專利名稱：用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組dna間接提取方法
技術領域：
本發明涉及一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法。
背景技術：
動物腸道內存在著大量的微生物菌群，這些微生物對機體的營養、免疫、生長發育等方面有著巨大的影響。它們的分離和鑒定對于研究腸道菌群功能及與機體的相互關系非常重要。傳統方法主要是把腸道微生物通過選擇性培養基分離培養后，再進行純菌的分類 鑒定。該技術不僅費時、費力，只能檢測可培養微生物，而對腸道中大量未知的不可培養微生物無能為力。隨著近年來現代生物技術的快速發展，大量分子生物學技術應用于腸道微生態學研究中，從動物腸道中提取基因組DNA是非常有用的方法，可用于檢測不可培養的微生物，反映腸道微生物之間及微生物與宿主間的真實相互關系，使我們能夠對腸道微生物有更完整的評價，也可以用來揭示腸道微生物生態系統中的基因的多樣性及其隨腸道環境的變化。這就要求從動物糞便樣品中抽提和純化腸道微生物基因組DNA。通過對樣品中微生物基因組DNA的研究從而間接了解其中微生物的分布和組成情況。而建立高效、準確的微生物基因組DNA間接提取方法也成為了腸道微生物分子生態學研究的一個技術關鍵所在。基因組DNA提取的主要目標是獲得最高的DNA回收，從而從微生物群落中獲得最具代表性的DNA，并進行進一步的分子操作(如PCR、SSCP, DGGE, TGGE, AFLP等)。但是來自動物腸道的樣品含有非常復雜的成分，尤其是脂類、酸類等有機物質在基因組DNA提取過程中很難去除，直接影響后續的PCR擴增、雜交、內切酶消化和細菌轉化等。此外，細胞裂解后粗提DNA的每一個純化步驟，例如在DNA分子研究之前進行的重復性純化步驟，不可避免的引起了 DNA的損失。大部分基因組DNA提取方法全都存在缺陷，例如細胞裂解不完全，DNA吸附于樣品表層，樣品提取物中含有酶抑制劑以及DNA的丟失、降解和剪切。另外，目前還大多沿用傳統的DNA制備方法，即酚/氯仿抽提法。該技術操作步驟復雜，樣品需要量大，DNA收率低，難以快速處理大量標本。另外，酚、氯仿等有機溶劑易造成環境污染，有損操作者的健康。因此，需要研究適用于動物腸道微生物DNA提取的方便、快捷、實用的方法，以解決使用常規方法所獲得的DNA樣品存在酸類等PCR抑制物以及細胞裂解率低、DNA損失嚴
重等問題。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法，利用細菌的平均密度(I. I U g/cm3)小于糞便樣品的平均密度(I. 7-2. 3 ii g/cm3)，在細胞裂解以前對樣品進行前處理，將微生物細胞從它們腸道樣品中分離出來，以解決在腸道微生物細胞裂解后，純化步驟存在污染物去除困難和DNA回收率低等問題。為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案來實現。所述的用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法，包括以下步驟I)向0. I-IOg動物糞便樣品中加入0. I-IOmL預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩5-20分鐘，然后加入0. I-IOmL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5-20分鐘，室溫40_400g離心，收集上清液轉移至另一離心瓶中；2)向上述步驟I)得到的沉淀物中加入0. 2-20mL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5-20分鐘，50-400g室溫離心10分鐘，取上清液與步驟I)所得上清液合并；3)將上述步驟2)得到的上清液室溫下6000-15000rpm離心10-60分鐘以回收菌體細胞；4)向上述步驟3)回收得到的菌體細胞中加入I-IOOml的洗滌液C，洗滌2_10分鐘，室溫下6000-15000rpm離心10-60分鐘以沉淀菌體細胞，其中洗滌液C為lg/L的焦磷酸鈉；5)向上述步驟4)得到的沉淀后的菌體細胞中加入20-200ul 50mg/ml的溶菌酶和10-50ul 20mg/ml的蛋白酶K，20_40°C水浴10-40分鐘，然后加入50-500 細胞裂解液D,輕輕顛倒混勻1-10分鐘，6000-15000rpm離心5_10分鐘,沉淀碎片；6)將上述步驟5)得到的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入100-1500 U I蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rpm離心3_10分鐘以沉淀蛋白質；7)將上述步驟6)得到的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入2-5倍體積DNA聯接液F到離心管中，用手顛倒1-5分鐘混勻；8)將上述步驟7)得到混合液加入一個含結合柱的收集管中，室溫放置1-5分鐘，3000-10000rpm離心1_3分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢；9)將上述步驟8)含結合柱的收集管放置在一個新的離心管中，加入300-700 ill洗滌液G到結合柱中，10000-13000rpm離心，倒掉收集管中的廢液；10)將上述步驟9)的結合柱重新放回收集管中，并加入400-750 i! I洗滌液H到結合柱中，8000-18000rpm離心，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次；11)將上述步驟10)的結合柱重新放回收集管，8000-18000rpm離心1-5分鐘；12)將上述步驟11)的結合柱裝入新的離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發干凈，在膜中央小心加入30-50 u I洗脫液I，不戳破膜，室溫放置，8000-15000rpm離心1_3分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C ;其中洗脫液I為0. ImM的Tris-HCl，pH=9. O。其中，上述間接提取方法中，所述勻漿緩沖液A由20-400mM Tris、15_200mM EDTA,50-350mM NaCl、0. 5-3%pvpp,0. 1-1% TEEPOL(R) 6IOS 組成，pH=6. 0-9. 0，其中 pvpp 的單位為 g/L ;優選由 200mM Tris、100mMEDTA、200mM NaCl、2%pvpp、0. 5%TEEP0L(R)6IOS 組成，pH=7. 5。所述勻漿緩沖液B 由 10-200mM Tris、5_100mM EDTA、25_350mM NaCl,0. 2-1. 5%pvpp 組成，0. 1-1%TEEP0L(R)610 S 組成，pH=6. 0-9. 0 ;優選由 IOOmM TrisUOOmMEDTA、150mMNaCl、l%pvpp、0. 5%TEEP0L(R) 6IOS 組成，pH=7. 5。所述細胞裂解液D由 lwt%SDS(十二烷基硫酸鈉)、20-60mM Tris、100_200mM NaCl,40-100mM EDTA 組成，pH=8. 0 ;優選由 lwt%SDS、40mMTris、150mM NaCl、60mM EDTA 組成，pH=8. O0所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2_8wt%冰醋酸組成；優選由3M KAc、4wt%冰醋酸組成。所述DNA聯接液F由5-10M異硫氰酸胍、200_600mM醋酸鉀組成，pH=4. 5-6. 0 ;優選由8M異硫氰酸胍、500mM醋酸鉀組成，pH=5. 5。所述洗滌液G由6M異硫氰酸胍、23mM檸檬酸鈉組成。所述洗漆液H由70wt%乙醇、150mM醋酸鉀組成，pH=5. O。本發明的間接提取方法，具有以下優點⑴操作簡單，不需要較為復雜的設備，常規生物化學或微生物學實驗室就可完成；并且涉及的試劑均為常規分析、分子生物學使用的試劑，相對于市場上的試劑盒成本低。⑵本發明方法是在細胞裂解以前對樣品進行前處理，將微生物細胞從它們糞便樣品中分離出來，避免了純化步驟存在污染物去除困難和DNA回收率低的問題。⑶本發明方法適用性強，提取的腸道微生物DNA的0D26Q/0D23Q及0D26(l/0D28(l接近標準值，可直接應用于分子操作來評價植物根系微生物群落多樣性。⑷提取過程不使用酚、氯仿，減少對實驗人員的身體健康傷害、所獲DNA完整，分子片段大于10kb，產量高。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。EDTA (乙二胺四乙酸)、Tris (三羧基甲基氨基甲烷)、SDS (十二烷基硫酸鈉)、NaCl、乙醇、焦磷酸鈉、pvpp (交聯聚乙烯吡咯烷酮)、硫酸鋁、異硫氰酸胍、KAc (醋酸鉀)、冰醋酸、醋酸鉀、檸檬酸鈉等試劑均為國產分析純藥品。TEEPOL (R) 6IOS(洗滌劑)購自SPECTRUM-USP公司。溶菌酶和蛋白酶K為上海生工進口分裝。實施例II)向0. 5g試驗用小白鼠動物糞便樣品中加入0. 5mL預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘，然后加入0. 5mL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10分
鐘，收集上清液轉移至另一離心瓶中。2)向上步所得的沉淀物中加入ImL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10分鐘，取上清液，與步驟I)所得上清液合并，室溫下IOOOOrpm離心30分鐘以回收菌體細胞，棄上清。3)向上步所得的菌體細胞中加入I. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下IOOOOrpm離心30分鐘以沉淀菌體細胞。向沉淀后的菌體細胞中加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K (20mg/ml)，37°C水浴30-40分鐘，然后加入122^1細胞裂解液D，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rpm離心10分鐘,沉淀碎片。
4)將上步所得的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250 iU蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rpm離心5分鐘。5)將上步所得的上清 轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯接液F到離心管中，用手顛倒混勻1-5分鐘。6)將上步所得的混合液加入一個含結合柱的收集管中，室溫放置2分鐘。6000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。7)將上述含結合柱的收集管放置在一個新的離心管中，加入500 ill洗滌液G到結合柱中，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液。8)將結合柱重新放回收集管中，并加入650 ii I洗滌液H到結合柱中，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液，重復上述步驟一次。9)將結合柱重新放回收集管，13000rpm離心2分鐘。10)將結合柱裝入一個新的離心管中，室溫放置數分鐘，以便乙醇揮發干凈，在膜中央小心加入30 u I洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2分鐘。13000rpm離心I分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C。以上溶液的加入量均可根據提取樣品的量的增加，而成比例增加。用分光光度計測定0D23(i、OD260 和 OD28tl,結果表明 0D26(i/0D23(i=2. 01，OD260/OD280=L 80，接近于標準值(注0D26Q/0D23Q標準值為2. 0，0D26(l/0D28(l標準值為I. 8)，可直接應用于分子操作，來評價評價動物腸道微生物群落多樣性。實施例2I)向0. 5g試驗用大鼠糞便樣品中加入0. 5mL預冷的無菌水混勻后,鏇潤震蕩10分鐘，然后加入0. 5mL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10分鐘，收集
上清液轉移至另一離心瓶中。2)向上步所得的沉淀物中加入ImL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10分鐘，取上清液，與步驟I)所得上清液合并，室溫下IOOOOrpm離心30分鐘以回收菌體細胞，棄上清。3)向上步所得的菌體細胞中加入I. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下IOOOOrpm離心30分鐘以沉淀菌體細胞。向沉淀后的菌體細胞中加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K (20mg/ml)，37°C水浴30-40分鐘，然后加入122^1細胞裂解液D，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rpm離心10分鐘,沉淀碎片。4)將上步所得的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250 Ul蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rpm離心5分鐘。5)將上步所得的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯接液F到離心管中，用手顛倒混勻1-5分鐘。6)將上步所得的混合液加入一個含結合柱的收集管中，室溫放置2分鐘。6000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。7)將上述含結合柱的收集管放置在一個新的離心管中，加入500 ill洗滌液G到結合柱中，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液。
8)將上述結合柱重新放回收集管中，并加入650iil洗滌液H到結合柱中，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。9)將結合柱重新放回收集管，13000rpm離心2分鐘。10)將結合柱裝入新的離心管中，室溫放置數分鐘，以便乙醇揮發干凈，在膜中央小心加入30 u I洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2分鐘。13000rpm離心I分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C。以上溶液的加入量均可根據提取樣品的量的增加，而成比例增加。
用分光光度計測定OD230^OD260 OD280,結果表明 OD260/OD230=2. 03，OD260/OD280=l. 82，接近于標準值(注OD26tlAD23tl標準值為2. 0，0D26(l/0D■標準值為I. 8)，可直接應用于分子操作，來評價評價動物腸道微生物群落多樣性。實施例3I)向0. 5g試驗用白兔糞便樣品中加入0. 5mL預冷的無菌水混勻后,鏇潤震蕩10分鐘，然后加入0. 5mL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10分鐘，收集
上清液轉移至另一離心瓶中。2)向上步所得的沉淀物中加入ImL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10分鐘，取上清液，與步驟I)所得上清液合并，室溫下IOOOOrpm離心30分鐘以回收菌體細胞，棄上清。3)向上步所得的菌體細胞中加入I. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下IOOOOrpm離心30分鐘以沉淀菌體細胞。向沉淀后的菌體細胞中加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K (20mg/ml)，37°C水浴30-40分鐘，然后加入122^1細胞裂解液D，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rpm離心10分鐘,沉淀碎片。4)將上步所得的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入250 Ul蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rpm離心5分鐘。5)將上步所得的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯接液F到離心管中，用手顛倒混勻1-5分鐘。6)將上步所得的混合液加入一個含結合柱的收集管中中，室溫放置2分鐘。6000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。7)將上述含結合柱的收集管放置在一個新的離心管中，加入500 ill洗滌液G到結合柱中，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中的廢液。8)將上述結合柱重新放回收集管中，并加入650iil洗滌液H到結合柱中，13000rpm離心I分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。9)將結合柱重新放回收集管，13000rpm離心2分鐘。10)將結合柱裝入新的離心管中，室溫放置數分鐘，以便乙醇揮發干凈，在膜中央小心加入30 u I洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2分鐘。13000rpm離心I分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C。以上溶液的加入量均可根據提取樣品的量的增加，而成比例增加。用分光光度計測定OD230^OD260 OD280,結果表明 OD260/OD230=2. 03，OD260/OD280=l. 78，接近于標準值(注OD26tlAD23tl標準值為2. 0，0D26(l/0D■標準值為I. 8)，可直接應用于分子操作，來評價評價動物腸道微生物群落多樣性 。
權利要求
1.一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法，其特征在于，包括以下步驟 1)向O.I-IOg動物糞便樣品中加入O. I-IOmL預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩5_20分鐘，然后加入O. I-IOmL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5-20分鐘，室溫40_400g離心，收集上清液轉移至另一離心瓶中； 2)向上述步驟I)得到的沉淀物中加入O.2-20mL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5-20分鐘，室溫50-400g離心，取上清液與步驟I)所得上清液合并； 3)將上述步驟2)得到的上清液室溫下6000-15000rpm離心10-60分鐘以回收菌體細胞； 4)向上述步驟3)回收得到的菌體細胞中加入I-IOOml的洗滌液C，洗滌2_10分鐘，室溫下6000-15000rpm離心10-60分鐘以沉淀菌體細胞，其中洗滌液C為lg/L的焦磷酸鈉； 5)向上述步驟4)得到的沉淀后的菌體細胞中加入20-200ul50mg/ml的溶菌酶和10-50ul 20mg/ml的蛋白酶K，20_40°C水浴10-40分鐘，然后加入50-500 μ I細胞裂解液D，輕輕顛倒混勻1-10分鐘，6000-15000rpm離心5_10分鐘,沉淀碎片； 6)將上述步驟5)離心得到的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入100-1500μ I蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rpm離心3_10分鐘以沉淀蛋白質； 7)將上述步驟6)得到的上清轉移到一個干凈的離心管中，加入2-5倍體積DNA聯接液F到離心管中,用手顛倒1-5分鐘混勻； 8)將上述步驟7)得到混合液加入一個含結合柱的收集管中，室溫放置1-5分鐘，3000-10000rpm離心1_3分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結合柱重新放入離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢； 9)將上述步驟8)含結合柱的的收集管放置在一個新的離心管中，加入300-700μ I洗滌液G到結合柱中，10000-13000rpm離心，倒掉收集管中的廢液； 10)將上述步驟9)的結合柱重新放回收集管中，并加入400-750μ I洗滌液H到結合柱中，8000-18000rpm離心，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次； 11)將上述步驟10)的結合柱重新放回收集管，8000-18000rpm離心1_5分鐘； 12)將上述步驟11)的結合柱裝入一新的離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發干凈，在膜中央小心加入30-50 μ I洗脫液I，不戳破膜，室溫放置，8000-15000rpm離心1_3分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C ;其中洗脫液I為O. ImM的Tris-HCl，pH=9. O。
2.根據權利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液A由20-400mMTris,15-200mM EDTA、50_350mM NaCl、0. 5_3%pvpp，O. 1_1%TEEP0L(R) 610S 組成，pH=6. 0-9. 0,其中pvpp的單位為g/L。
3.根據權利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液B為10-200mMTris、5-100mM EDTA、25_350mM NaCl、0. 2_1· 5%pvpp 組成，0. 1_1%TEEP0L(R)610S 組成，ρΗ=6· 0-9. O0
4.根據權利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述細胞裂解液D由lwt%SDS、20-60mM TrisU00-200mM NaCl、40_100mM EDTA 組成，ρΗ=8· 0。
5.根據權利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E由2-5ΜKAc,2-8被％冰醋酸組成。
6.根據權利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述DNA聯接液F由5-10M異硫氰酸胍、200-600mM 醋酸鉀組成，ρΗ=4· 5-6. O。
7.根據權利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述洗滌液G由6Μ異硫氰酸胍、23mM檸檬酸鈉組成。
8.根據權利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述洗滌液H由70%乙醇、150mM醋酸鉀組成，pH=5. O。
全文摘要
本發明涉及一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法。該方法在細胞裂解以前先對樣品進行前處理，將微生物細胞從它們糞便樣品中分離出來，避免了純化步驟存在污染物去除困難和DNA回收率低的問題。本發明提取過程不使用酚、氯仿，減少了對實驗人員的身體健康傷害。所提取的腸道微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近標準值，可直接應用于分子操作，以評價動物腸道微生物群落多樣性。
文檔編號C12N15/10GK102978198SQ20121049967
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者王金斌, 唐雪明, 李文, 祝子坪, 李鵬, 劉華, 白藍, 蔣瑋, 何建華, 陳大超, 趙凱 申請人:上海市農業科學院