X IO8 個/g。所述復合飼料添加劑由以下方法制得：
[0061] 粉碎后靈芝菌培養物、花椒、黃芪提取物、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌凍干菌粉按 照比例粉碎混合造粒得到飼料添加劑。
[0062] 本發明提供一種飼料生產用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌種，該菌株已 經于2012年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址位 于北京市朝陽區北辰西路1號院3號，（郵編100101)，保藏編號為CGMCC No.6012。
[0063] 有益效果：
[0064]枯草芽孢桿菌:具有如下功能：1.耗氧產酸，調節腸道微生態平衡，達到預防腹瀉、 下痢等疾病;2.分泌多種酶類，提高飼料消化利用率;3.產生多種營養素，參與機體新陳代 謝;4.提高動物免疫力。本發明黃芪進行粉碎破壁處理，使黃芪中功能因子實現全價溶出和 高效提取利用，分別采用有機溶劑和熱水實現其中不同功效成分的有效提取，特別是控制 溫度分段提取更是有效提高了黃芪提取物的提取效率和質量。本發明通過科學復配，將枯 草芽孢桿菌、植物乳桿菌、靈芝菌、花椒實現了有機組合，高耐酸性植物乳桿菌的添加可以 有效通過胃部，提高植物乳桿菌的效力發揮。本發明產品可以有效降低抗生素類藥物在飼 養動物中的使用量，提高動物肉制品的安全性，提高動物的飼料利用效率，增強動物的免疫 力，提尚伺養效益。
[0065]具體實施方法：
[0066]本發明中靈芝菌培養物生產過程如下：
[0067] (1)斜面菌種活化培養：
[0068] (2)液體一級種子培養：
[0069] (3)液體二級種子培養：
[0070] (4)固體發酵培養：
[0071 ] (5)發酵培養結束，選擇流化床等多種干燥方法，將物料干燥到水分含量在7 %以 下。對固體發酵物料進行粉碎。
[0072] 本發明所用靈芝菌種購于中國工業微生物菌種保藏中心，菌號CICC14080。
[0073]本發明中斜面培養基組成可以為PDA斜面培養基或其他合適培養基。
[0074] 本發明固體發酵培養基的碳源主要選擇麩皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯 (粉碎后）等常用原料，氮源可以選擇花生餅粉、蛋白胨、脫脂大豆蛋白粉、豆餅粉、酵母粉 等;需要添加的無機鹽有磷酸二氫鉀，硫酸鎂。
[0075] 本發明中液體發酵發酵培養基組成：淀粉2-3 %，蔗糖3-5 %，花椒1 %，葡萄糖1-3 %，蛋白胨0.5 %，脫脂大豆蛋白粉2-3 %，磷酸二氫鉀0.13-0.2 %，硫酸鎂0.1-0.15 %，維 生素 Bi 2PPm，PH6-7。
[0076] 本發明中靈芝培養方法適合同屬其它菌種通過發酵法進行大規模發酵培養。
[0077] 菌種誘變
[0078]采取紫外誘變方法：以CICC10023為出發菌株，制成菌懸液，涂布于培養基平皿上， 紫外照射90s后37 °C培養箱中培養。
[0079] 菌種篩選
[0080]從90s平皿上挑30個長得強壯的單菌落，接種于斜面上，37°C培養箱中，培養24小 時，0--4°C冷藏保存；以原始菌種作為對照，采用常規選育條件，羧甲基纖維素鈉作為碳源 和蛋白水解圈方法篩選產纖維素酶和蛋白酶強的菌株，篩選獲得產纖維素酶和蛋白酶強的 菌株枯草芽孢桿菌(BaciIlus subtilis)Ll，此菌株產纖維素酶能力比原始菌株提高了 25%，產蛋白酶能力比原始菌株提高了 52%。將該菌種在中國普通微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No 6012。
[0081 ] 本產品所用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌種，該菌株已經于2012年4月16 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝陽區北 辰西路1號院3號，（郵編100101)，保藏編號為CGMCC N〇6012。
[0082]通過實驗研究表明：本發明產品具有良好的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、等致 病菌的特性。采用杯碟法對靈芝飼料添加劑產品的抑菌效果進行了研究，試驗采用飼料添 加劑的10倍水浸提液進行研究。實驗結果見表1，結果表明本發明產品具有抑制致病菌生 長的良好特性。
[0083]表1飼料添加劑產品的抑菌效果
[0085] 發明所述植物乳桿菌（LactobaciIlus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 11763,保 藏地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編： 100101。。
[0086] 植物乳桿菌益生特性如下：
[0087]本發明所提供的植物乳桿菌CGMCC NO. 11763經實驗發現能夠在pH為1.50的條件 下存活，在1%膽鹽培養4小時后仍處于存活狀態;植物乳桿菌CGMCC NO. 11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達到10.9mg/h/kg，該菌種在生產泡菜時，整個發酵過程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kg以下；CGMCC NO. 11763在發酵60h小時后，對膽固醇降解率可達到64.76%。 CGMCC NO · 11763黏附能力測定的自凝集率為95 · 71 %。
[0088] CGMCC NO. 11763對膽固醇降解能力研究和測定：
[0089] 取Iml CGMCC NO. 11763母液接種于IOmL的MRS膽固醇液體培養基（膽固醇含量 0.1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒溫靜置分別培養20h、40h、60h備用，以接入ImL無菌水的MRS 膽固醇培養基為對照，取以上培養不同時間的菌液樣品及對照液各lml，9000r/min，4°C下 離心10min，得到發酵上清液，鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . Iml于相應的試管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的鄰苯二甲醛0.15ml，緩緩加入濃硫酸 I.Oml，混合均勻。室溫靜置IOmin，于550nm下測吸光值）。每一處理3個重復，以同樣方法制 作膽固醇標準曲線，計算上清液中膽固醇含量及降解率，結果見表1。可知，CGMCC NO. 11763 對膽固醇有很好的降解作用，在發酵60h小時后，降解率可達到64.76%。 「00901 丟1對昍因釀的路魅悟》
[0092] CGMCC NO .11763菌株的耐膽鹽試驗：
[0093] 取CGMCCN0.11763菌液ImL接種菌種于含有不同膽鹽（含量梯度為0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液體培養基(？!1=6.4)，置于37°(：下分別培養0、2、411， 每個處理3個重復。各取Iml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1ml稀釋 液于MRS中涂布，于37°C生化培養箱中倒置培養48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄計算平 板上的菌數個數。結果見表2。可知該菌在膽鹽濃度為1 %處理4h后菌的生長量依然達到 0· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐膽鹽能力。
[0094] 表2耐膽鹽能力檢測[(土s) X 107cfu/ml]
[0096] CGMCC NO.11763菌株的耐酸試驗
[0097] 取CGMCC腸.11763母液按11111接種菌種于不同口!1值化!1梯度為1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的IOmL MRS液體培養基，置于37°C下分別培養0、2、4h，每一處理3個重復。各取Iml 樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋溶液，取0.1ml稀釋液于MRS中涂布，于37°C生化 培養箱中倒置培養48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄平板上的菌落個數。結果見表3。說 明該菌具有很強的耐酸能力。
[0098]表3 耐酸能力檢測[(土s) X 107cfu/ml]
[0100] CGMCC NO.11763菌株的黏附能力測定
[0101] 培養CGMCC NO. 11763(MRS液體培養基）、大腸桿菌DH5a(LB液體培養基)24h得發酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離心10min，收集菌泥，分別用pH = 7.0的無菌磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離心 IOmin，收集菌體）。自凝集率（％ :用無菌的I3BS將菌泥CGMCC NO. 11763制成在波長600nm處 的吸光值為0.4 ±0.1 (A 0)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測定吸光值A 24,自凝集率 (%)公式為(A 0-A 24)/A 0。；他凝集率（％):將CGMCC如.11763和大腸桿菌0耶€[的懸菌 液調節成在波長600nm處的吸光值為0.6±0.1(A 0)的混合懸浮菌液。靜置24H后測定吸光 值A 24,他凝集率（％ )公式為(A 0 -A 24)/A 0。測定結果見表4,可知CGMCC NO. 11763的 自凝集率為95.71 %，有很強的黏附能力。
[0102] 表4黏附能力表
[0104] 菌株生理特性
[0105] 所述植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 11763,保藏地 址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。
[0106] 該菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛， 不產芽孢;在固體培養基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態為圓形，邊緣較整齊。
[0107] 理化特征為:過氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實驗( + )，運動性(-)，發酵產氣 (_)，亞硝酸鹽還原(_)，發酵產氣(_)，產硫化氫氣體(_)，pH4.0 MRS培養基中生長(+ )。經過 生理生化鑒定為為植物乳桿菌（Lactobaci Ilus plantarum)，命名為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)XH〇
[0108] 菌株能夠在57°C下生長良好，葡萄糖耐受能力為275g/L。
[0109] 本發明植物乳桿菌由采集人李建樹，從新疆維吾爾族老鄉家中酸奶中分離得到， 采集時間2015年6月2日。
[0110] 5L發酵罐試驗
[0111] (1)取斜面上的植物乳桿菌CGMCC NO. 11763-環，接入裝有50mL培養基MRS(無瓊 脂）（葡萄糖濃度為150g/L)培養基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養12h左右，使菌體處 于對數生長中期。
[0112] (2)將對數期的菌種接入裝有3L MRS液體培養基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發酵 罐中。接種量為10%，37°(：下100印111培養8小時，對數前期溶氧控制10%(通氣0.5171^11)，后 期厭氧培養63小時。發酵結束后，植物乳桿菌CGMCC NO. 11763的乳酸產量達到110g/L。這樣 的產乳酸速率利于泡菜的快速發酵。
[0113] (4)將對數期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養基(單一氮源為2g/L亞硝 酸鈉的改性MRS篩選培養基）的5L發酵罐中。接種量為10 %，37°C下IOOrpm培養8小時，對數 前期溶氧控制10% (通氣〇.5L/min)，后期厭氧，發酵過程根據亞硝酸鹽的消耗速率流加 20g/L的亞硝酸鈉溶液，培養2-3天。發酵結束后，計算發酵過程植物乳桿菌CGMCC NO. 11763 對亞硝酸鈉的降解速率。結果發現:在該條件下，XH對亞硝酸鈉的降解速率可以達到653mg/ h/L〇
[0114] (5)將對數期的菌種IOmL接入裝有2kg預處理過的白菜中，按照傳統泡菜方法進行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結果發現，在整個發酵過程中，XH菌對亞硝酸 鈉的分解速率為10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于4.8mg/kg，遠低于國家 標準GB2714-2003中規定的含量(20mg/kg)。
[0115] 本發明產品的性能穩定，使用安全，與其它飼料添加劑均無配合禁忌。本發明產品 在飼料中的添加量為1-2%，它完全可以替代抗生素藥物，且無殘留，不污染環境。飼用后， 可顯著增強動物機體的免疫力和抗病力，促進生長，提高日增重和飼料轉化率，并有抗應 激、抗氧化效果；同時對腸道細菌性疾病有較強的預防作用。據試驗，飼用本發明飼料添加 劑的水產品，品質得到改善，符合動物性食品的綠色化生產要求，社會效益和經濟效益十分 顯著。
[0116] 本發明產品以生物發酵法生產的中國傳統食用菌為原料，產品質量穩定可控，產 品在體內無殘留、無環境污染、無抗藥性，而且可以提高免疫力、具有強的抑菌作用，能夠提 高養殖效益。產品完全符合綠色飼料添加劑的要求。
[0117] 實施例1
[0118] 本發明提供一種雞用飼料添加劑產品；重量份數組成如下：
[0119] 植物乳桿菌混合菌粉23,靈芝菌固體發酵培養物5,花椒粉0.6,黃芪提取物1，枯草 芽孢桿菌菌粉8;
[0120] 所述飼料添加劑產品制備方法為：將上述各原料粉碎混合后通過造粒機制為顆 粒。
[0121] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)為CGMCC6012。
[0122] 植物乳桿菌混合菌粉重量份數組成為:植物乳桿菌CGMCC No. 94051份，植物乳桿 菌CGMCC No .117636份；
[0123] 所述飼料添加劑產品制備方法為：將上述各原料粉碎混合后通過造粒機制為顆 粒。
[0124] 實施例2 -種雞用飼料添加劑產品；重量份數組成如下：
[0125] 本發明提供一種雞用飼料添加劑產品；重量份數組成如下：
[0126] 植物乳桿菌混合菌粉20，靈芝菌固體發酵培養物6，花椒粉0.5，黃芪提取物2，枯草 芽孢桿菌菌粉10;
[0127] 所述飼料添加劑產品制備方法為：將上述各原料粉碎混合后通過造粒機制為顆 粒。
[0128] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)為CGMCC6012。
[0129] 植物乳桿菌混合菌粉重量份數組成為:植物乳桿菌CGMCC No.9405 3份，植物乳桿 菌CGMCC No .11763 4份；
[0130] 實施例3 -種雞用飼料添加劑產品；重量份數組成如下：
[0131 ]本發明提供一種雞用飼料添加劑產品；重量份數組成如下：
[0132] 植物乳桿菌混合菌粉25，靈芝菌固體發酵培養物3，花椒粉I，黃芪提取物2，枯草芽 孢桿菌菌粉5;
[0133] 所述飼料添加劑產品制備方法為：將上述各原料粉碎混合后通過造粒機制為顆 粒。
[0134] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)為CGMCC6012。
[0135] 植物乳桿菌混合菌粉重量份數組成為:植物乳桿菌CGMCC No.94051份，植物乳桿 菌CGMCC No. 11763 6份；
[0136] 飼喂效果試驗：
[0137] 試驗于2014年8月-22日一11月29日在寧夏鹽池雞場進行。對照組為市場同類產 品，試驗組為飼喂本發明產品，添加量為均為3%。
[0138] 試驗雞分組:試驗采用單因子實驗設計，實驗材料選擇800只海蘭褐126日齡蛋雞， 分為兩個組，每組設6個重復；
[0139] 分別飼喂對照組和本發明飼料組。
[0140] 喂料方法：自由采食；
[0141] 測定指標包括:體重一開始和結束時兩次、采食量、成活率。產蛋率、蛋重、料蛋 比，蛋品質和蛋殼品質等，結果見表1、表2。
[0142] 表1本發明對蛋雞預產期生產性能的影響
[0147]從表1和表2試驗結果我們可以看出，本發明飼料在蛋重、產蛋率、料蛋比、采食量 和成活率等方面都有良好表現，充分說明了本發明產品的科學性和先進性。
【主權項】
1. 一種雞用飼料添加劑產品；重量份數組成如下：植物乳桿菌混合菌粉20-25，靈芝菌 固體發酵培養物3-6，花椒粉0.5-1，黃芪提取物1-2，枯草芽孢桿菌菌粉5-10。2. 根據權利要求1所述雞用飼料添加劑產品，其特征在于，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)SCGMCC6012。3. 根據權利要求1所述雞用飼料添加劑產品，其特征在于，植物乳桿菌混合菌粉重量份 數組成為:植物乳桿菌CGMCC No.94051-3份，植物乳桿菌CGMCC No. 117634-7份。4. 根據權利要求1所述雞用飼料添加劑產品，其特征在于，所述黃芪提取物制備方法如 下:黃芪粉碎，過40-50目篩后，添加黃芪3-6倍重量無水乙醇浸漬提取，控制溫度為60-65°C 3-4小時，提取液濃縮、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的黃芪殘渣中添加75-85Γ熱水， 熱水添加量為黃芪殘渣重量的2-4倍，處理時間30-50分鐘，連續提取2-3次，將提取液真空 濃縮后噴霧干燥，得到熱水提取物;將上述乙醇提取物和熱水提取物合并粉碎，過60目篩， 即得黃芪提取物。5. 根據權利要求1所述雞用飼料添加劑產品，重量份數組成如下:植物乳桿菌混合菌粉 23，靈芝菌固體發酵培養物5，花椒粉0.6，黃芪提取物1，枯草芽孢桿菌菌粉8。6. 根據權利要求5所述雞用飼料添加劑產品，植物乳桿菌混合菌粉重量份數組成為:植 物乳桿菌CGMCC No.94051份，植物乳桿菌CGMCC No. 117636份。7. 根據權利要求5所述雞用飼料添加劑產品，重量份數組成如下： 植物乳桿菌混合菌粉20，靈芝菌固體發酵培養物6，花椒粉0.5，黃芪提取物2，枯草芽孢 桿菌菌粉10。8. 根據權利要求5所述雞用飼料添加劑產品，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)為 CGMCC6012;植物乳桿菌混合菌粉重量份數組成為:植物乳桿菌CGMCC No. 94053份，植物乳 桿菌CGMCC No.117634份。9. 根據權利要求1-8任一所述雞用飼料添加劑產品的制備方法，所述飼料添加劑產品 制備方法為:將上述各原料粉碎混合后通過造粒機制為顆粒。
【文檔編號】A23K10/30GK105961824SQ201610251526
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】李秉京
【申請人】義烏市錦鈺信息科技有限公司