用于環境真菌生物多樣性高通量測序的復合標簽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因測序技術領域，具體設及一種用于環境真菌生物多樣性高通量測 序的復合標簽，用于超高通量基因測序。
【背景技術】
[0002] 微生物群落多樣性是微生物生態學和環境學研究的重點之一。目前利用宏基因組 研究微生物多樣性越來越受到科學家們的關注，但由于對于同一個樣本來說，宏基因組研 究的結果中往往細菌的數量占大多數而使得真菌等微生物種類遠少于細菌。運對于某些領 域的研究非常不利，如對釀酒過程中各個時期的微生物種群研究，真菌的作用遠高于細菌， 對酒類品質的影響較大。因此利用真菌獨特的內轉錄間隔區序列為祀序列，用PCR擴增的 方法從復雜樣本中富集真菌DNA成為非常有效的方法。
[0003] Handelman(HandelsmanJ,RondonMR,BradySF.molecularbiologialaccess tothechemistryofunkownsoilmicrobes:Anewfrontierfornaturalproducts[J ].1998, 5(10) :R245-R249.)等（1998)首次提出宏基因組的概念，其定義為"thegenomes ofthetotalmicrobiotafoundinna1:ure"，即環境中全部微小生物遺傳物質的總和。它 包含了可培養的和未可培養的微生物的基因組總和。本發明所指的宏內間隔序列是指環境 中全部真菌內間隔序列的總和，為微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作 關系及與環境之間的關系為研究目的提供了一條新的思路。
[0004] 核糖體RNA(rRNA)由于功能上高度保守，序列上不同位置具有不同的變異速率， 是目前在微生物分子生態學上應用最廣泛的分子標記。真核生物基因組中編碼核糖體RNA 的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5. 8SrDNA4種，它們在染色體上頭尾相連、串 聯排列，相互之間由間隔區分隔（匡治州，許楊.核糖體rDNAITS序列在真菌學研究中的 應用口].生命的化學，2004(02):120-122.)。其中185、5.85和285扣臟基因組成一個轉 錄單元，Ξ者高度保守，適合于較高等級水平的生物群體間的系統分析，其間的間隔區為 內轉錄間隔區（Internal^TranscribedSpacer,ITS)，包括18S和5. 8S之間的內轉錄間隔 區l(ITSl)及5. 8S和28S之間的內轉錄間隔區2QTS2)兩部分，由于ITS不加入成熟核 糖體，所W受到的選擇壓力較小，進化速率較快，在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣 泛的序列多態性。同時ITS序列長度適中，從人類到酵母的各種真核生物中ITS的序列長 度為lOOObp到小于300bp大小不等，人們可W從不太長的序列中獲得足夠的信息，可廣泛 用于屬內種間或種內群體的系統學研究（IwenPC,HinrichsSH,Ru卵ΜE.化ilization oftheintern曰1transcribedsp曰cerregions曰smolecul曰rt曰rgetstodetect曰nd identifyhumanfungalpathogens[J].MedMycol, 2002, 40(1):87-109)。

【發明內容】
陽〇化]本發明提供一種用于環境真菌生物多樣性高通量測序的復合標簽及其應用，提高 超高通量測序的樣本通量，有效降低超高通量測序成本，有效富集樣本中整個微生物種群 中的真菌種群，為探明環境中真菌多樣性研究提供高通量分析途徑。 陽006] -種用于環境真菌生物多樣性高通量測序的復合標簽，其序列如如下序列編號 NO. 1 ~NO. 48 所示。
[0007] 本發明復合標簽的每一條序列由左側8-10個堿基組成具唯一性標簽和右側21個 源于真菌內轉錄間隔區1的序列組成的標簽復合而成。
[0008] 表 1
[0009] 陽010」

[0011] 本發明還提供一種真菌高通量基因測序方法，包括如下步驟： 陽〇1引 （1)提取每一個樣本的總DNA;
[0013] (2)對每一個樣本，從權利要求1中所示48對且未被選擇過的序列中選擇任一一 對序列作為引物，對對應樣本的總DNA進行擴增；
[0014] (3)對每一個樣本的擴增產物進行電泳檢測，對擴增產物進行純化回收；
[0015] (4)對每個樣本純化回收后的產物紫外分光光度計精確定量；
[0016] (5)將所有樣本等量混合后建立一個測序文庫；
[0017] (6)對所建測序文庫進行高通量測序。
[0018] 本發明所述真菌宏內轉錄間隔區序列是指所有落在真菌18S和5. 8S之間的內轉 錄間隔區1的總和，復合標簽如表1所示；利用表1的真菌宏內轉錄間隔區序列復合標簽可 達到在一次超高通量測序中同時對1~48個樣本中的真菌宏內間隔序列進行檢測。
[0019] 利用目前超高通量測序自身提供96種測序標簽（8-10個堿基），可做96個樣本， 但在超高通量測序前先對96個樣本分別建96個測序庫，然后等量混合成1個再同時測序， 而本發明只需建1個測序庫就能對48個樣本同時測序。如果將測序自帶的96個標簽和本 發明的48個復合標簽結合使用，則同時可對96*48個樣本的內轉錄間隔序列進行超高通量 測序。
[0020] 步驟（1)中對每個樣本總DNA提取采用通用提取方法。
[0021] 步驟（2)中對每一個樣本從表1所示48對且未被選擇過的序列中選擇任一一對 序列作為引物，其選擇原則具體為：確定每一樣本的編號，對每一個編號樣本，從表1中選 擇一序列編號所對應的序列1和序列2 (NO. 1的序列1和序列2為一對，NO. 2的序列1和 序列2為一對，NO. 3的序列1和序列2為一對W此類推），確定每一個樣本的一對序列；每 個編號的樣本可選表1中48對中的任何一對，但要求不同編號的樣本之間從表1選擇時不 要重合，即不同編號樣本不選擇同一個復合標簽。 陽〇2引步驟似中對對應樣本的總DNA進行擴增的擴增體系為：
[0023] PCR擴增的 50μΙ體系中含：50ng樣本總DNA，4yLMg2+，5yL10XBuffer，4yL濃 度為5nmoldNTP，1.抓Taq酶，濃度為lOpmol引物各1. 5μL補水至50μL。
[0024] ?〇?擴增程序：94°(：預變性5111111，94°(：變性303,40°(：復性303,72°(：延伸1111111，30 個循環，最后72°C延伸5min，4°C保存。
[00巧]步驟（3)中對每個樣本擴增產物進行純化回收采用通用的PCR產物回收試劑盒。
[0026] 本發明所述高通量測序采用基于IonPGM第二代超高通測序儀的測序平臺進行。
[0027] 優選地，步驟（5)中建庫所用建庫試劑盒為IonPGM第二代超高通測序儀對應的 IonXpress?PlusgDNAFragmentLibraryPreparation試劑盒。
[002引步驟（6)中測序時擴增所用擴增試劑盒為IonPGM第二代超高通測序儀對應的IonPGM?Template0T2400Kit試劑盒。
[0029] 步驟（6)中測序時測序所用測序試劑盒為IonPGM第二代超高通測序儀對應的 IonPGMSequencing400Kit試劑盒。
[0030] 所述樣本為含真菌的樣本。
[0031] 與現有方法相比，本發明具有如下有益效果：
[0032] 環境中（如±壤）棲居著大量的微生物，運些微生物的分布及其活動與±壤營養 條件，地上植被密切相關。濕地與森林、海洋并稱全球Ξ大生態系統，被稱為"地球之腎"，具 有豐富的生物多樣性。本方法W特定環境中的微生物為研究對象，基于宏基因組學的研究 思路，采用本方法所述的序列，建一個庫最多可對48個樣本同時進行超高通量測序，進行 基于宏基因組的環境樣本中的真菌種群變化規律研究，為各種環境樣本進行同類研究提供 方法。
【附圖說明】
[0033] 圖1是本發明其中一個樣本電泳檢測結果圖。
[0034] 圖2是8個樣本的超高通量測序結果總覽。
【具體實