專利名稱：一種重組假絲酵母尿酸氧化酶的制備方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及假絲酵母尿酸氧化酶基因的克隆、基因工程表達和含有假絲酵母尿酸氧化酶的制劑作為人類痛風及血液系統腫瘤化療所引起的高尿酸血癥的治療藥物。
假絲酵母尿酸氧化酶全長303個氨基酸，分子量為34.19kDa，等電點為8.4。尿酸氧化酶(UOX)是嘌呤代謝途徑上的關鍵酶之一。不同種類的生物分解嘌呤堿的能力不一樣，因而代謝產物亦各不相同。人和猿類及一些排尿酸的動物以尿酸作為嘌呤堿代謝的終產物。假絲酵母和大鼠等多種生物則能產生尿酸氧化酶，該酶進一步分解尿酸，形成尿囊素。后者在水中的溶解度遠大于尿酸，從而有利于大鼠等哺乳動物清除體內尿酸。在長期的進化過程中，人類的尿酸氧化酶基因發生突變，不能正常編碼尿酸氧化酶，因此當體內尿酸水平增加時容易引起以血液尿酸水平增高為特征的痛風或者尿酸性腎病。在臨床上，由于UOX能夠分解尿酸，可有效地分解尿酸，降低血液尿酸濃度，因此可以用來治療高尿酸血癥。
多年來，國外一直使用從黃曲霉菌中提取的尿酸氧化酶，國內也有進口。2002年FDA批準了法國Sanofi公司研制的重組黃曲霉菌尿酸氧化霉，用于青少年及兒童白血病、淋巴瘤化療后高尿酸血癥的預防和治療。我們通過PCR的方法，從假絲酵母基因祖DNA中擴增出UOX基因，經過對SD序列等原核表達元件的優選，構建了高效原核表達質粒，轉化原核細胞獲得了高水平外源基因表達，表達產物經離子交換等手段得到了純化。
本發明采用下述技術方案(1)本發明首先設計合成了人用于擴增假絲酵母UOX基因的特異性引物。為了保證擴增的專一性，該兩條引物理論退火溫度旁設為72℃。上游引物長16-46bp，下游引物長16-45bp。根據原核表達原理，考慮到SD序列等因素在不同類型質粒中對表達效率的影響，在上游引物5’端添加EcoRI或者其它酶切位點，優選EcoRI以適應最佳表達元件搭配要求，提高目的基因在宿主菌中的表達水平。以假絲酵母AS2.1495基因組DNA為模板，以兩步法擴增目的基因，得到了專一的目的基因產物。得到的PCR產物與pUC19連接，測序正確后將PCR擴增產物插入國內外已廣泛采用的高效表達載體pBV220或者其它原核表達載體中，優選pBV220質粒構建成假絲酵母尿酸氧化酶表達質粒pUOX。它能在大腸桿菌JM109和DH5α中高表達，使尿酸氧化酶占菌體總蛋白的50-60％左右，表達率經100次以上傳代不降低。
(2)通過發酵工程菌，用2YT作為基礎培養基，適當增加碳源和氮源，通過優化溶氧、攪拌速度、發酵pH值等工藝參數，最終培養物OD600值可達25左右，生物量為每升培養物30-35g，產物表達率在50-60％之間。產物表達量可達每升培養物400mg以上，真正實現了高水平表達。
(3)在發酵基礎上建立了純化工藝，其中包括菌體的破碎和產物抽提、酸處理去除雜蛋白、陽陰離子交換層析和凝膠排阻層析精制等。
所建立的工藝穩定、回收率高、活性好。本工藝具有以下特點①通過酸處理去除了30％以上的可溶性蛋白，而目標蛋白尿酸氧化酶無損失；②陽、陰離子交換層析可去除幾乎所有的剩余雜蛋白；③最后一步凝膠排阻層析可以去除大小分子量的酸性雜質。本工藝對三批各22.5L發酵產物純化后每批可得純品5-8g。
(4)純品加入藥用甘露醇以及磷酸鹽緩沖液等穩定劑和助溶劑后，用微孔濾膜過濾除菌，冷凍干燥成粉狀成品。注射用水溶解后應用，可用于高尿酸血癥的治療。
本品在體外能明顯降低血清中的尿酸濃度，據此可以測定重組假絲酵母尿酸氧化酶的生物活性。
本發明運用重組DNA技術，采用PCR擴增的方法克隆了尿酸氧化酶基因，運用合理的表達元件組合提高了產物的表達，且產物主要以可溶性形式存在于大腸桿菌胞漿內，產物活性高。下游純化方式簡便，收率高，達到臨床用藥的質量要求。本產品用于人類痛風及血液系統腫瘤化療所引起的高尿酸血癥的治療，能得到顯著的療效。
本發明用下述實施例進行說明實施例1、特異性引物序列設計根據引物設計原則，預定退火溫度為72攝氏度，并在上、下游引物5′端分別加入優選后的EcoRI酶切位點和BamHI酶切位點，序列如下上游引物5′CggAATTCATg TCA ACA ACg CTC TCA TCA TCC ACCTAC ggC AA3′下游引物5′CgggATCCTTA CAA CTT ggT CTT CTC C3′實施例2、全長片段的克隆、測序鑒定1)PCR擴增以假絲酵母基因組DNA為模板，加入上述引物、Taq酶等組分建立反應體系，94℃預變性3min后，按照94℃30s-72℃60s的順序進行38個循環，最后在72℃下反應7min，4℃保存。
2)回收PCR產物，雙酶切(EcoRI、BamHI)后與同樣酶切的質粒pUC19連接，轉化到JM109或DH5α受體菌，藍白斑篩選獲得陽性轉化子，挑選20個轉化子測序。
3)測序結果表明，上述20個轉化子克隆只有一個序列與預期結果完全一致(測得的核苷酸序列見表1)。
實施例3、表達載體的構建從pUC19/UOX酶切獲得目的基因片段，回收后連接已雙酶切的pBV220表達載體成為原核表達質粒pUOX，轉化優選的DH5α大腸桿菌后用PCR方法篩選陽性克隆，且酶切正確。含有以上表達質粒的DH5α工程菌經擴增培養、42℃誘導，在34kd左右多出一條蛋白條帶。
實施例4、重組假絲酵母尿酸氧化酶的發酵生產工程菌30℃過夜培養后，按5％比例接種于2YT培養基中，30℃培養到OD600為4.0時，升高溫度至42℃，4h后收集菌體。在表達的不同時機加氮源、碳源等營養素。最終發酵產物密度可達OD600為25，生物量為每升培養物30-35g。電泳鑒定尿酸氧化酶表達水平，薄層掃描顯示尿酸氧化酶占菌體總蛋白的50-60％之間。
實施例5、工程菌的保存及穩定性工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌種可用瓊脂LB平板。為檢查工程菌的穩定性，將原始菌種、50代和100代菌分別抽提質粒進行酶切鑒定，結果三者相同。同時三個菌擴增培養物的產物表達水平相當，證明本發明中的工程菌是十分穩定的。
實施例6、重組尿酸氧化酶的分離純化重組尿酸氧化酶在菌體內主要以可溶性形式存在于菌體胞漿內，菌體破碎后離心回收上清，上清用稀鹽酸調pH2.0離心收集上清，產物得到初步純化。上清再經CM-Sepharose柱層析可以得到電泳純的重組尿酸氧化酶。最后用Sephacryl S-100精制得到34kd的重組尿酸氧化酶。
實施例7、重組尿酸氧化酶產物的鑒定SDS-PAGE和HPLC檢定重組假絲酵母尿酸氧化酶純度均在98％以上，體外尿酸氧化實驗表明其具有明顯的生物活性。N末瑞蛋白質序列分析表明，重組假絲酵母尿酸氧化酶與天然蛋白序列相同，順序是Met-Ser-Thr-Thr-Leu-Ser-Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Lys-Asp-Asn-Val--。
實施例8、無菌過濾、分裝、凍干根據蛋白含量和活性，按以下比例加輔料和穩定劑重組假絲酵母尿酸氧化酶每支含1.2mg，緩沖體系為10mMPB，pH6.8，5％甘露醇，以上輔料必須符合注射用藥的要求。
無菌過濾在環境潔凈度達到100級的條件下，用0.22μM微孔濾膜過濾，分裝、凍干、封口、貼簽、裝箱。保存于2～8℃的冷藏環境中。
實施例9、活性測定根據Legoux R.等提供的方法[文獻J.Biol.Chem.1992，267(12)8565-8570]，測定含有尿酸氧化酶的尿酸溶液在292nm紫外吸收值變化，可以觀察到重組尿酸氧化酶的活性。
附表1.假絲酵母尿酸氧化酶基因序列atgtcaacaacgctctcatcatccacctacggcaaggacaacgtcaagttcctcaaggtcaagaaggacccgcaaaacccaaagaagcaggaggttatggaggccaccgtcacgtgtctgcttgaaggtgggttcgacacctcgtacacggaggctgacaactcgtccatcgtgccaacagacaccgtgaagaacaccattctcgtgttggcaaagaccacggagatttggccaattgagagatttgcagccaagctggccacgcactttgttgagaagtactcgcacgtctctggcgtctccgtcaagattgtccaggacagatgggtcaagtacgccgttgatggcaagccacacgaccactcttttatccacgaaggtggtgagaagagaatcactgacctgtactacaagagatccggtgattacaagctgtcgtctgccatcaaggacttgacggtgctgaagtccaccggctcgatgttctacggctacaacaagtgtgacttcaccaccttgcaaccaacaactgacagaatcttgtccaccgacgtcgatgccacctgggtttgggataacaagaagattggctctgtctacgacatcgccaaggctgcagacaagggaatctttgacaacgtttacaaccaggctagagagatcaccttgaccacctttgctctcgagaactctccatctgtgcaggccacgatgttcaacatggctactcagatcttggaaaaggcatgctctgtctactcggtttcatacgccttgccaaacaagcactacttcctcattgacttgaaatggaaaggtttggagaacgacaacgagttgttctacccatctccacatccaaatgggttgatcaagtgtactgttgtccgtaaggagaagaccaagttgtaa
權利要求
1.一種制備假絲酵母尿酸氧化酶的方法。
2.權利要求1的方法需合成上游和下游兩條特異性引物。
3.權利要求2的上游引物是如下序列-5′YYXXXXXXATgTCA ACA ACg CTC TCA TCA TCC ACC TAC ggC AAg gA 3′-上從5′端開始的16-46個堿基，其中Y是A、T、C、g中的任意一種，XXXXXX是gAATTC、ggATCC、CATATg、ATgCAT中的任意一種；權力要求2的下游引物是如下序列-5′YYMMMMMMTTA CAA CTT ggT CTT CTC CCT TAC ggA CAACAg TAC A 3′-上從5′端開始的16-45個堿基，其中Y是A、T、C、g中的任意一種，MMMMMM是gAATTC、ggATCC、CATATg、ATgCAT、AAgCTT、gTCgAC中的任意一種。
4.權利要求3的引物用于擴增假絲酵母AS2.1495基因組DNA上的尿酸氧化酶基因。
5.權利要求4的擴增方法為兩步法。
6.權力要求5得到的產物用相應的核酸內切酶消化后插入到pBV220載體構建高效表達質粒pUθX，不僅限于pBV220載體。
7.權利要求6的原核表達質粒pUOX轉化DH5α大腸桿菌(不僅限于DH5α菌)，發酵后得到高水平表達的重組假絲酵母尿酸氧化酶。
8.權力要求7得到的尿酸氧化酶通過離子交換、凝膠過濾等純化過程得到純度98％以上的假絲酵母尿酸氧化酶。
9.權力要求8所得物質中加入保護劑等輔料后凍干成為凍干制劑。
10.權利要求9的假絲酵母尿酸氧化酶制劑應用于人類痛風及血液系統腫瘤化療所引起的高尿酸血癥的治療。
全文摘要
本發明涉及一種假絲酵母尿酸氧化酶(Urateoxidase，簡稱UOX)的制備方法。本發明利用原核表達原理與技術，優選了SD序列等相關表達元件，通過PCR方法克隆了假絲酵母(AS2.1495)UOX基因并選用pBV220載體構建了重組質粒，轉化大腸桿菌工程菌DH5α或者JM109并經42攝氏度誘導表達，表達量達到菌體總蛋白的50－60％。工程菌經過發酵、破菌后保留上清。上清經過酸沉淀、陽離子交換、陰離子交換方法純化產品。純品加入保護劑后制成藥用凍干制劑。該制劑用于高尿酸血癥的治療。
文檔編號C12N15/70GK1536078SQ03109150
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月7日 優先權日2003年4月7日
發明者吳彥卓, 徐明波, 陳遙, 王勇波, 盧安京, 王俊玲, 張蕊, 陳起迅, 李亞軍, 崔鐵民 申請人:北京雙鷺藥業股份有限公司