專利名稱：保持發酵培養基中低的氨和脲水平發酵制備氧氮雙環庚酮衍生物的方法
技術領域：
本發明涉及增加棒酸和其它氧氮雙環庚酮類化合物(clavam)的產量的方法，包括那些來自具有合適的生物合成路徑的生物體的有很強的β-內酰胺酶阻遏活性的氧氮雙環庚酮類化合物。
微生物，特別是鏈霉菌產生多種抗生素，包括棒酸和其它氧氮雙環庚酮類化合物，頭孢菌素和青霉素類化合物。
棒酸是一種重要的β-內酰胺酶阻遏劑，它是以沃格孟汀(AUGMENTIN)(Smithkline Beecham Plc的商標名)的名義出售的抗生素的一個關鍵成分。生產棒酸的商業方法是帶棒鏈霉菌發酵。在英國專利說明書1,508,977中描述了生產棒酸的合適的發酵培養基。
盡管可由已有的方法以可接受量產生棒酸和其它氧氮雙環庚酮類化合物，但仍需要提高發酵肉湯中棒酸的效價，從而可更經濟地生產產物。可提到的解決問題的一條途徑是篩選帶棒鏈霉菌ATCC 27064或其它的產棒酸的微生物的有更高效價的突變菌株。至今，有關通過改變發酵罐中的反應條件而得到更高效價的棒酸的方法改良相對少量地公開了。
通常在氮源中包含氨，因為發酵的氮輸入操作對棒酸產率是至關重要的。但是我們發現產生棒酸的發酵方法對系統中氨的濃度特別敏感。
根據本發明，提供了通過在合適的培養基中由產氧氮雙環庚酮生物體發酵制備氧氮雙環庚酮類化合物的方法，其特征在于在發酵中氨的水平保持較低，以便防止氨對一種或多種關鍵酶的阻遏。
低水平，指小于50μg/ml。氨的水平必須保持在低于50μg/ml足夠的時間，合適地為1到10小時；以便容許關鍵的氨可阻遏酶類的去阻遏和生物合成。已發現在常規的發酵條件下(氨水平大于100μg/ml)，氨阻遏多種氮代謝中的酶，包括催化脲向氨和二氧化碳轉化的脲酶(參見V.Bascaran等，普通微生物學雜志，1989，135卷2465-2467頁)。但是后者的研究與抗生素效價不相關并且任何具體的與氧氮雙環庚酮或棒酸生產的改進相關的提示。
工作中一個令人驚奇的發現導致了本發明，即脲在棒酸發酵肉湯中積聚。脲產自棒酸生物合成過程，但肯定還有其它的脲的來源。
根據本發明的另一方面已經發現，如果致使在棒酸生產期間積聚的脲與脲酶反應，則棒酸的效價可得到相當的提高，例如10％級別的。
因此，本發明的另一方面提供了在合適的培養基中通過產氧氮雙環庚酮的微生物的發酵制備氧氮雙環庚酮類化合物的方法，其特征在于致使在發酵過程中得到的脲與脲酶反應。
脲酶可以是內在的(內源性的)或者外在的(外源性的)，也就是說可由產棒酸微生物產生(內在脲酶)或加入到系統中(外在脲酶)。
如果需要外在脲酶，該酶可從任何合適的來源得到并被加入到發酵反應中。在本發明的一個方面中，如果脲酶是內在的，其可通過產棒酸生物體脲酶的去阻遏表達而被釋放。
此類去阻遏可由，如用氨之外的其它任何合適的堿調節pH值而實現。在該方法中，優選發酵時氨的濃度低至可發生去阻遏。此類去阻遏可通過研究反應培養基中pH曲線(profile)的變化而被很好的監測(參見下文實施例)。
在上面的方法中，pH控制劑可以是氨之外任何合適的堿，例如堿金屬氫氧化物，如氫氧化鈉。一旦發生了去阻遏并且尿酶被表達，最好是用常規的控制pH值的方式，以保證充足的氮供應。但是可任選地，氨之外的pH調節劑可在整個發酵中使用。
通常優選氨作為典型發酵中的添料(feed)，因為它有雙重作用，即調節pH值和向發酵中引入氮的作用。它也可以作為棒酸鹽(clavulanate)累積的離子抗衡而起作用。盡管由去阻遏氨可阻遏酶而獲得的益處亦可通過在發酵的部分階段使用替代的pH調節劑而達到，這樣的優點也可這樣達到使用替代的pH調節劑，然后分批加入(batch)向發酵中引入所需的氮或通過添加銨鹽。
在另外的脲酶去阻遏的方法中，可對分批加入或添加到發酵中的復合氮源的量進行調整。由復合氮源的脫氨反應釋放的氨將會阻遏脲酶。因此，發酵中其量的調整或其釋放特征將會影響脲酶去阻遏。
另外的提高棒酸效價的方法是向發酵反應中添加任何合適的化合物，該化合物可直接或間接影響發酵對氨或脲的濃度。
一種實施方式是加入一種，例如能夠吸附氨從而降低其濃度的沸石的化合物。合適的氨吸附劑包括那些可將氨作為復鹽沉淀的試劑，例如磷酸鎂氨。
另一種降低脲濃度的方法是向發酵培養基中加入一種化合物，其可直接或間接增加產棒酸生物體中脲酶的表達。
還可使用遺傳操作或菌株改良方法以增加產棒酸微生物所產生的內在脲酶的水平。例如可用菌株改良〔例如通過突變和隨后在含如甲銨的特異培養基上篩選而得到(微生物學綜述；1989；53，85-108)〕以制備可組成性表達脲酶的產棒酸微生物，即在存在氨時，脲酶不受到顯著阻遏。類似的結果可由定向基因操作技術獲得，包括對脲酶基因的操作以影響其調控，例如引起同一種棒酸生物合成路徑中的酶相一致的表達。
上述方法的優點是可達到棒酸效價的相當大的增加。可用常規技術分離和純化棒酸。
下面的實施例將說明本發明。在實施例中，除非特別指出，所用的方法和標準技術都如在Sambrook等(1989)分子克隆實驗指南，第2版中所給出的那樣。實施例1-pH調節劑對棒酸效價的調節作用在1000升規模的帶棒鏈霉菌發酵中(5％種子發酵接種，20至60g/l大豆粉蛋白，1至3％糊精，1％到5％植物油，加上微量元素混合物，pH維持在6-8)，通過pH調節劑的調節，棒酸的產量可增加8％。
如果用2.5N NaOH代替氨以維持在發酵開始時其pH為6-8，則可在pH值曲線上觀察到兩個峰。第一個峰對應于大豆蛋白(Soyprotein)的脫氨作用，其釋放氨從而使pH值增加。第二個峰是由于脲酶的去阻遏，它也釋放氨。在觀察到第二個峰之后(這可由比色法檢測不到脲的存在確證)，將pH調節劑再轉變為氨以保證反應培養基中充足的氮供應。實施例2-組成性脲酶生物體的制備可產生帶棒鏈霉菌的突變菌株，其組成性表達脲酶。將已用誘變劑(如紫外照射或亞硝基胍處理)處理的孢子接種到含甲銨和脲的瓊脂上。在瓊脂中，脲是唯一的碳源和氮源。甲銨不能被代謝，但可被生物體識別為銨從而對脲酶表達起阻遏作用。
選擇能在該培養基中生長的突變孢子，并且證明其在發酵時組成性表達脲酶并且棒酸產量豐富。
權利要求
1.一種由產氧氮雙環庚酮生物體在合適的培養基中發酵制備氧氮雙環庚酮類化合物(clavams)的方法，其特征在于，發酵罐中的條件是在發酵時保持低的氨水平以防止氨對一個或多個關鍵酶的阻遏。
2.根據權利要求1的方法，其中氨水平約低于50μg/ml。
3.根據權利要求1的方法，其中關鍵酶是脲酶。
4.一種由產氧氮雙環庚酮生物體在合適的培養基中發酵制備氧氮雙環庚酮類化合物的方法，其特征在于，致使發酵過程中產生的脲與脲酶反應。
5.根據權利要求3或4的方法，其中脲酶是外在的(加入到發酵中的)。
6.根據權利要求3或4的方法，其中脲酶是通過微生物脲酶的表達去阻遏而被釋放的。
7.根據權利要求6的方法，其中去阻遏是由通過氨之外的其它任何合適的堿對發酵pH的調整而引起的。
8.根據權利要求7的方法，其中堿是氫氧化鈉。
9.根據權利要求6、7或8的方法，其中在發生去阻遏并且脲酶已表達之后，接著用氨調節pH值以保證足夠的氮供應。
10.根據前述任一項權利要求的方法，其中分批加入或添加到發酵中的復合氮源的量被調整。
11.根據前述任一項權利要求的方法，其中在發酵時加入一種化合物，其可直接或間接影響發酵時氨或脲的濃度或增加脲酶的表達。
12.根據權利要求11的方法，其中該化合物是脲化合物或沉淀化合物。
13.根據前述任一項權利要求的方法，其中該微生物產生高水平的內在脲酶。
14.根據前述任一項權利要求的方法，其中的微生物脲酶表達是組成型的。
15.根據前述任一項權利要求的方法，其中氧氮雙環庚酮是棒酸。
16.根據前述任一項權利要求的方法，其中微生物是帶棒鏈霉菌。
全文摘要
改良的在合適的培養基中由可產生氧氮雙環庚酮的生物體通過發酵制備氧氮雙環庚酮類化合物的方法，其中氨的水平保持較低以避免對酶如脲酶的阻遏。
文檔編號C12P17/18GK1169162SQ95196726
公開日1997年12月31日 申請日期1995年12月7日 優先權日1994年12月10日
發明者B·P·瓦倫丁, P·A·謝夫金斯, W·H·霍姆斯, D·M·穆斯德爾 申請人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司