專利名稱：1,5－脫水山梨醇的定量方法以及定量用試劑的制作方法
技術領域：
本發明是關于對糖尿病等病癥的診斷有用的1，5-脫水山梨醇的定量方法以及定量用試劑。
1，5-脫水山梨醇(以下簡稱為[1，5-AG])存在于人的血清、血漿、尿等體液中。當人患有某種疾病，特別是糖尿病時，體液中1，5-AG的量會發生很大的變化，作為有用的診斷指標，它正成為近年臨床上重要的檢查項目。
1，5-AG的定量方法用得較多的是使吡喃糖氧化酶或山梨糖氧化酶作用，對生成的過氧化氫以過氧化物酶顯色系統作比色定量的方法(日本專利公報平5-41238號)，近年來被廣泛應用于自動分析裝置。但是，這些酶的底物特異性較弱，對葡萄糖等糖類也有較強的反應，所以有必要事先完全除去或消去試樣中的糖類。
日本專利公報平3-24200號提出了使用由假單胞菌屬的sp.NK-85001產生的、對1，5-AG具有較高特異性的1，5-AG氧化酶，對這種氧化酶和1，5-AG反應后的氧的消耗量以及電子接受體的還原體等的反應生成物進行定量的方法。但是，對氧的消耗量的定量方法等不適合多試樣處理；對電子接受體的還原體定量的方法，如同一公報的實施例中將鐵氰化物、二氯苯酚靛酚這樣的化合物作為電子接受體時，其還原體自身是可逆的，不太穩定，而且靈敏度方面也不夠，所以也是一種不適合實際使用的方法。
以NAD作為輔酶的1，5-AG脫氫酶(日本專利公開公報平2-268679號)用于定量時，因為有時受以NAD為輔酶的生物體試樣中所含有的酶，例如乳酸脫氫酶等的影響，所以在準確性方面存在問題。
被確認存在于土壤桿菌屬的可溶性部分(The Journal of Biological Chemistryvol.242，No.16，pp.3665-3672，1967)和黃桿菌屬的膜部分的葡糖苷3-脫氫酶[EC1.1.99.13]也是以1，5-AG為底物的(Journal of Biochemistry vol.100，No.4，pp.1049-1055，1986)。但是，這些酶的底物特異性較弱，有必要事先完全除去或消去試樣中的糖類，而且將鐵氰化物和二氯苯酚靛酚作為電子接受體使用，在安全性以及靈敏度方面存在問題。
1，5-AG在臨床上的意義是糖尿病患者的血清或血漿中的1，5-AG濃度特異地降低到數μg/ml的程度。相反，葡萄糖的濃度對應于健康人的100mg/dl，糖尿病患者卻達到了1000mg/dl的程度，1，5-AG和葡萄糖的濃度差達到數千倍。到目前為止還沒有發現能夠對試樣中與如此高濃度的葡萄糖共存的1，5-AG直接定量的、具有完全特異性的酶。
利用對1，5-AG特異性較弱，而和葡萄糖有較強反應性的吡喃糖氧化酶或山梨糖氧化酶進行定量時，有必要將葡萄糖完全除去或消去。為此，提出了各種各樣的方法。例如，日本專利公報平5-41238號提到為除去葡萄糖等糖類，配合使用離子交換樹脂進行前處理的方法。另外，作為消去葡萄糖的方法，日本專利公開公報平1-320998號、日本專利公報平7-71514號、日本專利公開公報平6-237795號、日本專利公開公報平3-27299號、日本專利公開公報6-245796號等揭示了利用葡萄糖6位磷酸化酶(葡糖激酶或己糖激酶)，為使反應進行完全而使葡萄糖磷酸化反應平衡完全移向生成葡萄糖-6-磷酸方向的方法(由幾種酶以及底物組成共軛體系)。這個方法還能夠減輕ATP對吡喃糖氧化酶的抑制作用，在日本專利公報平7-102154號、日本專利公報平7-108236號中提到了通過規定吡喃糖氧化酶作用的pH條件和利用來源不同的吡喃糖氧化酶，能夠使ATP的抑制作用消除的方法。
但是，上述的方法中，使用離子交換樹脂的方法操作復雜，不適合多試樣處理。而葡萄糖6位磷酸化酶和數種酶組成共軛體系的方法的反應體系較復雜，必須考慮所用的酶以及底物等的穩定性的問題。此外，以葡萄糖6位磷酸化酶進行單獨處理的方法中，為使葡萄糖完全變換消去，必須使ATP大量過量，而且對吡喃糖氧化酶的來源和反應條件等也有諸多限制，所以作為測定1，5-AG的試劑不能被廣泛應用。
本發明的目的就是提供利用簡單的操作就能夠以較高的精密度和靈敏度測定試樣中的1，5-AG，并能應用于自動分析儀器的1，5-AG的定量法以及定量用試劑。
為了解決以上的課題，本發明者們在對能夠用于1，5-AG分析的反應體系進行研究的同時，還對能夠應用于此的酶進行了研究。其結果發現在屬于土壤桿菌(Agrobacterium)屬的微生物的膜部分中存在特異性氧化1，5-AG的新穎的酶(以下稱為1，5-AG脫氫酶)。使這種1，5-AG脫氫酶作用于1，5-AG，不僅能夠氧化1，5-AG2位的羥基，而且可以作為2，6-二氯苯酚靛酚等電子接受體進行還原反應的催化劑，另外如用還原性顯色劑進行該反應，在電子載體不存在的情況下，也能使1，5-AG2位的羥基氧化，同時直接還原還原性顯色劑，生成顯色物質。以這些事實為基礎完成了本發明。
即本發明的1，5-AG定量方法的特征就是利用既作用于1，5-AG，又在電子載體不存在的情況下能催化直接還原還原性顯色劑的反應的1，5-AG脫氫酶，在還原性顯色劑存在下，使前述的1，5-AG脫氫酶作用于試樣中的1，5-AG，然后測定生成的被還原的顯色物質。
本發明的1，5-AG定量用試劑的特征就是包括既作用于1，5-AG，又在電子載體不存在的情況下能催化直接還原還原性顯色劑的反應的1，5-AG脫氫酶，以及還原性顯色劑。
按照本發明的方法，通過在含有1，5-AG的試樣中添加還原性顯色劑，使1，5-AG脫氫酶作用于此，這樣1，5-AG脫氫酶就特異地作用于1，5-AG，在使1，5-AG氧化的同時，還直接還原還原性顯色劑，使其顯色。這個反應是不可逆的反應，因為不受生物體試樣等所含的酶的影響，其靈敏度較高，而且定量準確。此外，反應體系簡單，組成試劑的種數也較少，操作性能提高，還適用于自動分析儀器。


圖1表示培養根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)NT1130株后得到的1，5-AG脫氫酶的最適pH。
圖2表示上述1，5-AG脫氫酶的pH穩定性。
圖3表示上述1，5-AG脫氫酶的最適溫度。
圖4表示上述1，5-AG脫氫酶的溫度穩定性。
圖5表示比較上述1，5-AG脫氫酶、由根癌土壤桿菌IFO13532得到的1，5-AG脫氫酶以及由根癌土壤桿菌IFO13533得到的1，5-AG脫氫酶的保藏穩定性的圖表。
圖6表示利用含有還原性顯色劑的第1試劑和含有1，5-AG脫氫酶的第2試劑，對各種濃度的1，5-AG溶液進行測試的結果。
圖7表示利用含有還原性顯色劑的第1試劑和含有1，5-AG脫氫酶的第2試劑，對在含有一定濃度的1，5-AG的溶液中添加不同濃度葡萄糖后進行測試的結果。
圖8表示利用含有還原性顯色劑以及葡萄糖消去劑的第1試劑和含有1，5-AG脫氫酶的第2試劑，對在含有一定濃度的1，5-AG的溶液中添加不同濃度葡萄糖后進行測試的結果。
圖9表示利用還原性顯色劑、葡萄糖消去劑以及1，5-AG脫氫酶在1液中混合組成的試劑，對在含有一定濃度的1，5-AG的溶液中添加不同濃度葡萄糖后進行測試的結果。
本發明測定試樣中1，5-AG的濃度，對試樣沒有特別的限定，如血清、血漿或尿。
本發明所用的1，5-AG脫氫酶只要既能夠特異地作用于1，5-AG，又能夠在電子載體不存在的情況下催化直接還原還原性顯色劑的反應，而對其沒有特別的限定。但是，較好的是使用屬于土壤桿菌屬的具有產生1，5-AG脫氫酶能力的微生物，特別好的是使用由根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)IFO13532、根癌土壤桿菌IFO13533以及根癌土壤桿菌NT1130株得到的1，5-AG脫氫酶。
根癌土壤桿菌IFO13532和根癌土壤桿菌IFO13533是從財團法人發酵研究所(INSTITUTE FOR FERMENTION，OSAKA(IFO)、地址日本國大阪府大阪市淀川區十三本町2丁目17番85號、郵政編碼532(17-85，Jusanhonmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka532，Japan))獲得的市售菌株。
根癌土壤桿菌NT1130株根據關于專利手續上微生物保藏的國際協定布達佩斯條約(BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL，RECOGNITION OFTHE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OFPATENTPROCEDURE)，以FERMBP-5997號的保藏編號被保藏在國立生命科學和人體技術研究所。保藏者是第一化學藥品株式會社(DAIICHI PURECHEMICALS CO.，LTD.，地址日本國東京都中央區日本橋3丁目13番5號、郵政編碼103(13-5，Nihonbashi3-chome，Chuo-ku，Tokyo 103，Japan))。
其中的根癌土壤桿菌NT1130株是本發明者們從土壤中分離出來的菌株，與已有菌株根癌土壤桿菌IFO13532以及根癌土壤桿菌IFO13533得到的1，5-AG脫氫酶相比，其保藏穩定性很好，這一點特別理想。當然不僅可從保藏的菌株中選擇，也可從土壤等自然界中進一步分離，或使用變異菌株，還可以把由這些菌株產生的和酶的產生有關的基因重組入宿主來產生酶。
作為參考，上述的根癌土壤桿菌NT1130株的細菌學性質記載如下。
A.形態學的特征1.細胞的形態以及大小桿菌，大小為(0.3-0.5)×(1.0-3.0)μm2.胞子的有無無3.運動性有運動性，周圍有鞭毛4.革蘭氏染色性陰性B.生理學的性質1.過氧化氫酶陽性2.氧化酶陽性3.尿素酶陽性4.明膠液化陰性
5.吲哚的生成陰性6.硫化氫的生成陰性7.檸檬酸的利用陰性8.七葉苷分解性陽性9.β-半乳糖苷酶陽性10.硝酸鹽的還原陽性(±)11.是否需要氧需氧12.生長溫度25-35℃13.是否需要糖由葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露糖醇、蔗糖生成酸，但不產生氣體。
C.醌的組成分析輔酶Q10(98％)根據以上的結果，認為這種菌株屬于土壤桿菌屬(Agrobacterium)。通常，在鑒定微生物時都要與總結各種微生物在分類學上的性質的《Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology》進行比較來進行鑒定，至于考慮本菌株屬于土壤桿菌屬是在最近根據16SrRNA的基因序列試行系統分類(參照International Journalof Bacteriology vol.43，1993，p.694-702，以及vol.44，No.2，1994，p.373-374)的結果改變了分類標準而得出的。這個結果對種的整合和菌株的分類加以變更，而不能保持和《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》的一致性。
為此，對本菌試用16SrRNA的基因序列進行了系統的分類。這種方法就是求出本菌的16SrRNA的全部基因序列，檢索它和基因數據庫(GenBank，EMBL以及DDBJ)中被登記公開的微生物基因序列的相同性，其結果與根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的相同性為99.4％，一致性顯著。從這個結果可以鑒定本菌株是屬于土壤桿菌屬根癌種的細菌，本菌株被命名為根癌土壤桿菌NT1130株(Agrobacterium tumefaciens NT1130)。如前所述，本菌于平成9年6月27日保藏在國立生命科學和人體技術研究所(日本國茨城縣つくげ市東1丁目1番3號)，其保藏編號為FERM BP-5997。
本發明使用的1，5-AG脫氫酶是通過在營養培養基中培養上述的菌株，在膜部分中使1，5-AG脫氫酶生成、蓄積，然后收集得到所需的1，5-AG脫氫酶。上述的營養培養基是指含有碳源、無機氮源以及無機鹽的培養基。碳源基本上利用的是糖類，例如誘導酶的L-山梨糖、葡萄糖等都可以使用。無機氮源包括硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等。無機鹽包括鈉、鉀、鎂、鐵、錳等的鹽類。
這些實驗的結果列于表4中。80％的用純化的重組22kDa表面蛋白免疫過的小鼠在細菌攻擊后存活下來，而對照組中存活率僅0％到42％。重要的是，對照組中注射濃縮的大腸桿菌培養上清的小鼠并不能抵抗細菌的攻擊。后一結果清楚地表明培養基中的成分或純化后少量留存的大腸桿菌的抗原并不是所觀察到的抗腦膜炎奈瑟氏球菌的原因。表4 用純化的重組22kDa表面蛋白免疫后獲得的抵抗其后的腦膜炎雙球菌608B株(B2aP1.2)攻擊的保護作用
結論純化的重組22kDa表面蛋白的注射可極大地保護被免疫鼠，以抵御由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的致死性感染的發生依據本發明，抗體是以由鼠雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體Me-1和Me-7為例，此二抗體已于1995年7月21日存入美國馬里蘭州洛克維爾的美國典型培養物保藏中心(ATCC)。保藏號是HB 11959(Me-1)和HB 11958(Me<p>其結果是在反應進行的同時，保留時間10.0分的1，5-AG的峰減少，在新的保留時間9.6分的位置出現反應物的峰。這個反應的摩爾平衡是一致的。使具有氧化1，5-AG3位羥基作用的葡糖苷-3-脫氫酶(EC1.1.99.13)在同樣的條件下反應，HPLC分析的結果是在1，5-AG的峰減少的同時，在新的保留時間10.8分的位置出現反應物的峰。另一方面，在含有2.5mM1，5-AG的40mM硼酸緩沖液(pH7.5)中添加具有氧化1，5-AG2位羥基作用的吡喃糖氧化酶(ECl.1.3.10)，于37℃使之反應，其結果是在1，5-AG峰減少的同時，在新的保留時間9.6分的位置上出現反應物的峰。這些結果表明，本發明的酶作用于1，5-AG的反應生成物和吡喃糖氧化酶作用于1，5-AG的反應生成物的保留時間是一致的，所以可以確定本發明的酶使1，5-AG氧化的部位是2位的羥基。
(2)底物的特異性利用前述的測定酶活性的方法，用各種糖溶液(任何一種的最終濃度均為5mM)替代1，5-AG測得的相對反應性(底物特異性)如表2所示。本發明的酶對1，5-AG的作用很強，對L-山梨糖的作用較弱，對D-葡萄糖略有作用。
表2
(3)最適pH使用本發明的酶，不用前述的測定酶活性的方法中的緩沖液，而使用各種不同pH的檸檬酸緩沖液、磷酸鉀緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液以及甘氨酸緩沖液測定酶的活性。其結果如圖1所示。從圖1可看出，本發明的酶的最適pH值在8.0-9.0附近。
(4)pH穩定性在以上的具有不同pH值的檸檬酸緩沖液、磷酸鉀緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液以及甘氨酸緩沖液(各種緩沖液都為200mM)中添加本發明的酶，于37℃對酶進行處理，時間為60分鐘，然后測定殘存的酶活性。其結果如圖2所示。從圖2可看出，本發明的酶的穩定pH范圍在6.0-9.0。
(5)最適溫度使用本發明的酶，按前述的測定酶活性的方法的組成在各種不同的溫度下反應10分鐘，其結果如圖3所示。從圖3可看出，本發明的酶的最適溫度在35-45℃附近。
(6)溫度穩定性在20mM磷酸鉀緩沖液中添加本發明的酶，在各種不同的溫度下對其進行處理，時間為10分鐘，測定殘存的酶活性，其結果如圖4所示。從圖4可看出，本發明的酶在40℃附近有90％以上保持穩定狀態。
(7)電子接受體用相對活性表示在100mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)中，使電子接受體和本發明的酶共存時的各電子接受體的活性，如表3所示。從表3可看出，電子接受體除了作為還原性顯色劑的硝基四唑鎓藍，還可利用2，6-二氯苯酚靛酚以及鐵氰化物。
表3
(8)分子量利用月桂基硫酸-聚丙烯酰胺電泳法求得的本發明的酶的分子量約為55,000。
(9)Km值用Lineweaver-Burk作圖法求得的本發明的酶對1，5-AG的Km值約為0.5mM。
(10)保藏穩定性將本發明的酶以0.1u/ml的濃度溶解于100mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(pH7.0)中，于4℃保藏14天，在保藏7天和14天后分別測定殘存的活性，其結果如圖5所示。
另一方面，作為比較，使用保藏在財團法人發酵研究所的可轉讓的公知的菌株根癌土壤桿菌IFO13532、根癌土壤桿菌IFO13533，用與上述同樣的方法測定制得的1，5-AG脫氫酶的保藏穩定性，其結果也一并表示在圖5中。
圖5中，■-■表示由根癌土壤桿菌NT1130株得到的本發明的酶的結果；◆-◆表示由根癌土壤桿菌IFO13532得到的酶的結果；▲-▲表示由根癌土壤桿菌IFO13533得到的酶的結果。
如圖5所示，由根癌土壤桿菌NT1130株得到的1，5-AG脫氫酶保藏14天后的殘存活性在90％以上，顯示出良好的保藏穩定性。與此相比較，由根癌土壤桿菌IFO13532得到的1，5-AG脫氫酶以及由根癌土壤桿菌IFO13533得到的1，5-AG脫氫酶保藏14天后的殘存活性都在40％以下，保藏穩定性較差。
本發明者們發現的由根癌土壤桿菌NT1130株得到的1，5-AG脫氫酶和由根癌土壤桿菌IFO13532得到的1，5-AG脫氫酶以及由根癌土壤桿菌IFO13533得到的1，5-AG脫氫酶相比，在上述的保藏穩定性方面存在顯著差異，但在其他的理化性質上卻沒有明顯的差別。
本發明的1，5-AG的定量法可通過以下方法進行。即在還原性顯色劑的存在下，使試樣與1，5-AG脫氫酶或含有此酶的酶制劑一起保溫、生成2-酮基-1，5-AG以及被還原的顯色物質，測定生成的顯色物質的量，對試樣中的1，5-AG量進行定量。
上述定量方法中可使用的緩沖液包括pH6-10的磷酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、Good緩沖液、硼酸緩沖液等，可以使用通常所用的緩沖液的任何一種。
還原性顯色劑可使用四唑鎓或其鹽等。具體可使用硝基四唑鎓藍(以下以NTB略稱)、氯化2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓、溴化3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H四唑鎓鹽(以下以WST-1略稱)。其使用濃度一般為50-2000μmol/L，較好的是在100-1000μmol/L的范圍內。
本發明的定量方法中，1，5-AG脫氫酶的用量一般為20-10000單位/L，較好的是在200-2000單位/L的范圍內。
對反應液中的被還原的顯色性物質的測定是經過上述反應之后，在顯色物質特有的吸收波長處，通過對一定時間后的吸光度或一定時間內的吸光度變化的測定進行的。
本發明的定量方法中，較好的是在使試樣中的葡萄糖轉變為1，5-AG脫氫酶不發揮作用的狀態后；或一邊轉變一邊在還原性顯色劑存在下，使前述的1，5-AG脫氫酶作用于試樣中的1，5-AG。為此，試劑中較好的是含有葡萄糖的消去劑，這種葡萄糖消去劑較好的是含有葡萄糖6位磷酸化酶和腺苷三磷酸的物質。
本發明所用的1，5-AG脫氫酶對1，5-AG的特異性很高，但并不具有完全的特異性，它對于葡萄糖也有一些作用。所以，在測定1，5-AG和葡萄糖的濃度差達數千倍的糖尿病患者的血清或血漿中的1，5-AG時，不受葡萄糖很大影響。因此，通過并用葡萄糖消去劑，可以進一步提高糖尿病患者的血清、血漿等試樣的測定精確度。
此時，本發明的試樣中共存的葡萄糖如被減少到一定程度，由于對1，5-AG的高特異性，所以使葡萄糖的影響幾乎可以忽略不計，但沒有完全消去葡萄糖的必要。因此，只要葡萄糖消去劑能夠使葡萄糖的濃度減少到不和1，5-AG脫氫酶發生反應就可以了。
作為葡萄糖消去劑使用的葡萄糖6位磷酸化酶包括葡糖激酶、己糖激酶等，被分類為EC2.7.1.2.、EC2.7.1.1.的酶，對其沒有特別的限定，市售的產品也可以使用，較好的是使用對葡萄糖特異性較高的葡糖激酶。這些消去劑的用量根據試樣中葡萄糖的量的不同而不同，一般為0.1-50u/ml。又，葡萄糖磷酸化所必需的腺苷三磷酸(ATP)的量，也是依試樣中葡萄糖的量的不同而不同，一般為1-20mM。此外，為了促進葡萄糖磷酸化，通常還含有5-50mM作為無機、有機鹽類的鎂離子。消去葡萄糖的葡萄糖磷酸化反應在pH6～10的緩沖液中于20～50℃，較好是在5～37℃于添加后進行10分鐘。可使用的緩沖液為甘氨酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、Good緩沖液等，通常使用的緩沖液都可使用。
用上述各試劑處理以消去試樣中的葡萄糖，較好的形式是作為1，5-AG脫氫酶反應的前處理，但由于本發明所用的1，5-AG脫氫酶的底物特異性高，所以能使葡萄糖減少到不與1，5-AG脫氫酶反應的濃度水平即可，通過將葡萄糖消去劑、1，5-AG脫氫酶的濃度和反應時間在適當條件下組合，也可能使上述試劑在1液中進行葡萄糖處理和1，5-AG定量。
因此，本發明的1，5-AG定量用試劑，既可以將葡萄糖消去劑和定量用酶分別組合，也可以將葡萄糖消去劑和定量用酶混合成1個試劑進行定量。更具體講，或是由含有還原性顯色劑與葡萄糖消去劑的第1試劑，以及含有1，5-AG脫氫酶的第2試劑組成1種試劑，或者形成含還原劑顯色劑、葡萄糖消去劑以及1，5-AG脫氫酶于1液中的另1種試劑，兩者都是較好的。
以下，以實施例對本發明進行更詳細地說明，但本發明并不僅限于此。
制造例1[由根癌土壤桿菌NT1130株獲得1，5-AG脫氫酶]在200ml容量的培養瓶中添加50ml由2％磷酸二鉀、0.5％磷酸一鉀、0.75％氯化鉀、2.5％氯化鈉、1.25％氯化銨、0.025％硫酸鈉、0.005％硫酸鎂以及0.1％L-山梨糖組成的培養基(pH7.0)，于120℃滅菌，時間為15分鐘，然后冷卻，用鉑接種環接種根癌土壤桿菌NT1130株(FERM BP-5997)，于30℃振蕩培養3天得到種子培養液。在2升的培養瓶中，將所得的種子培養液10ml接種到與上述相同組成的液體培養基1000ml中，于30℃振蕩培養3天。
培養結束后，離心分離回收菌體。在每1升培養液中所得菌體的量約為2g。將每克所得菌體懸浮在2.5ml 20mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.2)中，用超聲波勻化器將菌體切碎。以10,000g離心分離所得的破碎液，以100,000g再次離心分離上清液，得到膜部分。將每克膜部分懸浮在含有10ml的1％triton X-100的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)中，攪拌一晚上使膜部分進行酶的可溶化。再次以100,000g對所得的可溶化液進行離心分離，除去膜殘渣，得到粗的酶溶液。按照前述的酶活性的測定方法對所得的粗的酶溶液進行測定，其結果是每克菌體含有2單位的活性。
制造例2[1，5-AG脫氫酶的精制]將制造例1中得到的可溶化液通過事先經含有1％triton X-100的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)平衡的羥基磷灰石柱，使酶被吸附，用相同組成的緩沖液洗滌后，以含有1％triton X-100的20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)的線性梯度洗脫，收集酶的活性部分。為了進一步提高比活性，再次通過羥基磷灰石柱，進行與上述同樣的操作，收集活性部分，用超濾進行濃縮，得到比活性為14單位/mg蛋白質的精制酶。在聚丙烯酰胺電泳中，該精制標準品顯示出單一的條帶。
實施例1[利用不含有葡萄糖消去劑的試劑對1，5-AG進行定量]利用作為還原性顯色劑的WST-1和制造例2得到的1，5-AG脫氫酶，配制以下表4所示的第1試劑和第2試劑作為定量用試劑。使用此試劑，測定各種濃度的1，5-AG溶液以及各種濃度的葡萄糖溶液。
即對應于10μl含有各種濃度1，5-AG的溶液，或10μl含有一定濃度1，5-AG和各種濃度葡萄糖的溶液，首先添加表4所示的第1試劑320μl，于37℃反應5分鐘，接著添加第2試劑70μl，同樣地于37℃反應5分鐘。然后利用日立7070型自動分析儀器在主波長450nm、副波長700nm，用2點檢定法測定吸光度。
其結果如圖6、7所示。圖6表示的是對含有各種濃度1，5-AG的溶液測定的結果；圖7表示的是對既含有一定濃度的1，5-AG又含有各種濃度葡萄糖的溶液測定的結果。
從圖6可看出，1，5-AG的濃度在0-50μg/ml之間時，能夠得到線性的顯色吸光度，可以對1，5-AG定量。從圖7可看出，有葡萄糖共存時，隨著葡萄糖濃度的上升，吸光度也會成比例地上升，但共存的葡萄糖濃度在100μg/ml以下時，吸光度的變化較小，換算成1，5-AG不足2μg/ml。從這個結果可看出，使用了由制造例2得到的底物特異性高的1，5-AG脫氫酶，即使還殘存1，5-AG濃度水平的葡萄糖，也能夠基本準確地測定1，5-AG。所以，可以說不必完全消去葡萄糖。
表4
實施例2[利用包含葡萄糖消去劑的試劑對1，5-AG進行定量]利用表5所示的含有葡萄糖消去劑的第1試劑和制造例2得到的含有1，5-AG脫氫酶的第2試劑，試樣為既含有一定濃度1，5-AG又含有各種濃度葡萄糖的溶液，用與實施例1相同的方法，測定1，5-AG，其結果由圖8表示。
如圖8所示的，含有1500mg/dl葡萄糖的試樣和不含有葡萄糖的試樣的吸光度相同，所以只要用簡便的消去方法就能夠大致消去高濃度的葡萄糖，并能準確地對1，5-AG進行定量。
表5
實施例3[利用含有葡萄糖消去劑的試劑對1，5-AG定量]利用表6所示組成的含葡萄糖消去劑、還原性顯色劑以及制造例2得到的1，5-AG脫氫酶的1液組成的試劑，試樣為既含有一定濃度1，5-AG又含有各種濃度葡萄糖的溶液，測定1，5-AG。
即在8μl試樣中添加上述表6所示的試劑312μl，然后反應15分鐘，利用日立7070型自動分析儀器在主波長450nm、副波長700nm，用1點檢定法測定吸光度，測定溫度為37℃。其結果如圖9所示。
從圖9可看出含有1500mg/dl葡萄糖的試樣和不含有葡萄糖的試樣的吸光度幾乎相同，所以只要用1液組成的簡便的測定試劑就能夠大致消去高濃度的葡萄糖，并能準確地對1，5-AG進行定量。
表6
如上所述，利用本發明，在含有1，5-AG的試樣中添加還原性顯色劑，使1，5-AG脫氫酶對其作用，1，5-AG脫氫酶能夠特異性地作用于1，5-AG，在1，5-AG氧化的同時，還原性顯色劑直接還原并顯色，能從試樣的吸光度對其中的1，5-AG進行定量。上述的反應是不可逆反應，不會受到生物體試樣中所含的酶的影響，所以靈敏度較高，能夠準確地定量。而且，反應體系較簡單，組成試劑的種類也較少，操作性能提高，還可用于自動分析儀器。
此外，并用葡萄糖消去劑，使共存于試樣中的葡萄糖的濃度減少到一定程度，由于本發明所用的1，5-AG脫氫酶對1，5-AG有較高的特異性，幾乎可忽略葡萄糖的影響，所以既使將1，5-AG和葡萄糖的濃度差達數千倍的糖尿病患者的血清或血漿作為試樣，也能夠得到較高的測定精度。
權利要求
1.一種1，5-脫水山梨醇的定量方法，其特征在于，使用了作用于1，5-脫水山梨醇的同時，在電子載體不存在時能催化直接還原還原性顯色劑的反應的1，5-脫水山梨醇脫氫酶，在還原性顯色劑存在下，使前述的1，5-脫水山梨醇脫氫酶作用于試樣中的1，5-脫水山梨醇，測定生成的被還原的顯色物質。
2.如權利要求1所述的1，5-脫水山梨醇的定量方法，其特征還在于，利用葡萄糖消去劑在使試樣中的葡萄糖轉變為和前述1，5-脫水山梨醇脫氫酶不發生反應的結構后，或一邊轉變一邊在還原性顯色劑存在下，使前述的1，5-脫水山梨醇脫氫酶作用于試樣中的1，5-脫水山梨醇。
3.如權利要求2所述的1，5-脫水山梨醇的定量方法，其特征還在于，前述的葡萄糖消去劑含有葡萄糖6位磷酸化酶和腺苷三磷酸。
4.如權利要求1所述的1，5-脫水山梨醇的定量方法，其特征還在于，前述的還原性顯色劑為四唑鎓或其鹽類。
5.如權利要求1所述的1，5-脫水山梨醇的定量方法，其特征還在于，前述的1，5-脫水山梨醇脫氫酶由屬于土壤桿菌屬、能夠產生1，5-脫水山梨醇脫氫酶的微生物產生。
6.如權利要求1所述的1，5-脫水山梨醇的定量方法，其特征還在于，前述的1，5-脫水山梨醇脫氫酶是具有以下理化性質的酶，(1)作用在電子載體不存在時特異性地作用于1，5-脫水山梨醇，氧化其2位的羥基，又是直接還原還原性顯色劑反應中的催化劑；(2)底物特異性對1，5-脫水山梨醇有較強的作用，對L-山梨糖的作用較弱，對D-葡萄糖略有作用；(3)最適pH最適pH在8.0-9.0附近；(4)pH穩定性pH為6.0-9.0時較穩定；(5)最適溫度最適溫度在35-45℃附近；(6)溫度穩定性在40℃附近90％以上保持穩定。(7)效價的測定方法由1.5ml 0.2M的磷酸鉀緩沖液(pH8.0)、0.3ml 0.25重量％的硝基四唑鎓藍、0.3ml2重量％的非離子性表面活性劑、0.3ml 50mM的1，5-脫水山梨醇水溶液、0.45ml水以及0.15ml酶溶液組成全量為3.0ml的含有酶的溶液，使其在37℃反應，測定其在540nm的吸光度(ΔmOD/min)變化，在此條件下生成的甲色素的分子吸光系數為16.7×103，1分鐘內生成1μmol甲的酶量作為1單位(unit)，1，5-脫水山梨醇脫氫酶的活性可以通過以下的式1求得酶活性(units/ml)＝[(ΔmOD/min)/16.7]×(3.0/0.15)×酶的稀釋度；(8)電子接受體除了2，6-二氯苯酚靛酚、鐵氰化物等，還可以利用還原性顯色劑，但不能利用NAD、DADP等輔酶或溶解氧；(9)分子量利用月桂基硫酸-聚丙烯酰胺電泳法測得的分子量約為55,000。
7.一種1，5-脫水山梨醇的定量用試劑，其特征在于，包含作用于1，5-脫水山梨醇的同時，還在電子載體不存在時催化直接還原還原性顯色劑的反應的1，5-脫水山梨醇脫氫酶和還原性顯色劑。
8.如權利要求7所述的1，5-脫水山梨醇的定量用試劑，其特征還在于，在前述組分的基礎上還包含葡萄糖消去劑。
9.如權利要求8所述的1，5-脫水山梨醇的定量用試劑，其特征還在于，前述的葡萄糖消去劑含有葡萄糖6位磷酸化酶和腺苷三磷酸。
10.如權利要求7所述的1，5-脫水山梨醇的定量用試劑，其特征還在于，前述的還原性顯色劑為四唑鎓或其鹽類。
11.如權利要求7所述的1，5-脫水山梨醇的定量用試劑，其特征還在于，前述的1，5-脫水山梨醇脫氫酶由屬于土壤桿菌屬、能夠產生1，5-脫水山梨醇脫氫酶的微生物產生。
12.如權利要求7所述的1，5-脫水山梨醇的定量用試劑，其特征還在于，前述的1，5-脫水山梨醇脫氫酶是具有前述的權利要求6所述的理化性質的酶。
全文摘要
本發明以體液為試樣,使用了作用于1,5－AG的同時,還在電子載體不存在時催化直接還原還原性顯色劑的反應的1,5－AG脫氫酶,較好的是利用葡萄糖消去劑在使試樣中的葡萄糖轉變為和1,5－AG脫氫酶不發生反應的結構后,或一邊轉變一邊在還原性顯色劑存在下,使前述的1,5－AG脫氫酶作用于試樣中的1,5－AG,測定生成的被還原的顯色物質。所用的1,5－AG脫氫酶較好的是由屬于土壤桿菌屬、能夠產生1,5－AG脫氫酶的微生物產生。
文檔編號C12Q1/32GK1190188SQ9712604
公開日1998年8月12日 申請日期1997年12月4日 優先權日1996年12月4日
發明者海老沼宏幸, 牛澤幸司 申請人:第一化學藥品株式會社