專利名稱：凍干甲型肝炎減毒活疫苗及其保護劑的制作方法
技術領域：
本發明總地涉及甲型肝炎疫苗，特別是涉及冷凍干燥形式的甲型肝炎減毒活疫苗和其工業規模大批量生產方法。本發明進一步涉及冷凍干燥病毒疫苗的保護劑，及其在生產冷凍干燥的病毒活疫苗，特別是冷凍干燥的甲型肝炎病毒活疫苗中的應用。
甲型肝炎是一種由自然界廣泛存在的甲型肝炎病毒(HAV)引起的全球性高發病率的急性傳染病。由于甲型肝炎流行很普遍而且漫延迅速，所以甲肝的流行已成為一個嚴重的公共衛生問題。據統計，全世界約有40億人口受到該疾病的威脅。在包括中國在內的發展中國家，由于人口眾多，社會經濟和公共衛生條件相對落后，所以常常在某些局部地區有甲型肝炎的大規模暴發流行，特別是在天然災害之后。在經濟發展的美國，每年約有10,000例肝炎病人與甲型肝炎病毒感染有關。據粗略統計，在中國有近5億人口受到甲型肝炎的威脅，每10萬人口約有200至300人遭受感染。因此，發展高特異性和安全性的甲肝病毒疫苗是臨床病毒學研究中的一個重要課題。自本世紀七十年代以來，許多研究者致力于甲型肝炎滅活疫苗或病毒活疫苗的研究。例如，美國專利4,164,566公開了在亞人類靈長目的動物(如狨猴)細胞培養物中連續傳代選育甲型肝炎病毒，并以所得到的甲型肝炎病毒CR326病毒株在多種細胞系內傳代增殖，以制備甲型肝炎疫苗。美國專利4,532,215號和4,636,469號公別公開了從甲型肝炎病人糞便中分離野生病毒，至少經5次傳代以制備可用作疫苗的HM-175病毒株的方法。美國專利4,506,016號公開了使甲肝病毒首先適當于人腎細胞系，然后再適應于人肺成纖維細胞，以制備減毒的甲肝炎疫苗的方法。已授權的中國專利85107525號和中國專利92114998號分別公開了甲型肝炎H2病毒的方法，以及分別以這些病毒株作為毒種制備甲型肝炎活疫苗的方法。另外，中國專利申請94101257.3號公開了以懸浮吸附法增殖甲型肝炎病毒的技術。然而，按這些現有技術制備的甲型肝炎活疫苗制品幾乎都是懸浮液劑型的。在幾乎不含營養成份的懸浮介質中，游離的活病毒不能在常溫下長時間存活，既使在2～8℃的低溫條件下也只有3～6個月的貯存有效期。因此，必需在低溫冷藏條件下即通過所謂“冷鏈”運輸、貯存和使用，從而使病毒活疫苗的大規模推廣使用，特別是在經濟不發達地區及熱帶和亞熱帶地區的推廣使用受到很大的限制。鑒于上述這些事實，本發明人經過長期的反復研究，設計并成功地配制了用于病毒減毒活疫苗，特別是甲型肝炎活疫苗冷凍干燥制品的保護劑，并成功地制備了冷凍干燥形式的甲型肝炎病毒活疫苗制劑，從而完成了本發明。
因此，本發明的一個目的是提供一種可在常溫下長期保存的，冷凍干燥形式的甲型肝炎活疫苗組合物，特征在于該疫苗組合物由預防有效劑量的減毒的甲型肝炎活病毒和活病毒疫苗保護劑組成。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說的甲型肝炎活病毒是按已知方法制備的。
根據本發明這一目的一個優選實施方案，其中所說的病毒活疫苗保護劑由人血清白蛋白和/或明膠、以及適當量的海藻糖、選自谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和賴氨酸的一種或兩種氨基酸或其堿金屬鹽，以及抗壞血酸、尿素、甘露醇和肌醇組成的，且其中所說的氨基酸堿金屬鹽最好是谷胺酸鈉。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說的凍干病毒疫苗保護劑中各成分的含量分別為人血清白蛋白0-20g/L，明膠5-10g/L，海藻糖50-100g/L，谷氨酸鈉7.5-15g/L，抗壞血酸0.5-1g/L，尿素5-28g/L，山梨醇2-10g/L和肌醇5-10g/L。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說的病毒活疫苗保護劑也可以不含有人血清白蛋白。
本發明的另一個目的是提供一種制備如上文限定的冷凍干燥的甲型肝炎病毒減毒活疫苗的方法，該方法包括(1)提供甲型肝炎病毒活病毒疫苗原液；(2)在步驟(1)中所述的病毒疫苗原液中，按1∶1(V/V)的比例加入由人血清白蛋白和/或明膠、海藻糖、抗壞血酸、選自谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和賴氨酸的一種或兩種氨基酸或其堿性金屬鹽、尿素、甘露醇和肌醇組成的活病毒疫苗保護劑并混勻之；(3)冷凍干燥步驟(2)中得到的疫苗組合物。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中步驟(3)所說的冷凍干燥步驟包括首先將所說的疫苗組合物于大約-20至-50℃的溫度下預冷凍3至6小時，然后在適當的凍干裝置中真空干燥10至20小時。
本發明的再一個目的是提供一種病毒活疫苗凍干保護劑，該保護劑基本上由人血清蛋白和/或明膠、海藻糖、抗壞血酸，選自谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和賴氨酸的一種或兩種氨基酸或其堿金屬鹽、尿素、以及甘露醇和肌醇組成。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說的保護劑各成分的含量分別為人血清白蛋白0-20g/L，明膠5-10g/L，海藻糖50-100g/L，谷氨酸鈉7.5-15g/L，抗壞血酸0.5-1g/L，尿素5-28g/L，山梨醇2-10g/L和肌醇5-10g/L。
根據本發明這一目的的優選實施方案，其中所說的保護劑適用于保護選自腸道病毒、付粘病毒、蟲媒病毒和瘡疹病毒的凍干過程及凍干狀態下的活病毒疫苗制劑。
本發明提供了冷凍干燥形式的甲型肝炎病毒活疫苗組合物，其特征在于該組合物由預防甲型肝炎有效量的甲型肝炎減毒活疫苗和適當量的活病毒疫苗保護劑組成。
一般說來，用于誘導或增加哺乳動物，特別是人體內抗病抗體產生的疫苗主要有四類，即活疫苗、死疫苗或滅活疫苗、亞單位疫苗及類毒素。其中，活疫苗可以使宿主產生最強的免疫反應。通常，這些活疫苗在某些細胞系中經過適當次數的傳代并減毒后，可使之得以增加對抗原的免疫反應時間，并且不誘發與之相關的疾病。也可以用化學或其他適當的方法將疫苗病原因子失活，以制備滅活的死疫苗，但這些方法并不能使宿主免疫系統中存在的抗原因子失活。
就甲型肝炎病毒疫苗而言，目前主要是仍處于臨床試用階段的基于甲型肝炎HM-175病毒株的減毒疫苗(Merck Co.)和已在中國境內普遍應用的，分別基于甲肝炎病毒株H2和甲型肝炎H-A-1病毒株的減毒活疫苗(分別由中國醫學科學院醫學生物學研究所(中國昆明)和中國衛生部長春生物制品研究所(中國長春)生產)。大規模臨床接種試驗表明，這些疫苗，特別是基于甲型肝炎H-V-1病毒株的減毒活疫苗，目前尚未發現在免疫接種后臨床上有任何有意義的不良反應。血清學試驗結果顯示，接種這些活疫苗后絕大多數受試者都產生良好的抗體反應，僅一次接種后即達到95％以上的抗體陽性率，并且在接種后的4-8周均達到相當高的抗體滴度(參見中國專利92114998.0號)。
然而，迄今使用的甲型肝炎疫苗基本上都是水懸浮液形式的，這些液體制劑與現有的其他病毒或細菌疫苗制劑的一個共同缺點是缺乏足夠高的貯存穩定性。一般說來，這些液體制劑在常溫下保存極不穩定，例如懸浮液狀態的甲型肝炎疫苗在常溫下通常只能貯存大約3個月的時間，既使在2-8℃的低溫度條件下也僅有3-6個月的貯存有效期。因此，這些疫苗必需在很低的溫度條件下貯存運輸和使用，從而使為疫苗的大規模推廣和使用，特別是在經濟不發達地區及熱帶和亞熱帶地區的推廣和使用受到很大的限制。
為了解決上述問題，本發明人在長期的研究和生產實踐中發現，在按已公開的方法(例如按中國專利92114998.0號中所述的方法)生產的甲型肝炎減毒活疫苗原液中加入一種適當的保護劑，然后基于適當的冷凍干燥曲線，將所得甲型肝炎疫苗組合物制成凍干形式的疫苗制劑，將使疫苗的貯存有效期限至少延長一倍，從而大大減少了疫苗的貯存、運輸和使用過程中的“冷鏈”壓力和費用消耗，降低了疫苗的損失，提高了疫苗的使用效率，為疫苗的大規模推廣使用提供了重要條件。
可以按照已公開的方法例如中國專利92114998.0號中公開的方法制備減毒的甲型肝炎病毒疫苗培養液(病毒原液)，然后將本發明的病毒活疫苗保護劑按適當的比例(例如1∶1(V/V)的比例)與所得病毒原液相混合。無菌條件下分裝后，置于冷凍干燥裝置內進行凍干處理，以得到本發明的凍干形式的甲型肝炎減毒活疫苗組合物。一般說來，基于我們建立的凍干曲線，首先將此甲型肝炎減毒活疫苗組合物于大約-30至-50℃，最好在大約-40℃溫度下預冷凍3至6小時，然后于大約25至35℃的溫度下真空干燥約10至20小時，以得到本發明的凍干的甲肝病毒減毒活疫苗。
中國專利92114998.0號中詳細描述了制備甲型肝炎病毒減毒株L-A-1的方法，以及以所說的甲型肝炎L-A-1減毒活病毒株為毒種，工業規模生產甲型肝炎疫苗的方法。簡單地說，該方法包括首先將人胚肺二倍體細胞按1∶2至4的分種率，使用加有10-15％小牛血清的極限基本培養基(MEM)(pH7.2-7.6)擴增傳代。將細胞培養瓶置于37℃下旋轉培養5-8天，使之生長成致密的細胞單層。然后棄去生長培養液，并以新鮮的Earle氏液反復沖洗細胞3-5次。洗細胞后，接種按中國專利92114998.0號實施例1中所述方法制備的種子病毒懸浮液，并補加細胞生長維持液(加有維生素C的乳白蛋白水解液)，于34-36℃下培養。每周換液一次。約4周后棄去維持液和殘留的小牛血清，并直接加入含低濃度鹽(例如1-10mM NaCl)并且不含酚紅的199綜合培養液。繼續培養(34-36℃)4至6天后，收集細胞。經三次反復凍融后超聲破碎細胞，合并溶胞產物并離心除去細胞碎片，收集上清即得到甲型肝炎病毒減毒疫苗懸浮液。
另外，也可按照中國專利85107525號中所述的方法制備用于本發明的方法的甲型肝炎病毒減毒活疫苗懸浮液。
本發明進一步提供了可使冷凍干燥形式的病毒活疫苗長時間保持生物學活性的凍干病毒活疫苗保護劑，該保護劑基本上由人血清白蛋白和/或明膠、海藻糖、抗壞血酸，選自谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和賴氨酸的一種或兩種氨基酸或其堿金屬鹽、尿素，以及甘露醇和肌醇組成。所說的保護劑中各基本成分的含量分別為人血清蛋白0-20g/L，明膠5-10g/L，海藻糖50-100g/L，谷胺酸鈉7.5-15g/L，抗壞血酸0.5-1g/L，尿素5-28g/L，山梨醇2-10g/L和肌醇5-10g/L。
甲型肝炎病毒是一種不帶有包膜，也不含脂質的微小核糖核酸病毒。甲型肝炎病毒與大多數其他病毒一樣，無論以懸液形式或凍干形式存在，常溫下均很容易被失活，失去其再生、增殖和對任何適當宿主的感染能力。然而，由于失活后的病毒仍存在病毒衣殼蛋白，故仍存在刺激宿主生物體產生抗體的免疫原性。從預防和治療目的考慮，活疫苗可通過其改造野生病毒、誘發體液免疫反應及淋巴細胞介導的細胞免疫反應達到預防病毒感染并殺滅侵染機體的病毒的目的。但活疫苗一旦由于不適宜的凍干等處理、運輸或儲存等條件被失活，便難于達到死疫苗所具有的免疫保護能力，甚至只為死疫苗的幾十分之一。因此，尋找并利用適當的活疫苗保護劑，制備可以在常溫甚至更高溫度下保留的凍干病毒活疫苗，便成了一個亟待解決的問題。
在如上文所述的本發明的活病毒疫苗保護劑中，人血清白蛋白和明膠主要發揮蛋白質和膠體支架作用，為懸液或凍干后的活病毒提供空間支持和部分營養保護作用。海藻糖具有穩定細胞和蛋白質結構、抵御高溫破壞的功能。研究證明，在海藻糖存在下干燥處理的抗體、酶、病毒等生物材料，當重新水合后均能恢復其活力(Roser B.,Food Sci & Technol.2(7):166-169,1991；Roser B.,Biopharm.4(8):47-53,1991；Roser B,Colace C.,New Scientist,138:24-28,1993)。利用海藻糖干燥處理小兒麻痹疫苗已獲得了成功。谷氨酸等堿性氨基酸鹽、尿素、山梨醇和肌醇，以及抗壞血酸，在本發明的凍干保護劑中則主要起到調整pH、穩定水合狀態或脫水過程中的滲透壓，以及抗氧化等作用。
可以在適當的容器內，按常規試劑配制方法配制本發明的病毒疫苗保護劑，但在混入海藻糖、明膠、山梨醇或肌醇之前，應將這些物質于37℃下預加熱24-48小時，并且在分裝待凍干的疫苗前0.5-2小時將保護劑與待凍干疫苗以大約1∶1(V/V)的比例混合均勻。用于冷凍干燥處理的甲型肝炎減毒活疫苗是按常規方法(如按中國專利92114998.0號所述的方法)制備的懸液形式的甲型肝炎減毒活疫苗。可使用常規冷凍干燥裝置將分裝好的上述混合液于-30至-50℃下預凍3-6小時，然后于28至35℃下真空干燥8至12小時。凍干過程中，疫苗凍干混合物的共融溫度低于-40℃。
為了證實本發明的病毒疫苗保護劑在生產冷凍干燥形式的病毒活疫苗中的保護作用，及其對冷凍干燥的病毒活疫苗儲存穩定性的影響，我們以甲型肝炎減毒活疫苗為例，對其在加入和不加入本發明凍干保護劑條件下，凍干前和凍干后的病毒濃度，以及凍干保護劑對疫苗病毒之儲存穩定的影響進行了一系列比較試驗。試驗結果顯示，本發明的病毒活疫苗保護劑不僅在冷凍干燥處理過程中對甲肝病毒活性具有極好的保護作用，而且可以顯著地提高甲肝疫苗在凍干狀態下和提高的溫度下的貯存穩定性。
在此基礎上，我們還以同樣方法檢測了本發明的凍干保護劑對麻疹減毒活疫苗，以及甲肝-麻疹二聯疫苗進行了相似的凍干前后病毒(活性)濃度比較試驗和凍干制品在不同溫度與貯存時間條件下的貯存穩定性試驗。試驗結果顯示，本發明的病毒活疫苗保護劑同樣可有效地保護麻疹活疫苗及甲肝-麻疹二聯疫苗在冷凍干燥處理過程中的病毒抗原活性，以及這些病毒疫苗在凍干制品在提高了的溫度下的貯存穩定性。
令人驚奇的是，我們的試驗還發現，當用于某些無包膜病毒，如麻疹病毒或脊髓灰質炎病毒等病毒減毒活疫苗時，在如前所述的凍干病毒保護劑中加入極少量或完全不加入人血清白蛋白，同樣可以達到良好的凍干保護效果。
實施例1病毒活疫苗冷凍干燥保護劑(Ⅰ)的制備按下列配方配制含有人血清白蛋白的病毒活疫苗冷凍干燥保護劑(Ⅰ)成分含量(g/L)人血清白蛋白10.0明膠5.5海藻糖 65.0谷氨酸鈉10.0尿素20.0抗壞血酸5.5山梨醇 6.5肌醇7.5
首先將醫藥用白明膠5.5g溶解大約300ml蒸餾水中，加熱煮沸使之溶解后，于大約116℃下高壓蒸汽滅菌40分鐘，然后室溫冷卻30-35℃。向所得明膠溶液中加入10.0g使用0.22μm濾器或濾柱(0.1、0.2、0.5、1.0μm)過濾除菌的人血清白蛋白(長春生物制品研究所生產)，并充分攪拌混勻后備用。
稱取上述重量的海藻糖、尿素、抗壞血酸、甘露醇和肌醇，并依次加入到大約500ml蒸餾水中。然后在振蕩攪拌下將混合物于37℃預加熱約24小時，冷卻至室溫(22～26℃)后將所得混合物溶液與上述的明膠-血清白蛋白混合均勻，加入蒸餾水補足體積(1L)并用0.1N HCl將pH調到約7.0。再次過濾除菌后即得到本發明的病毒活疫苗冷凍干燥保護劑(Ⅰ)。
實施例2病毒活疫苗冷凍干燥保護劑(Ⅱ)的制備基本上按照實施例1所述的方法配制含下列成分的病毒活疫苗冷凍干燥保護劑(Ⅱ)成分 含量(g/L)明膠 8.5海藻糖75.0尿素 15.5L-精氨酸 10.1抗壞血酸 3.0山梨醇5.5甘露醇6.5肌醇 4.0與保護劑(Ⅰ)不同的是，本實施制備的保護劑(Ⅱ)不含有價格較貴并且有可能導致肝炎甚或HIV病毒污染的人血清白蛋白，并且其中以L-精氨酸或其鈉鹽代替保護劑(Ⅰ)中的谷氨酸鈉。另外，該保護劑(Ⅱ)中添加了少量的可能進一步提高保護效果的甘露醇。
實施例3甲型肝炎減毒活疫苗凍干制劑的制備按照中國專利92114998.0號中所述方法制備甲型肝炎病毒減毒活疫苗。簡單地說，首先用本研究所建立的甲型肝炎H-A-1病毒株感染按適當分種率傳代增殖的人胚肺二倍體細胞，并且于35℃孵箱中連續培養4周，每周更換培養液一次。4周后棄去維持液及殘留的小牛血清，并加入含低濃度鹽但不含酚紅的199綜合培養液。繼續培養4-6天后收集細胞。經三次反復凍融并超聲破碎細胞后，離心除去細胞碎片，收集上清液即得到懸液形式的甲型肝炎病毒減毒活疫苗。
將按照實施例1中所述方法制備的保護劑(Ⅰ)以1∶1(V/V)的比例加入到檢定合格的甲肝病毒活疫苗懸浮液中，混勻后無菌分裝并置于密閉的真空冷凍干燥器(FS150-SS20C型，Hull Co.,USA)內進行凍干處理。首先將疫苗組合物于大約-40℃下預凍4小時，然后升溫至32℃真空干燥約15小時即得到所需的冷凍干燥的甲型肝炎減毒活疫苗。
實施例4麻疹病毒減毒活疫苗凍干制劑的制備按照現行的中國生物制品規程中《麻疹減毒活疫苗制備與檢測規程》的要求制備懸液形式的麻疹減毒疫苗。將該疫苗懸液與按實施例2中所述方法制備的減毒病毒活疫苗保護劑(Ⅱ)以1∶1(V/V)的比例混合。將此疫苗混合物于大約40℃預冷凍5小時，然后于大約34℃下真空于燥約14小時，得到所需的冷凍干燥的麻疹病毒減毒活疫苗。
實施例5冷凍干燥的甲型肝炎病毒減毒活疫苗的貯存穩定性首先用無菌水對按實施例3所述方法制備的凍冷干燥的甲肝疫苗進行10倍系列稀釋。然后取10-5稀釋度稀釋的病毒液作為實驗組，并以不加本發明的凍干保護劑冷凍干燥的甲肝病毒減毒活疫苗作為對照。將兩者分別接種于人胚肺二倍體細胞中，35℃培養28天后收集培養物并離心分離溶胞產物的上清液，使用標準的甲型肝炎病毒滴度檢測試劑盒，以酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫螢光(IF)法檢則甲型肝炎病毒滴度。結果顯示，同一批號疫苗樣品凍干前疫苗的病毒感染性濃度(TCID50/ml)分別為6.67和6.68。加入本發明凍干保護劑冷凍干燥的樣品，凍干后5份實驗組樣品的感染滴度為6.33至6.50，而不加本發明凍干保護劑冷凍干燥的樣品，凍干后5份對照組樣品的感染滴度則下降到1.33至2.33。
在另一項試驗中，則觀察到在加入本發明的保護劑的情況下，本發明的冷凍干燥的甲肝減毒疫苗(5個批號)在凍干前和凍干后的病毒感染性滴度下降值不大于0.5Log TCID50/ml。
在此基礎上，本實施例進一步按上述相似的方法試驗了在有保護劑存在時，甲型肝炎減毒活疫苗凍干制品于4～8℃溫度下，分別貯存3至12個月的貯存穩定性，并比較了甲肝病毒減毒活疫苗懸液態制劑和凍干制劑在2～8℃、室溫及37℃溫度條件下的貯存穩定性，結果分別如下列表1和表2所示。
表1加保護劑凍干的甲肝減毒活疫苗于4～8℃下的貯存穩定性
表2甲肝減毒活疫苗液體制劑和加保護劑凍干的凍干制劑的貯存穩定性的比較*
*所給數據為5批樣品的平均值。
從上列表2和表3中所示的結果可以看出，本發明的病毒活疫苗保護劑具有在干燥、高溫和滲透壓條件下穩定病毒蛋白質及核酸結構，有效地維持疫苗病毒的活力，從而大大延長其有效貯存的時間的作用。
實施例6凍干的甲型肝炎減毒活疫苗的免疫原性和安全性試驗以每5只血清甲肝病毒(HAV)試驗陰性，血清谷氨酸草酰乙酸轉氨酸(SGPT)水平正常的健康恒河猴(平均體重4.5kg)為實驗對象，以按實施例3所述方法制備并于室溫下貯存1個月的凍干的甲肝病毒減毒活疫苗為實驗組，并以未經凍干處理也不加存凍干保護劑的甲肝病毒減毒活疫苗懸液制劑作為對照。分別給實驗組(1-3組)動物靜脈接種實驗疫苗樣品1.0ml，第4組(對照組)動物則靜脈接種對照疫苗樣品。接種后0、2、4、6和8周采集動物靜脈血液，檢測動物血清SGPT值和抗HAV抗體滴度。同時，對各組動物進行肝組織穿刺并進行活體組織學檢查。結果如下列表3所示。
表3凍干的甲肝減毒活疫苗接種后對HAV抗體生成和肝臟功能及組織學改變的影響
*采用賴氏法檢測SGPT，結果(5只動物的平均值)≥25U/ml為肝轉氨酶異常升高；**所給數值為各組5只動物的陽轉率。
從表3所示結果可以看出，本發明的凍干甲肝減毒活疫苗在經過冷凍干燥處理并于室溫(25℃)下貯存30天后，仍保留有其原始狀態下的免疫原性和使用安全性。凍干過程和室溫貯存30天期間基本上沒有導致疫苗生物學功能的丟失。
實施例7冷凍干燥的麻疹病毒減毒活疫苗的儲存穩定性基本上按照實施例5中所述方法檢測冷凍干燥的麻疹減毒活疫苗在凍干前和凍干后病毒感染性滴度的改變，以及凍干的麻疹活疫苗分別在4～8℃和37℃溫度下的貯存穩定性。
結果顯示，使用本發明的病毒活疫苗凍干保護劑冷凍干燥麻疹病毒減毒活疫苗，凍干處理過程導致的5批疫苗樣品的滴度下降平均≤0.5Log CCID50/ml。凍干的麻疹減毒活疫苗在4～8℃下貯存15個月活性降低＜0.5Log CCID/ml,37℃溫度下貯存4周活性下降＜1.0Log CCID50/ml。
權利要求
1．一種可在常溫下長期保存的，冷凍干燥形式的甲型肝炎活疫苗組合物，特征在于該疫苗組合物由預防有效劑量的減毒的甲型肝炎活病毒和活病毒疫苗保護劑組成。
2．根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說的甲型肝炎活病毒是按已知方法制備的。
3．根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說的病毒活疫苗保護劑由人血清白蛋白和/或明膠、以及適當量的海藻糖、選自谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和賴氨酸的一種或兩種氨基酸或其堿金屬鹽，以及抗壞血酸、尿素、甘露醇和肌醇組成的，且其中所說的氨基酸堿金屬鹽最好是谷胺酸鈉。
4．根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說的凍干病毒疫苗保護劑中各成分的含量分別為人血清白蛋白0-209/L，明膠5-10g/L，海藻糖50-100g/L，谷氨酸鈉7.5-15g/L，抗壞血酸0.5-1g/L，尿素5-28g/L，山梨醇2-10g/L和肌醇5-10g/L。
5．根據權利要求1的疫苗組合物，其中所說的病毒活疫苗保護劑也可以不含有人血清白蛋白。
6．制備如權利要求1至5中任何一項限定的冷凍干燥的甲型肝炎病毒減毒活疫苗的方法，該方法包括(1)提供甲型肝炎病毒活病毒疫苗原液；(2)在步驟(1)中所述的病毒疫苗原液中，按1∶1(V/V)的比例加入由人血清白蛋白和/或明膠、海藻糖、抗壞血酸、選自谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和賴氨酸的一種或兩種氨基酸或其堿性金屬鹽、尿素、甘露醇和肌醇組成的活病毒疫苗保護劑并混勻之；(3)冷凍干燥步驟(2)中得到的疫苗組合物。
7．根據權利要求6的方法，其中步驟(3)所說的冷凍干燥步驟包括首先將所說的疫苗組合物于大約-20至-50℃的溫度下預冷凍3至6小時，然后在適當的凍干裝置中真空干燥10至20小時。
8．一種病毒減毒活疫苗凍干保護劑，該保護劑基本上由人血清蛋白和/或明膠、海藻糖、抗壞血酸，選自谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和賴氨酸的一種或兩種氨基酸或其堿金屬鹽、尿素、以及甘露醇和肌醇組成。
9．根據權利要求8的保護劑，其中各組成成分的含量分別為人血清白蛋白0-20g/L，明膠5-10g/L，海藻糖50-100g/L，谷氨酸鈉7.5-15g/L，抗壞血酸0.5-1g/L，尿素5-28g/L，山梨醇2-10g/L和肌醇5-10g/L。
10．根據權利要求8的保護劑，其中所說的保護劑適用于保護選自腸道病毒、付粘病毒、蟲媒病毒和瘡疹病毒的凍干過程及凍干狀態下的活病毒疫苗制劑。
全文摘要
本發明總地涉及甲型肝炎疫苗,特別是涉及冷凍干燥形式的甲型肝炎減毒活疫苗和其工業規模大批量生產方法。本發明進一步涉及冷凍干燥病毒疫苗的保護劑,及其在生產冷凍干燥的病毒活疫苗,特別是冷凍干燥的甲型肝炎病毒活疫苗及相關腸道病毒減毒活疫苗中的應用。
文檔編號A61P31/12GK1214938SQ9812063
公開日1999年4月28日 申請日期1998年10月19日 優先權日1998年10月19日
發明者劉景曄, 王鵬富, 李光譜, 謝寶生, 宋宗明, 李淑焱, 劉晶, 于穎, 張喜珍, 梁本, 劉令九, 王瑋, 張玲, 薛勇, 李晶, 李玉紅, 林輝, 萬宗舉 申請人:衛生部長春生物制品研究所