一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法。包括將干黃姜原料粉碎、加水浸泡、酶解去雜質、提取薯蕷皂苷、固定化酶制劑組合物水解薯蕷皂苷為薯蕷皂素、航空煤油提取、成品，本發明利用固定化酶技術，將市售價格昂貴的鼠李糖苷酶和β?葡萄糖苷酶成功的應用于附加值較低的工業產品。本發明利用生物方法替代傳統酸解薯蕷皂苷顯著降低環境污染，本發明方法反應條件溫和，成本低。
【專利說明】
-種固定化酶的制備及水解善敲皂素的方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種固定化酶的制備及水解馨葫皂素的方法，屬于生物醫藥領域。 技術背景
[0002] 馨葫皂素，是一種白色或微黃色結晶性粉末，被醫藥界稱為"藥用黃金"，藥用價值 非常重要和廣闊。我國的馨葫皂素是世界上穩定增長而且緊缺的激素類原料，在世界醬體 醫藥原料歷史中，我國的馨葫皂素一直處于主導和壟斷的地位，占領全世界醬體醫藥原料 的97%市場份額。其他發達國家幾十年來雖然致力于尋找和制作替代品，但是由于先天氣 候地理條件和原材料的缺陷，導致替代品造價高昂，產品利用率低等缺點，W至于全世界的 發達國家幾十年來被迫只能依賴中國進口。從黃姜中提取的皂素是醫藥工業合成激素的重 要基始原料，W其為基礎可合成加工如雙締、沃氏氧化物等中間體原料藥產品和黃體酬、醋 酸強的松、布地奈德、醋酸潑尼松、甲基睪丸素、環丙孕酬、米司酬、雄締工酬、倍地米松、去 氨表雄酬等激素類系列產品。運些藥物用途極為廣泛，是世界僅次于抗生素類的第二大類 藥物。
[0003] 但馨葫皂素的加工過程需要采用大量的鹽酸對黃姜中的馨葫皂巧進行高溫加壓 水解，水解的過程中可將黃姜中的淀粉，纖維之類的物質部分或全部水解，產生的糖液及剩 余的酸對環境造成了嚴重污染。

【發明內容】

[0004] 基于此，本發明提供一種生產方法簡單，對環境無污染，反應條件溫和，生產成本 低的方法。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:包括W下步驟：
[0006] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過20目篩，加入到300kg~500kg中，將生料淀粉酶、 普魯蘭酶、真菌Q-淀粉酶加入上述溶液中酶解；
[0007] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[000引（3)將步驟(2)進行固液分離，固體用體積分數為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0009] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0010] 將高分子化合物載體加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為10°C的條件下攬拌， 使其溶解;然后加入與高分子化合物載體質量比為1:30~1:60的酶，攬拌均勻，置于1(TC的 恒溫搖床上，震蕩化；將上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置 lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收 集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0011] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進行酶解， 產生馨葫皂素粗品；
[0012] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0013] 其中：步驟(1)所述的每毫升生料淀粉酶的活力為10000~20000IU，每毫升普魯蘭 酶的活力為1000~5000IU，每毫升真菌a-淀粉酶的活力為50000~100000IU;
[0014] 步驟(4)所述高分子化合物載體殼聚糖，W及殼聚糖與非極性大孔樹脂、聚丙締酷 胺中的一種或幾種的混合物；
[0015] 步驟(4)所述每毫升所述固定化酶制劑組合物中，0-葡萄糖巧酶的活力為8000~ 12000IU，鼠李糖巧酶的活力為2000~5000IU;
[0016] 步驟(5)所述馨葫皂素粗品是指馨葫皂素質量分數含量在50% W下；
[0017] 本發明中生料淀粉酶購自美國杜邦公司，普魯蘭酶、真菌a-淀粉酶、鼠李糖巧酶、 e-葡萄糖巧酶均為寧夏乙征生物工程有限公司自產，其他試劑均為市售。
[0018] 本發明達到的有益效果：
[0019] 1、本發明中用生料淀粉酶替代傳統酸解或者酶解去除淀粉的益處在于:替代酸解 可W減少環境污染，反應條件溫和，成本低;傳統酶解是淀粉必須經過糊化才能進行液化糖 化，而本發明專利應用的生料淀粉酶直接可水解生淀粉，淀粉不需要糊化過程，并且添加量 少，淀粉液化效果好，可明顯節約能源和降低生產成本。
[0020] 2、本發明中用普魯蘭酶和真菌a-淀粉酶可水解生料淀粉酶不能水解的支鏈淀粉， 使淀粉水解徹底，運樣馨葫皂巧才能徹底從淀粉的包裹中釋放出來，提高馨葫皂巧的提取 率。
[0021] 3、用固定化的0-葡萄糖巧酶和鼠李糖巧酶替代酸水解，直接將馨葫皂巧水解為馨 葫皂素，反應條件溫和，固定化酶可W反復利用，節約成本，提高轉化率。
[0022] 4、我們驚奇的發現，用殼聚糖做酶的固定化載體，一方面殼聚糖對酶活有非常好 的保護作用；另一方面，殼聚糖可W作為抑菌劑，在整個馨葫皂巧水解過程中可W起到非常 好的抑菌作用，防止雜菌污染產生其他物質。
【具體實施方式】：
[0023] 為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面對本發明的具體實 施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節W便于充分理解本發明。但是 本發明能夠W很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可W在不違背本發 明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
[0024] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過20目篩，加入到300kg~500kg中，將生料淀粉酶、 普魯蘭酶、真菌Q-淀粉酶加入上述溶液中酶解；
[0025] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0026] (3)將步驟(2)進行固液分離，固體用體積分數為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0027] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[00%]將高分子化合物載體加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為10°C的條件下攬拌， 使其溶解;然后加入與高分子化合物載體質量比為1:30~1:60的酶，攬拌均勻，置于1(TC的 恒溫搖床上，震蕩化；將上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置 lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收 集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0029] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進行酶解， 產生馨葫皂素粗品；
[0030] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0031 ]表1本發明方法與普通提取方法對比
[0032]
[0033] 應用結果表明：應用本發明方法后，馨葫皂巧收率與目前正常生產工藝相比平均 提高9%;馨葫皂素收率于目前正常生產工藝相比提高8.9%;純度與正常工藝相比提高 2% ;溶解度提高3%，說明皂素的純度和收率都有比較明顯的提高。
[0034] 實施例1
[00巧](1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過20目篩，加入到300kg中，將生料淀粉酶20000IU、 普魯蘭酶1000IU、真菌a-淀粉酶100000IU加入上述溶液中酶解；
[0036] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解2地；
[0037] (3)將步驟(2)進行固液分離，固體用體積分數為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0038] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0039] 將殼聚糖加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為10°C的條件下攬拌，使其溶解;然 后加入與殼聚糖質量比為1:30的0-葡萄糖巧酶12000IU和鼠李糖巧酶2000IU，攬拌均勻，置 于l〇°C的恒溫搖床上，震蕩化;將上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件 下靜置lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水 分，收集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0040] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進行酶解， 產生馨葫皂素粗品；
[0041] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0042] 實施例2
[0043] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過20目篩，加入到300kg中，將生料淀粉酶10000IU、 普魯蘭酶5000IU、真菌a-淀粉酶50000IU加入上述溶液中酶解；
[0044] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0045] (3)將步驟(2)進行固液分離，固體用體積分數為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0046] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0047] 將殼聚糖與非極性大孔樹脂Wl: 1混合后加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為 l〇°C的條件下攬拌，使其溶解;然后加入與殼聚糖質量比為1:40的0-葡萄糖巧酶8000IU和 鼠李糖巧酶5000IU，攬拌均勻，置于10°C的恒溫搖床上，震蕩化；將上述混合液逐滴滴入 3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用 0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0048] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進行酶解， 產生馨葫皂素粗品；
[0049] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[00加]實施例3
[0051 ] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過20目篩，加入到300kg中，將生料淀粉酶16000IU、 普魯蘭酶2000IU、真菌a-淀粉酶90000IU加入上述溶液中酶解；
[0052] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0053] (3)將步驟(2)進行固液分離，固體用體積分數為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0054] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0055] 將殼聚糖、非極性大孔樹脂聚丙締酷胺Wl :1:1混合后加水配制成2g/L濃度的溶 液，在溫度為l〇°C的條件下攬拌，使其溶解;然后加入與殼聚糖質量比為1:50的0-葡萄糖巧 酶10000IU和鼠李糖巧酶3000IU，攬拌均勻，置于1 (TC的恒溫搖床上，震蕩化;將上述混合液 逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球， 并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0056] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進行酶解， 產生馨葫皂素粗品；
[0057] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0化引實施例4
[0059] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過20目篩，加入到300kg中，將生料淀粉酶15000IU、 普魯蘭酶3000IU、真菌a-淀粉酶70000IU加入上述溶液中酶解；
[0060] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0061] (3)將步驟(2)進行固液分離，固體用體積分數為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0062] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0063] 將殼聚糖與聚丙締酷胺Wl: 1混合后加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為10°C 的條件下攬拌，使其溶解;然后加入與殼聚糖質量比為1:50的(6-葡萄糖巧酶9000IU和鼠李 糖巧酶4000IU，攬拌均勻，置于10°C的恒溫搖床上，震蕩化;將上述混合液逐滴滴入3mol/L 的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用0.4mol/L的 葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0064] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進行酶解， 產生馨葫皂素粗品；
[0065] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0066] W上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，運些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應W所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，包括以下步驟： (1) 將IOOkg干黃姜原料粉碎，過20目篩，加入到300kg~500kg中，將生料淀粉酶、普魯 蘭酶、真菌α-淀粉酶加入上述溶液中酶解； (2) 將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h; (3) 將步驟(2)進行固液分離，固體用體積分數為75%的乙醇100L提取薯蕷皂苷，提取3 次，每次30min，液體可用于制造酒精； (4) 制備固定化酶制劑組合物： 將高分子化合物載體加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為HTC的條件下攪拌，使其 溶解;然后加入與高分子化合物載體質量比為1:30~1:60的酶，攪拌均勻，置于HTC的恒溫 搖床上，震蕩Ih;將上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化鈣溶液中，在2°C條件下靜置IOmin， 使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用〇.4mol/L的葡萄糖洗滌，抽濾除去游離水分，收集得到 的凝膠小球即為固定化酶； (5) 將步驟(3)提取的薯蕷皂苷用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進行酶解，產生 薯蕷皂素粗品； (6) 將步驟(5)的薯蕷皂素用航空煤油進行提取，得到含量為98%以上的純薯蕷皂素。2. 根據權利要求1所述的一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，其特征在于:步 驟（1)所述的每毫升生料淀粉酶的活力為10000~20000IU，每毫升普魯蘭酶的活力為1000 ~5000IU，每毫升真菌α-淀粉酶的活力為50000~100000IU。3. 根據權利要求1所述的一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，其特征在于:步 驟(4)所述高分子化合物載體殼聚糖，以及殼聚糖與非極性大孔樹脂、聚丙烯酰胺中的一種 或幾種的混合物。4. 根據權利要求1所述的一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，其特征在于:步 驟(4)所述每毫升所述固定化酶制劑組合物中，β-葡萄糖苷酶的活力為8000~12000IU，鼠 李糖苷酶的活力為2000~5000IU。5. 根據權利要求1所述的一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，其特征在于:步 驟(5)所述薯蕷皂素粗品是指薯蕷皂素質量分數含量在50%以下。
【文檔編號】C12N11/10GK105925559SQ201610466954
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】蘇二正, 陳龍
【申請人】寧夏乙征生物工程有限公司