專利名稱：能夠產生蛋白質及能夠在無谷氨酰胺的培養基上生長的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞的制作方法
本申請是2003.01.17提交的申請號為03802413.6(PCT/EP03/00454)，名為能夠“產生蛋白質及能夠在無谷氨酰胺的培養基上生長的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞”的發明專利申請的分案申請。
本發明是關于新穎的能夠產生蛋白質和能夠生長在無谷氨酰胺的培養基中的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞。此外，其是關于新穎的產生蛋白質的方法和關于在谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞中把谷氨酰胺合成酶(GS)當作可選擇標記的用途。
由哺乳動物細胞培養所產生的蛋白質是用來提供治療和診斷應用的蛋白質。現今，哺乳動物細胞培養是用于人類和動物醫藥之許多重要蛋白質的較佳來源，尤其那些相當大的、復雜的和糖基化的(N.B.Finter等，在大規模哺乳動物細胞培養技術，1990，A.S.Lubiniecki編，Marcel Dekker，Inc.，紐約)。
例如，藉細胞培養產生人類蛋白質紅血球生成素(EPO)已在WO 93/09222中描述。使用以可編碼人類EPO外源基因轉染的人類纖維組織母細胞，人類EPO已獲得可觀的比生成速率。在進一步產生人類EPO的方法(WO 94/12650)，是使用以能夠活化內生編碼的EPO之DNA序列轉染的人類纖維肉瘤細胞系HT1080。類似的方法已于WO99/09268中描述。永生的(Immortalised)人類細胞如Namalwa、Hela S3及HT 1080細胞用能夠活化內生編碼的EPO之DNA序列轉染。
描述于WO 93/09222、WO 94/12650及WO 99/09268用來產生人類EPO的細胞系都在含有谷氨酰胺的培養基中培養。這是不利的，因為當谷氨酰胺被培養的細胞當作能量基質時，會產生氨這種代謝產物，其具有細胞毒性及會抑制細胞生長。再者，由于它在細胞高爾基體內對pH的影響，而會抑制蛋白質糖基化。
產生大量組織血漿素原活化劑(一種糖基化蛋白質)已在WO 87/04462中描述。GS在其中已被用來作為放大是統，在谷氨酰胺原養型中國倉鼠卵巢(CHO)細胞用于共放大可編碼組織血漿素原活化劑(tPA)的基因，其通過以可編碼GS的基因轉染細胞。然而，如同在EP-A 148 605發現的，用CHO細胞來產生糖基化的人類蛋白質是不利的。由CHO細胞合成的蛋白質其平均碳水化合物成分會與自然生成的糖基化人類蛋白質有所不同，這是因為人類細胞含有α2.3唾液酸轉移酶及α2.6唾液酸轉移酶。CHO細胞只具有α2.3唾液酸轉移酶，所以不能產生α2.6端唾液酸與寡糖部分的鍵結，CHO細胞缺乏硫化碳水化合物結構的酵素，CHO細胞雖然有α1-6巖藻糖基轉移酶(附著中心的巖藻糖殘基)，亦缺乏α1-3巖藻糖基轉移酶(附著末端的巖藻糖殘基)。人類細胞則具有兩者巖藻糖基轉移酶(Cumming D.A.，1991，Glycobiology卷1，No.2，115-130，Jenkins N.及Curling E.M.A.，1994，enzyme and Micorbial Technology，卷16，354-364；Lee等，1989，Journal of Biological Chemistry，卷264，13848-13855)。所以，由CHO細胞合成之糖基化的蛋白質不會有希望得到的特征，例如如于人類細胞產生的活體內生物活性。
在WO 89/10404中，報告了制造骨髓瘤細胞例如鼠融合瘤、鼠漿細胞瘤細胞及大鼠融合瘤細胞谷氨酰胺獨立的方法，其藉由以GS轉化他們。其進一步證明GS可以用來共放大可編碼免疫球蛋白分子輕及重鏈的基因及用來共放大在骨髓瘤細胞系中可編碼纖維蛋白分解酵素的基因。然而，嚙齒類細胞系具有缺點，即以N-乙醇酰基神經氨酸殘基的附著代替N-乙酰神經氨酸、無法進行硫化及α1.3半乳糖轉移酶的存在。在嚙齒類細胞中合成之糖蛋白的寡糖結構因此可以在人類產生免疫性。
本發明之目的是提供一種改進的方法，其不具有用于產生蛋白質時的上述缺點(尤其當產生糖蛋白時)，及可獲得高蛋白質效價。
利用權利要求1所述的新穎的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞和權利要求7所述的新穎的方法，可以達成此目的。
根據本發明，可得到谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞，所述細胞用(第一)可編碼蛋白質之外源DNA序列或能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列轉染，及進一步以(第二)可編碼谷氨酰胺合成酶(GS)(較佳的為哺乳動物GS)之外源DNA序列轉染，其中這些外源DNA序列位于一或一個以上DNA構建物，該轉染的細胞能夠產生該蛋白質及能夠生長在無谷氨酰胺的培養基中。


圖1顯示細胞系R223懸浮培養于無血清培養基之適應作用的細胞濃度圖，經由重復連續的次培養。
圖2顯示HT1080細胞懸浮培養于無血清培養基之適應作用概要。
圖3顯示細胞系HT1080懸浮培養于無血清培養基之適應作用的細胞濃度圖，經由重復連續的次培養。
圖4顯示從GS轉染子3E10及從無轉染的R223細胞系中免疫純化的EPO之IEF分析，其是生長在產業高密度生長培養基。泳道2收集的(收集)3E10；泳道33E10峰；泳道4無轉染的R223細胞系峰；泳道5收集的無轉染的R223細胞系。
圖5顯示R223細胞系之GS-R223轉染子3E10及從無轉染的R223細胞系免疫純化的EPO之IEF分析，生長在傳統的Iscove培養基。泳道4自添加谷氨酰胺的Iscove培養基收集的無轉染的R223細胞系；泳道5自無谷氨酰胺的Iscove培養基收集的GS-223細胞系3E10。
圖6顯示了圖5所示凝膠泳道4從頂部到底部光密度掃描的色譜圖。
圖7顯示了圖5所示凝膠泳道5從頂部到底部光密度掃描的色譜圖。
″可編碼蛋白質的外源DNA序列″或″能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列″及″可編碼GS的外源DNA序列″通常位于DNA構建物上，例如表達載體或感染性載體。質體可以用來作為表達載體。作為感染性載體則可以使用如反轉錄病毒、泡疹病毒、腺病毒、腺病毒伴隨病毒、流行性腮腺炎病毒及脊髓灰質炎病毒載體。較佳的為表達載體，尤其使用質體。
″可編碼蛋白質的外源DNA序列″可以包括額外序列，例如調控序列如啟動子及/或增強子、多聚腺苷酸化位點及剪接接頭，通常用于表達外源基因或可以包括額外一或多個分開的靶向性序列及視需要的可編碼可選擇標記之DNA(如WO 93/09222中所描述)。
″能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列″可以包括外源DNA序列，其不編碼蛋白質的基因產物，但可編碼部分該基因產物(如外顯子)，及可以包括額外序列，例如調控序列及剪接接頭，通常用于表達外源DNA序列。他們可以進一步包括靶向性序列及視需要的可編碼可選擇標記之DNA(如WO 93/09222中所描述)。
通常，″能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列″是在轉染進細胞后插入細胞的染色體DNA。同源重組或靶向性是在此用來取代或使與含有調控序列之內生基因相關的調控區域失去作用。作為調控序列可以使用如啟動子及/或增強子，其造成基因表達量高于相對應之無轉染的細胞(如WO 93/09222所描述)，合適的啟動子可以是可調控的或持續表達的啟動子。合適的啟動子可以是強啟動子，其是取決于所使用的細胞系，如人類巨細胞病毒主要立即早期啟動子(hCMV-MIE)、SV 40早期及晚期啟動子、其他腺病毒啟動子、任何多瘤病毒或乳多泡病毒早期及晚期啟動子、干擾素α1啟動子、鼠金屬硫蛋白啟動子、Rous肉瘤病毒長端重復啟動子、β-珠蛋白啟動子、伴白蛋白啟動子、卵白蛋白啟動子、鼠β-珠蛋白啟動子及人類β-珠蛋白啟動子。
根據本發明的″可編碼GS之外源DNA序列″可以受強啟動子及弱啟動子的控制，如果外源DNA序列是單單需要表達可編碼GS的基因，則使用強啟動子，當外源DNA序列是作為可選擇標記，以及若GS是用于放大作用時，則使用弱啟動子。合適的啟動子可以是可調控的或持續表達的啟動子。啟動子可以選擇，例如，GS是在足夠使轉染的細胞生長的濃度中表達，但細胞培養時并不產生高量谷氨酰胺代謝產物氨，通常不大于4mM，較佳的不大于2mM，更佳的少于2mM氨。
″可選擇標記″提供了可選擇的表現型，使鑒別及分離受體細胞成為可能。GS可以在本發明用來當作可選擇標記，以篩選出成功轉染的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞，其并入和表達可編碼GS的外源DNA序列。
根據所用的細胞系，強啟動子可以是如hCMV-MIE、SV 40早期及晚期啟動子、其他腺病毒啟動子、任何多瘤病毒或乳多泡病毒早期及晚期啟動子、干擾素α1啟動子、鼠金屬硫蛋白啟動子、Rous肉瘤病毒長端重復啟動子、β-珠蛋白啟動子、伴白蛋白啟動子、卵白蛋白啟動子、鼠β-珠蛋白啟動子及人類β-珠蛋白啟動子。
根據所用的細胞系，弱啟動子可以是如鼠白血病病毒長端重復、單純疹病毒胸苷激酶及鼠乳房腫瘤病毒長端重復，較佳的，可編碼GS的基因是在強啟動子控制下，更佳的是在hCMV-MIE啟動子控制下。一項可能的具體實例，一種來自倉鼠之可放大的哺乳動物GS序列及其在哺乳動物細胞中作為可選擇標記的用途已為該項技術所熟知，且如WO 87/04462、WO 91/06657及WO 89/01036所描述；本發明實施例使用此倉鼠GS表達單元及個別的篩選方法如參考文獻所提及。
″可編碼蛋白質之外源DNA序列″或″能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列″及″可編碼GS之外源DNA序列″位于一個或多個DNA構建物上，較佳的，這些外源DNA序列位于多于一個，更佳的位于兩個DNA構建物上。若這些外源DNA序列位于一個DNA構建物上，他們可能功能上相組合，例如他們的表達會受同一個調控序列，如啟動子及/或增強子(如WO 89/10404所描述)驅策。
谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞系指所有不表達GS或表達GS很差的人類細胞，所以能夠生長在含有谷氨酰胺的培養基，但在無谷氨酰胺的培養基不能生長或生長很差。用于本發明之谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞系必死的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞或永生的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞。必死的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞系在培養基中具有有限壽命的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞，永生的(又稱永久的或建立的)谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞系在培養基中如習于該項技術者所熟知以適當地繼代培養和次培養，具有明顯無限壽命之谷氨酰胺營養缺陷細胞。
必死的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞的例子可以是人類纖維組織母細胞及人類胎肺組織細胞，永生的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞的例子可以是人類纖維肉瘤細胞，如HT1080細胞系(如DSMZ No.ACC-315或ATCC No.CCL 121)及B-淋巴母細胞人類細胞如HL60(DSMZ No.Acc-3)或Namalwa(DSMZ Acc-24)細胞系。用于本發明較佳的是永生的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞，更佳的，此永生的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞系用B-淋巴母細胞或纖維肉瘤細胞，更佳的是用人類纖維肉瘤細胞，最佳的是用HT1080細胞系(如ATCC No.CCL 121)。
谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞可藉由已知的基因工程技術以外源DNA序列轉染。
以外源DNA序列轉染取決于序列是否位于一個或多個DNA構建物上，若序列位于多于一個DNA構建物上，轉染可隨各序列分別發生或共轉染。當轉染隨各序列分別發生時，序列轉染順序通常是隨意的，隨各序列分別發生的轉染較佳先以″可編碼該蛋白質的外源DNA序列″或″能夠改變可編碼該蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列″轉染，然后再以″可編碼GS的外源DNA序列″轉染，轉染的谷氨酰胺營養缺陷細胞可以在各別轉染之后培養并評估蛋白質生成。
為了成功篩選轉染的細胞，所述細胞嫩生長在無谷氨酰胺的培養基中。細胞可以直接生長在無谷氨酰胺的培養基或先在含有谷氨酰胺的培養基，然后逐步稀釋成無谷氨酰胺的培養基，如先以谷氨酰胺濃度10mM，然后以2mM至0mM逐步稀釋。合適的篩選方法可以根據所用的細胞系來選擇。如前述顯知，本發明能夠產生蛋白質及能夠生長在無谷氨酰胺的培養基中的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞系得自以可編碼該蛋白質的外源DNA序列或能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列及可編碼谷氨酰胺合成酶之外源DNA序列轉染該細胞，其中這些外源DNA序列位于一個或多個DNA構建物上。
可編碼蛋白質的外源DNA序列或能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列可以在轉染后根據如WO 94/12650所描述之基因放大已知方法來放大。可放大的基因可編碼酵素，如DHFR(二氫葉酸還原酶)、GS、腺苷脫氨酶、天冬酰胺合成酶、天冬氨酸氨甲酰基轉移酶、金屬硫蛋白-1、鳥氨酸脫羧酶、P-糖蛋白質、核苷酸還原酶、胸苷激酶或黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶可以用于此目的。含有這些基因的放大復制的細胞系例如能夠在沒有酵素代謝產物的培養基或在含有相關的選擇劑之培養基中存活，相關的選擇劑是例如在DHFR情況下為甲氨喋呤(MTX)及在GS情況下為甲硫氨酸磺酰胺(methionine sulphoximine)(MSX)。
由本發明轉染的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞所產生之蛋白質是無糖基化和糖基化蛋白質，糖基化蛋白質是指具有至少一個寡糖鏈的蛋白質。
無糖基化蛋白質的例子如無糖基化荷爾蒙，像黃體生成素釋放激素、甲狀腺素釋放激素、胰島素、生長抑素、催乳素、促腎上腺皮質激素、黑素細胞促黑激素、升壓素、以及其衍生物如去氨加壓素、催產素、降鈣素、副甲狀腺素(PTH)或其片段(如PTH(I-43))、促胃液素、胰泌素、腸促胰酶素、激膽囊素、血管緊張素、人類胎盤促黃體激素、人類纖毛膜促性腺激素(HCG)、雨蛙肽及胃動素；無糖基化的止痛劑物質如腦啡肽及其衍生物(參見US-A 4 277 394及EP-A 031567)、內啡肽、daynorphin及kyotorphin；無糖基化酵素如無糖基化神經傳導物質例如蛙皮素、神經緊張素、緩激肽和物質P；神經生長因子(NGF)家族、上皮生長因子(EGF)及纖維組織母細胞生長因子(FGF)家族之無糖基化生長因子及無糖基化荷爾蒙及生長因子受體。
糖基化蛋白質的例子是荷爾蒙及荷爾蒙釋放因子，如生長荷爾蒙，包括人類生長荷爾蒙、牛生長荷爾蒙、生長荷爾蒙釋放因子、副甲狀腺素、甲狀腺刺激素、EPO、脂蛋白質、α-1-抗胰蛋白酶、卵泡刺激素、降鈣素、黃體生成素、胰增血糖素、凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子及von Willebrand因子、抗凝血因子例如蛋白質C、心房利鈉因子、肺表面活性物質、血漿素原活化劑例如尿激酶或人類尿或組織型血漿素原活化劑(t-PA)、凝血酶、造血生長因子、腦啡肽、RANTES(調控活化自然的T-細胞表達及分泌)、人類巨噬細胞發炎蛋白質(MIP-1-α)、血清蛋白素例如人類血清蛋白素、米勒抑制物、松弛素A鏈、松弛素B鏈、前松弛素、鼠促性腺激素相關肽、微生物蛋白質例如β-lactanase、DNase、抑制素、激活素、腎素、血管內皮生長因子(VEGF)、荷爾蒙或生長因子受體、整合素、蛋白質A或D、類風濕性因子、神經營養因子例如源自骨神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神經生長因子例如NGF-β、源自血小板生長因子(PDGF)、纖維組織母細胞生長因子例如FGF及bFGF、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)例如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5、類胰島素生長因子-I及-II(IGF-I及IGF-II)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)、類胰島素生長因子結合蛋白、CD蛋白(一群分化蛋白質)例如CD-3、CD-4、CD-8及CD-19、骨誘導因子、免疫毒素、骨形態發生蛋白質(BMP)、細胞活素及其受體，還有嵌合蛋白，包含其受體的細胞活素，包括例如腫瘤壞死因子α及β、他們的受體(TNFR-1，EP 417 563及TNFR-2，EP 417 014)及其衍生物，一種干擾素例如干擾素-α、-β、及-γ，細胞族群刺激因子(CSFs)，如M-CSF、GM-CSF及G-CSF，白介素(ILs)如IL-1到IL-10，超氧化物歧化酶，T-細胞受體、表面膜蛋白、降解加速因子、病毒抗原例如AIDS夾膜的一部份、運輸蛋白、歸巢受體、地址素、調控蛋白、抗體、嵌合蛋白如免疫粘附素，及任何上述所列片段之糖基化蛋白質。較佳的，本發明產生糖基化蛋白質，更佳的本發明產生N-糖基化蛋白質，最佳的糖基化荷爾蒙像EPO為N-糖基化及其生物活性是依賴其上，或尤其產生EPO。
任何于該項技術已知之合適的培養程序及培養設備均可用來生長本發明轉染的人類細胞。添加約0.1至20％(較佳0.5至15％)血清之常見無谷氨酰胺的基礎培養基以及無血清無谷氨酰胺的常見基礎培養基都可作為培養基用，此外，也可用不含動物來源蛋白質的常見無谷氨酰胺的基礎培養基，較佳的使用無血清無谷氨酰胺的常見基礎培養基。
可以用的血清如胎牛血清或成牛血清，較佳是使用胎牛血清。常見之可用的無谷氨酰胺的基礎培養基為，例如無谷氨酰胺的Eagle極限基礎培養基(MEM)、無谷氨酰胺的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)、無谷氨酰胺的Iscove氏DMEM培養基(N.Iscove及F.Melchers，Journal of Experimental Methods，1978，147，923)、無谷氨酰胺的Ham氏F12培養基(R.G.Ham，Proceedings of National Academy ofScience，1965，53，288)、無谷氨酰胺的L-15培養基(A.Leibovitz，American Journalof Hygiene，1963，78，173)、無谷氨酰胺的RPMI 1640培養基(G.E.Morre等，TheJournal of the American Medical Association，1967，199，519)、無谷氨酰胺的專用培養基和其合適比例之混合物。用于高密度細胞培養的強化常見細胞培養生長培養基已在該項技術所熟知，且已描述于如GB 2251249，其也非常適合作為本發明之無谷氨酰胺的培養基。
常見的添加物可以加到常見的無谷氨酰胺的基礎培養基。常加入的添加物包括血清中的蛋白質以及視需要可以對細胞生長及/或細胞生存有正面影響之進一步成分。血清中的蛋白質如牛血清白蛋白(BSA)、運鐵蛋白及/或胰島素；可以對細胞生長及/或細胞生存有正面影響之進一步成分如大豆脂、硒及乙醇胺。取代谷氨酰胺及/或核苷的胺基酸可以依所用的細胞系加到培養基中，胺基酸的例子如異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、丙氨酸。視需要，谷氨酰胺可以低濃度加到常見的無谷氨酰胺的基礎培養基中，通常少于1mg/l，較佳的少于0.5mg/l，以支持其生物合成作用(如轉胺反應)。
若可編碼蛋白質的外源DNA序列或能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列在轉染后以可放大的(amplifiable)基因放大，相關的選擇劑可以加到常見的無谷氨酰胺的基礎培養基中，選擇劑施用的濃度范圍依所用的細胞系而定，通常用10μM及更高的濃度。
谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞可以是固著依賴或固著獨立，其可以作為起始材料來獲得根據本發明的轉染的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞，根據本發明，該轉染的細胞能夠產生蛋白質及能夠生長在無谷氨酰胺的培養基中。若使用固著依賴人類細胞，如HT1080細胞系(ATCC No.CCL 121)，其可以適應成為固著獨立HT1080細胞系，能夠懸浮生長于無血清培養基，尚未于文獻中描述。
適應作用可以發生在以可編碼蛋白質的外源DNA序列或能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列及可編碼GS的外源DNA序列轉染之前或之后。較佳的，細胞先以可編碼蛋白質的外源DNA序列或能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列轉染，再使其適應懸浮生長于無血清培養基，然后進一步以可編碼GS之外源DNA序列轉染。若需要，轉染的細胞可以再使其適應懸浮生長于無血清無谷氨酰胺的培養基。
本發明之轉染的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞可以是固著依賴或固著獨立，并能夠懸浮生長于無血清無谷氨酰胺的培養基。較佳的轉染的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞系固著獨立，且能夠懸浮生長在無血清無谷氨酰胺的培養基。
適應作用使其成為能夠懸浮生長于無血清培養基之固著獨立細胞，可以藉由在第一步用含有血清的培養基適應細胞而達成。這可以經由如胰蛋白酶處理細胞，然后接著搖動或藉搖動釋放細胞來達成。細胞然后在第二步藉接著減少血清含量來適應無血清培養基，在適應時，若使用選擇劑，可以減少其用量，以避免抑制細胞生長。然而，細胞也可以在第一步藉由接著減少血清含量適應生長于無血清培養基，第二步適應成為能夠懸浮生長的固著獨立細胞，藉由如胰蛋白酶處理細胞然后接著搖動或藉搖動釋放細胞來達成，兩個步驟也可以同時施行。
較佳的，細胞系在第一步含血清培養基適應成為固著獨立細胞用，藉由搖動釋放細胞然后第二步經由接著減少血清含量來適應于無血清培養基。
如上所描述的培養基可以做為含血清培養基的基本。在此所定義之選擇劑可以加到培養基中，選擇劑施用的濃度范圍取決于所用的細胞系，通常使用10μM及更高濃度。含有血清的培養基通常添加約0.1到20％，較佳的0.2到10％，最佳的0.5到5％血清，可以使用的血清如上所提及。接著減少血清含量可以藉由逐步減少血清含量，例如從10％到1％到0％來達成。
本發明轉染的谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞系用在產生蛋白質的方法中，藉由在適合用來表達該蛋白質及回收此蛋白質的條件下之培養基培養該細胞，產生的蛋白質是描述如上。如上所描述之常見的無谷氨酰胺基礎培養基及常見的添加物可以作為培養基，合適的培養條件是如WO 96/39488所描述之習知的用于哺乳動物細胞體外培養者。
蛋白質可以從細胞培養物中以習知的分離技術分離，例如免疫親和或離子交換管柱分劃、沉淀、逆相HPLC、色層分析、色層焦集法、SDS-PAGE、膠體過濾。習于該項技術者應了解，適合用于有興趣的多肽之純化方法，可能需要根據多肽在重組細胞培養中表達的特性來做修飾。
實施例實施例1.準備人類纖維肉瘤細胞系HT1080-R223含有多人類EPO基因拷貝的固著依賴人類HT1080-R223細胞系是產業上用來生產EPO的細胞，一開始是由Transkaryotic Therapies公司所創造(劍橋，MA 02139(US))，其是源自固著依賴人類纖維肉瘤HT 1080細胞系。親本HT1080細胞系(ATTC No.CCL121)具有產生EPO的能力，其通過類似于DNA構建物pREPO18(描述于WO 95/31 560)的DNA構建物pREPO22轉染，除了DHFR基因是在相反方向以及pREPO22含有比pREPO18少約600堿基對同源序列。以后將此細胞系稱為R223細胞系。
實施例2.R223細胞系的適應作用以能夠懸浮生長于無血清培養基中藉由胰蛋白酶處理釋放在靜置瓶中以附著培養生長的細胞，懸浮于專用的含有谷氨酰胺之無血清培養基(進一步以“HM9”提及)，添加10％透析的胎牛血清(dFBS)及500nM MTX，然后以和震蕩瓶培養。生長在六天后開始，細胞次培養到同樣的培養基中(圖1)。一旦可信的生長模式建立了，就減少培養基的血清含量至1％，再一次，可信的生長可在添加的血清完全用盡之前被再建立。
使添加血清和無血清的培養物過度生長以評估產量，結果顯示于表1，并附有附著培養的數據。足夠的適應作用之后，懸浮培養的比生長速率(即使沒有血清)與添加血清之附著培養一樣。
在添加血清的培養基中從附著培養到懸浮培養時的適應作用，EPO合成比速率下降50％，從24到12EU/106細胞/小時，然而，此速率在適應無血清生長之后，大體上會恢復至18EU/106細胞/小時。
表1在適應無血清培養基之前或之后，R223細胞在附著培養及懸浮培養的生長及產量。
實施例3.HT1080(ATCC CCL121)的適應作用以能夠懸浮生長在無血清培養基中HT1080細胞系ATCC CCL121是從美國典型培養物保藏中心(Rockville，Maryland，USA)取得，一開始細胞附著培養生長于含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中。
懸浮和無血清的適應作用可以根據圖2的程序進行。為了開始懸浮培養，細胞通過胰蛋白酶處理從附著培養中釋放，而釋放的細胞再懸浮于加了2％FBS的HM9，這些接著以震蕩培養，一旦細胞在加了2％FBS的HM9的懸浮生長建立了，以相同的培養基稀釋培養物作子代培養，可信的HT1080細胞系懸浮生長在30天后建立(圖3)。在那之后培養基血清含量減少，最后完全不見。細胞持續在無血清中繼續次培養生長。
實施例4.氨對R223細胞系生長及產量的影響當以谷氨酰胺作為能量基質時，氨是培養的細胞產生的代謝產物，具有細胞毒性并會抑制細胞生長，除此之外，它會藉由對細胞高基氏體pH的影響，抑制蛋白質糖基化。在瓶中無供應之培養的R223細胞通常產生5mM氨，在有養分供應之發酵槽培養則產生10mM。
在一開始評估氨的影響時，R223細胞系生長在震蕩瓶中，沒有加氨或加氨(2、5或10mM)，重復培養之各氨濃度是在不同的pH值下得到，藉改變施加氣體之CO2含量。此處之主要目標是決定氨對生長抑制的程度，及測試減低的pH能不能克服此生長抑制。
氨被發現會抑制細胞生長(表2)，而減低的pH并不能緩和氨所造成的抑制作用，雖然用來減少pH的升高之pCO2本身可能造成一些生長抑制。
培養在僅3天后結束，加長培養是無效的，因為不揮發性的酸代謝產物累積會造成所有培養物pH下降數個pH單位。
表2在不同的培養pH值中，氨對R223細胞生長及產量的影響。pH用施加氣體的CO2含量調整。
在接下來的實驗(表3)pH通過調整培養基NaHCO3的含量來調整，并維持施加氣體的CO2含量在無抑制作用的濃度。測試的pH范圍從pH 7.0到7.5(要強調的是，在瓶中培養的培養基pH不能被控制，而且會大大的下降，即使最先兩天的培養，所指的pH值是各培養之起始pH)。比生長速率在pH 7.5(NaHCO3于3g/l)時最大，但在這個pH下，因為10mM氨的存在使生長速率及最大細胞濃度減半，EPO合成比速率減少四倍(表3)。
當pH 7.25(NaHCO3于1.5g/l)時，相較于pH 7.5的培養，比生長速率減少，EPO合成比速率增加，然而因為有10mM氨存在，生長速率較不受影響，EPO合成比速率不受影響。
在最低的研究pH，pH 7.0(NaHCO3于0.75g/l)，比生長速率進一步減少但仍比pH 7.5時較不受氨影響。EPO合成比速率因為加入的氨之存在而增加(這可能是因為生長速率降低)。
表3在不同的培養pH值下，氨對R223細胞生長及產量的影響。pH通過改變培養基中NaHCO3含量來調整。
實施例5R223細胞系在5公升規模發酵槽培養的產量對于R223細胞系，實施了三個5公升的發酵，控制在介于6.95和7.15的不同pH值(參見表4)，每一個培養得到濃縮的營養供應，其含有胺基酸和葡萄糖，設計來維持主要的消耗養分在足夠濃度。培養物在pH 7.15及pH 7.05生長的很好，但在pH 6.95則無法生長，可能是因為用來控制該pH之高濃度CO2。
表4發酵槽培養之R223細胞系的產量及代謝.
實施例6.以GS轉染的R223及GS轉染子在附著培養的產量。
用來轉染的細胞系來自實施例2之R223細胞系懸浮適應的無血清儲備溶液，當這些細胞長到像大的多細胞聚集時，再將他們以胰蛋白酶處理使其成為實質上的單細胞懸浮。
轉染從實施例2獲得的約107單懸浮適應R223細胞系分液(在不含鈣或鎂的磷酸緩沖鹽)是混合以20μg含有GS基因之線狀DNA(DNA序列pCMGS Bam H1描述于Bebbington等，1992，Biotechnology 10，169-175)及使用Biorad Gene Pulser(450伏特，250μF)施以電穿孔。作為控制組者，等量分液之細胞在不加DNA下作電穿孔。
細胞以HM9培養基稀釋，不加MTX，含有0或10％dFBS，及分布在96孔培養盤或25cm2瓶，35.5至37℃培養。
HM9培養基一開始含有2mM谷氨酰胺，但1天后稀釋成0.5mM，然后十天后換成無谷氨酰胺的HM9培養基，并且在第1天或第10天要再加入MTX(500nM)于培養物中。
至于在不加DNA下作電穿孔的控制組細胞培養，沒有生長。
以DNA電穿孔的細胞，有15個GS轉染子可以在96孔盤鑒別出來，不管起始培養基有沒有MTX，都可獲得GS轉染子。15個GS轉染子中，有7個成功的進展到瓶培養(表5)，剩下的8個GS轉染子呈現異常的細胞型態，或生長的不好，遺棄之。
分離出的每一個起始的七個GS轉染子，設置一組復制靜置瓶培養，使用10％添加血清之無谷氨酰胺的HM9培養基，每隔1到4天，犧牲培養物以計數細胞數，并以EPO ELISA測量EPO濃度。從這些數據集成可以估計每一個GS轉染子的EPO合成比速率，數據整理于表5及(作為比較)數據也包括無轉染的R223細胞系，所有GS轉染子相較于無轉染的R223細胞系呈現提高的EPO合成比速率，最佳的GS轉染子，3E10，具有高于無轉染R223細胞系五到六倍之合成速率。
表5R223細胞系GS轉染子及無轉染的R223細胞系之EPO合成比速率。
數據來自生長在含有10％dFBS之附著培養，在制造轉染子的培養基中不加甲氨喋呤，但在轉染后第一天或第十天再加到培養物中。
實施例7.適應GS轉染子于懸浮培養及無血清培養基。
由實施例6所得到的七個GS轉染子，GS轉染子#3E10及GS轉染子#8G3進行懸浮培養。
細胞附著培養生長于靜置瓶，內含無谷氨酰胺的HM9培養基，添加10％dFBS及500nM MTX，于35.5至37℃。細胞在五或六天后藉搖動釋放，再懸浮于同樣的培養基中，于相同溫度以震蕩瓶培養，生長在二或三天后開始，細胞于相同培養基次培養一次，然后過度生長以評估產量。效價及產物合成速率至少高于生長在10％dFBS及500nM MTX的無轉染R223細胞系兩倍(表6)。
表6GS轉染子3E10及8G3在震蕩瓶懸浮培養的生長及產量。無谷氨酰胺的HM9培養基含有10％dFBS及500nM MTX。
GS轉染子3E10及8G3的懸浮培養，無谷氨酰胺的HM9培養基中dFBS含量是逐步減少，3E10從10％至2％至1％至0.2％至0.1％至0％，8G3從10％至2％至1％，并在各dFBS濃度進一步減少前，建立可信的細胞生長，8G3沒有進一步適應于1％dFBS。
實施例8.GS轉染子3E10在無血清懸浮培養的產量及代謝。
實施例7中適應于無血清生長的GS轉染子3E10懸浮培養培養于無血清無谷氨酰胺的HM9培養基中，35.5到37℃。對于GS轉染子3E10細胞系，培養在相同條件于含有谷氨酰胺的HM9培養基，其具有比無轉染的R223細胞系快2到3倍的EPO合成比速率(表7)。
表7GS轉染子3E10細胞在無血清懸浮培養的生長及產量。
GS轉染的細胞的高EPO產量伴隨代謝氨釋放的減少，不同于在含有6mM谷氨酰胺HM9培養基中瓶培養典型會產生5mM氨的無轉染之R223細胞系，GS轉染子3E10于無谷氨酰胺的HM9培養基只產生1.8mM氨(表8)。
表8GS轉染子3E10之氨合成減少。
實施例9分析產物品質。
由GS轉染子3E10在瓶培養產生的EPO被免疫純化并分析其糖型分布，圖4顯示EPO之等電點聚焦法(IEF)膠體分析，其是得自最高細胞濃度時及收集生長于無谷氨酰胺的HM9培養基之3E10細胞培養物，如實施例8所描述，包括從生長在HM9培養基之無轉染R223細胞系之可相較的樣本。從GS轉染子3E10產生的EPO(相較于無轉染的R223細胞系)呈現更酸的異構物，分析IEF膠可以定量異構物的分布和計算理論上異構物的相對活性(IRA)。
表9分析來自于無轉染的R223細胞系及GS轉染子3E10之EPO異構物相對活性。

*活性數據來自EP-A 0 428 267數據指出了GS轉染子3E10有相當大的產物品質提升(表9及10)，IRA幾乎兩倍高于控制組無轉染的R223細胞系培養。
也決定了來自GS轉染子3E10之EPO的假設N-多醣電荷“Z”，表10沒有決定無轉染的R223細胞系之“Z”，然而，GS轉染子3E10(273于最大細胞濃度及265于收集時)之“Z”值超過瓶培養(183-228)無轉染R223細胞系的值。“Z”是根據Hermentin等于Glycobiology，1996，6，217-230決定；將個別％-唾液酸化的(sialyated)異構物之部分乘以對應的該異構物負電荷，可得Z，視其是否缺乏唾液酸基/中性、單涎、三-、四或五涎而定。該乘積之數學總合術語是Z。Z數字是關于活體內給予的治療上糖蛋白質(Hermentin，ibd.)之清除速率。
表10來自無轉染R223細胞系及GS轉染子3E10之EPO產物品質分析。
實施例10.在6公升發酵槽無血清懸浮培養之GS轉染子3E10的產量、代謝及產物品質。
GS轉染子3E10是生長在分批培養于氣舉式(airlift)發酵槽，培養基是無谷氨酰胺的HM9，不含血清，每一個培養有濃縮的養分供應，其含有胺基酸及葡萄糖，設計使主要消耗之養分維持在足夠濃度。結果顯示在表11，也包括無轉染的親本R223發酵數據，用于比較。
GS轉染子呈現延長的生存能力，所以培養期間增加，產物合成的比速率相同于無轉染的親本細胞系，但較長培養壽命造成最大產物濃度增加，氨累積至少低于GS轉染子四倍，GS轉染子產物品質(以IRA測量)改善。
表11GS轉染子3E10細胞在無血清懸浮培養的生長及產量，產生的EPO產物品質用IRA定量。

*累積細胞時數，細胞濃度的時間積分[Renard等，1988，Biotechnology Letters10(9)1-96]。
實施例11.在基于Iscove氏的培養基中無血清懸浮培養GS轉染子的產量及代謝實施例7中適應于無血清生長的GS轉染3E10是培養在震蕩瓶，在無血清無谷氨酰胺的Iscove培養基，親本細胞系R223是對應生長在相等的添加谷氨酰胺之培養基。
所用的培養基是Iscove修飾的Dulbecco培養基，含有Iscove添加物(牛血清白蛋白0.4g/L、人類全(holo)運鐵蛋白30mg/L)、重組人類胰島素10mg/L、LutrolF68 1g/L及乙醇胺60μL/L。用于培養R223細胞系的培養基含有4mM谷氨酰胺，但用于GS轉染的細胞系則不加谷氨酰胺，改以4mM谷氨酸鈉加4mM天冬酰胺。
GS轉染的細胞系3E10之產物合成比速率大約50％高于無轉染的親本是R223(表12)，轉染的細胞系3E10之氨生成比速率低七倍(表13)。
產物是從這些個別培養純化而來，并在等電點聚焦法(IEF)膠體上分析，此分析結果顯示于圖5，其顯示染色后的IEF膠。IEF膠在pH 2.5到6.5變性條件下跑，并以考馬斯藍染色。
來自R223的產物至少有13條可見的條帶，分布在整條膠體上；來自GS轉染的細胞系3E10生成的產物，較堿的條帶(膠體上方)強度比從細胞系R223產物條帶弱，但細胞系3E10較酸的條帶(膠體下方)則強度增加。有至少一條額外的酸性條帶可在GS轉染子3E10產物中可偵測到，但R223產物偵測不到親本，這顯示來自GS轉染的3E10的產物的唾液酸化程度增加。
表12在無血清懸浮培養于Iscove培養基中的GS轉染子3E10細胞之生長及產量
表13在無血清懸浮培養于Iscove培養基中GS轉染子3E10細胞之氨生成減少
通過光密度掃描IEF-凝膠圖象進一步量化圖5的凝膠數據。計算出了每個條帶代表的產物的相對比例。數據總結在表14中，每個條帶的相對比例表示為占凝膠各個泳道上總產物的百分比。
酸性更強的條帶(8-14)具有最高的生物學活性，而酸性較弱的條帶活性相對較低或沒有活性。從凝膠(圖5)和光密度掃描圖譜(見圖6，凝膠泳道4和圖7，凝膠泳道5)顯見，GS轉染的細胞系的產物，GSR223在酸性更強的同種型中富含。對于未轉染的細胞系，R223，條帶8-14占了總產物的44％，而GS轉染的細胞系，GSR223，該比例達到了73％。在圖6和7中，峰是根據圖5中凝膠條帶的編號進行辨別的。
權利要求
1.一種在谷氨酰胺營養缺陷型細胞中用GS作為可選擇標記，提高被編碼谷氨酰胺合成酶的外源DNA序列轉染的細胞中糖基化蛋白的唾液酸化和/或N-多醣電荷的方法。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述被轉染的細胞能產生所述蛋白質，從所述被轉染的細胞中回收所述糖基化蛋白。
3.一種在谷氨酰胺營養缺陷型細胞中用GS作為可選擇標記，通過提高定義為Z數字的N-多醣電荷以增強糖基化蛋白產物的質量的方法，所述Z數字與活體內給予的治療上糖蛋白質的清除速率相關。
全文摘要
以可編碼蛋白質的外源DNA序列或能夠改變可編碼蛋白質之內生基因表達的外源DNA序列及可編碼谷氨酰胺合成酶的外源DNA序列轉染谷氨酰胺營養缺陷型人類細胞，其中這些外源DNA序列位于一個或多個DNA構建物上，該轉染的細胞能夠產生該蛋白質及能夠生長在無谷氨酰胺的培養基中。
文檔編號C12N15/85GK1966682SQ20061016672
公開日2007年5月23日 申請日期2003年1月17日 優先權日2002年1月17日
發明者J·伯齊, R·C·伯拉斯頓, M·肖 申請人:英國龍沙生物醫藥股份有限公司