專利名稱：一種研究白酒發酵過程微生物群落多樣性的方法
技術領域：
T-RFLP技術屬于微生物生態學領域，在傳統發酵食品中常被用于菌株鑒定、對比分析不同生態環境微生物多樣性、評估復雜微生物群落多樣性、發酵過程微生物動態消長等研究。
背景技術：
末端限制性片段長度多樣性(TerminalRestriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)是一種新興的研究微生物多態性的分子生物學方法，已經成功應用于各種微生物群落的分析比較、研究微生物群落多樣性及結構特征、菌種鑒定等多方面。T-RFLP技術的原理是根據研究目的和微生物群落的特點，選擇一段具有系統進化標記特征的DNA序列為目的片段，根據目標基因序列上的保守區設計引物，在其中一個引物的5’末端用熒光物質標記，采集樣品后提取微生物的總DNA，以總DNA為模板進行PCR 擴增，所得的PCR產物的一端就帶有熒光標記，利用合適的限制性內切酶進行酶切，不同微生物目標DNA片段因其核苷酸序列不同導致其酶切位點存在差異，酶切后產生許多不同長度的限制性片段。將酶切產物用自動測序儀進行電泳分離和熒光檢測，只有末端帶熒光標記的片段(T-RFs)能被檢測到，而其他沒有帶熒光標記的片段則檢測不到。由于核苷酸序列具有多態性，即不同微生物同一基因的DNA片段在相同條件下酶切后得到長度不同的 T-RFs，反映在T-RFLP檢測中就是不同的熒光信號，熒光強度的大小可以確定菌種的豐度。 通過對這些熒光信號以及由此生成的T-RFLP圖譜的分析，根據不同長度的末端限制性片段至少代表一種微生物種類，通過檢測這些末端標記的片段就可以反應微生物群落組成情況，還可根據已知序列鑒定到種。與其他分子指紋圖譜技術相比，T-RFLP具有以下優勢，1)操作簡單，高通量，能夠迅速產生大量重復、精確的數據，非常適合微生物群落時空變化研究；2)易于實現自動化， 輸出的數據能夠進行快速分析；幻根據T-RFs的長度，與現有數據庫比對，有可能直接鑒定群落圖譜中的單個菌種；4)精密度和分辨率較高。中國傳統固態發酵蒸餾酒的生產是包括了環境、糖化發酵劑等中的微生物菌群相互遷徙以及在發酵過程中動態演化、交替并最終趨于穩定的動態平衡過程。白酒發酵過程微生物群落是整個白酒釀造微生物生態系統的重要組成部分，微生物群落消長變化引起發酵過程物質能量變化，同時物質能量變化又反作用于微生物群落，這種相互作用的不斷交替進行是中國傳統固態法白酒的典型特征風味形成的重要物質基礎。研究白酒發酵過程中微生物群落的變化規律有助于加強對白酒特征風味形成機理的認識和理解，為提高產品質量和改良酒體風格提供理論依據。由于白酒發酵過程中微生物之間作用機理非常復雜，而以往研究方法多沿用平板分離法，改變了樣品中微生物群落組成，無法分析微生物與環境的相互關系，得到的只是可培養的那部分微生物信息，并且工作量大，操作繁瑣。應用T-RFLP分析白酒發酵過程微生物群落結構多樣性能夠克服傳統培養方法的局限，可以快速得到白酒發酵過程中微生物群落結構多樣性信息和動態演變規
3律。

發明內容
本發明的目的是針對白酒發酵過程微生物群落結構多樣性現有研究方法存在的問題，為解決部分微生物由于不可分離性造成難以直接研究的技術難題以及快速認識和了解白酒發酵過程中微生物動態變化規律，而提供的一種研究白酒發酵過程中微生物群落結構多樣性的方法。本發明的具體方案如下a)從某固態法白酒廠分別在發酵第l、3、7、10、15、21、28d時取酒醅樣，酒醅取樣后分別放置無菌離心管中，-20°C保存；b)取 0. 5 2. Og 酒醅樣品加 2 6. OmL 1 XPBS (137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KC1，4. 3mmol/L NaH2PO4 · 7H20，1. 4mmol/LKH2PO4)緩沖液，lOOOOrpm，4°C離心 lOmin，收集沉淀，加入DNA提取液提取總DNA ；C)以步驟b)中提取的總DNA為模板，采用通用引物擴增細菌16S rDNA。正向引物為 27F，反向引物為 1492R，其序列分別為27F :(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)， 1492R (5' -TACCTTGTTACGACTT-3 ‘)，正向引物27F的5，-端用6-羧基二乙酸熒光素 (FAM)標記；d)PCR 反應體系為 50μ L，包括 IOXPCR buffer 5 μ L, dNTPs (each 0. 25mmol/ L)4y L,引物(10ymol/L)各 1.0 μ L，DNA 模板 30ng，Tap 酶(5U)0. 3μ L0 PCR 反應條件采用降落策略預變性94 °C lOmin，前20個循環為94°C lmin、65 °C 55 °C Imin和 72°C 1. 5min (其中每個循環后復性溫度下降0. 5°C )，后10個循環為94°C lmin、55°C Imin 和72°C 3min，最后在72°C下延伸7min ；e)將步驟d)中得到的PCR產物用純化試劑盒(OMEGA)按照使用說明進行純化，純化后進行電泳檢測；f)將步驟e)中得到的純化后的產物利用限制性內切酶Msp I和Rsa I消化，20yL 中反應體系包括IOXbuffer 2 μ L, 10 μ L PCR產物，Msp I或RsaI各10U (1 μ L)，加入滅菌雙蒸水至20 μ L0 37°C消化2h后65°C溫育IOmin ；g)酶切產物進行T-RFLP分析，得到酒醅發酵過程T-RFLP圖譜，經數據處理，獲知白酒發酵過程中微生物動態變化和消長規律。本發明的優點是直接以酒醅DNA為研究對象，不改變酒醅樣品中微生物組成，能夠反映出酒醅在發酵過程中微生物組成原始面貌，具有快速、操作簡單、準確的特點。本發明的有益效果是為研究和揭示白酒發酵過程中微生物群落的變化規律提供了一種簡便、快捷、準確的方法。


附圖實例中固態發酵池在發酵周期內不同發酵天數的微生物群落變化。
具體實施例方式為更好的理解本發明，下面結合實例進一步闡述本發明。
從某固態法白酒廠發酵池中分別在發酵第3、7、10、21、28d時取酒醅樣品，每次取樣時都從上下層取樣并混合均勻，取樣后放置無菌離心管中，-20°C保存；取Ig酒醅樣品加 6mL lXPBS(137mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KC1,4. 3mmol/L NaH2PO4 · 7H20， 1. 4mmol/L KH2PO4)緩沖液。8000g，4 °C離心lOmin，收集沉淀，在沉淀中加入DNA提取液提取總DNA;以提取的總DNA為模板，采用通用引物擴增細菌16S rDNA。正向引物為 27F，反向引物為 1492R，其序列分別為27F :(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘ ), 1492R (5' -TACCTTGTTACGACTT-3')，其中正向引物5，-端用6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標記； PCR 反應體系采用 50 μ L 體系，包括 IOXPCR buffer 5 μ L, dNTPs (each 0. 25mmol/L) 4 μ L, 引物(10ymol/L)各1· 0 μ L，DNA模板30ng，Tap酶(5U) 0.3 μ L0 PCR反應條件采用降落策略預變性 94°C lOmin，前 20 個循環為 94°C lmin、65°C 55°C Imin 和 72°C 1. 5min (其中每個循環后復性溫度下降0. 5°C )，后10個循環為94°C lmin、55°C Imin和72°C 3min，最后在72°C下延伸7min。PCR產物用純化試劑盒(OMEGA)按照試劑盒使用說明進行純化，純化后進行電泳檢測；將純化后的產物分別利用限制性內切酶Msp I和Rsa I消化，消化體系采用20 μ L反應體系，包括IOXbuffer 2 μ L，10 μ L PCR產物，Msp I或RsaI各10U (1 μ L)，加入滅菌雙蒸水至20 μ L0在恒溫水浴37°C消化池后65°C溫育IOmin ；利用DNA測序儀對酶切產物進行T-RFLP分析，得到酒醅發酵過程T-RFLP圖譜，經數據處理，獲知白酒發酵過程中微生物群落動態變化和消長規律。總DNA提取方法取 Ig酒醅樣品加 6mL 1 XPBS (137mmol/L NaCl，2. 7mmol/L KCl, 4. 3mmol/L NaH2PO4 · 7H20，1. 4mmol/L KH2PO4)緩沖液。8000g，4°C離心 lOmin，收集沉淀， 在沉淀中加入 4ml DNA 提取液
，200 μ L 溶菌酶(lOmg/ml)，100 μ L 溶壁酶 (500U/ml)，37°C水浴lh，每15min輕輕搖晃一次。加60 μ L蛋白酶K(20mg/ml)，搖勻后， 37°C水浴lh，每15min輕輕搖晃一次。力卩250 μ L的20% SDS溶液，65°C水浴lh，每15min 輕輕搖晃一次。6000r/min離心lOmin，轉移上清至新的5ml離心管中。加等體積氯仿異戊醇(V V, 24 1)，搖勻，9000r/min離心8min，轉移上清至新的5ml離心管中，重復一次此步驟。轉移上清至新的離心管中，加0.6倍體積異丙醇，室溫沉淀過夜。12000r/min室溫離心30min，棄去上清。在沉淀中加入預冷的70%乙醇，洗滌2次，13000r/min 4°C離心 15min,加50 μ L無菌雙蒸水溶解沉淀，_20°C保存備用。最后應當說明的是，以上實施例僅用于說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍內。
權利要求
1.一種研究白酒發酵過程微生物群落多樣性的方法，其特征在于包含以下步驟a)以某固態法白酒廠窖池發酵不同天數的酒醅為樣品，取樣后分別放置無菌離心管中，-20°C保存；b)取0.5 2. Og 酒醅樣品加 2.0 6. OmL 1 XPBS (137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl， 4. 3mmol/L NaH2PO4 · 7H20,1. 4mmol/LKH2PO4)緩沖液，lOOOOrpm，4°C離心 lOmin，收集沉淀， 加入DNA提取液提取總DNA ；c)以步驟b)中提取的總DNA為模板，利用通用引物27F和1492R進行PCR擴增，以獲得細菌16S rDNA。其中正向引物27F的5，-端用6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標記；d)將步驟c)中得到PCR產物用純化試劑盒按照使用說明進行純化，純化后利用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測；e)將步驟d)中得到的純化后的產物分別利用限制性內切酶MspI和Rsa I消化，20yL 中反應體系包括IOXbuffer 2 μ L, 10 μ L PCR產物，Msp I或RsaI各10U (1 μ L)，加入滅菌雙蒸水至20 μ L0 37°C消化2h后65°C溫育IOmin ；f)酶切產物進行T-RFLP分析，得到酒醅發酵過程T-RFLP圖譜，經數據處理，獲知白酒發酵過程中微生物動態變化和消長規律。
2.權利要求1的所述方法，其特征在于步驟a)中選擇的樣品是發酵不同天數的酒醅。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b)中所述酒醅取樣量0.5 2. Og,緩沖液用量2. 0 6. OmL。
4.權利要求2所述的方法，其特征在于所述取樣量優選1.0g，緩沖液用量優選6. OmL0
5.權利要求1的方法，其特征在于步驟c)中正向引物27F的5’端使用6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標記。
6.權利要求1所述的方法，其特征在于步驟c)中PCR擴增采用降落PCR(TOUCHDOWN) 策略預變性條件為94 "C IOmin,前20個循環為94 °C lmin、65 "C 55 "C Imin和 720C 1. 5min (其中每個循環后復性溫度下降0. 5°C )，后10個循環為94°C lmin、55°C Imin 和72°C 3min，最后在72°C下延伸7min。
全文摘要
本發明涉及一種研究白酒發酵過程微生物群落多樣性的方法，即末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)技術，屬于微生物生態技術領域，主要步驟如下1)以白酒發酵過程中的酒醅為樣品，直接提取酒醅中總DNA；2)以總DNA作為聚合酶鏈反應(PCR)的模板，利用通用引物擴增細菌16S rDNA，其中正向引物5’端使用6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標記；3)PCR產物純化后，利用限制性內切酶消化；4)DNA測序儀檢測帶有熒光標記的末端限制性片段，得到不同發酵時間酒醅中微生物群落T-RFLP圖譜。本發明是不依賴于傳統方法的分子生物學技術，具有分辨率高、方便、準確的特點，能夠快速反映白酒發酵過程中微生物群落動態變化規律，為揭示釀造過程微生物群落多樣性和定性定量分析提供了技術依據。
文檔編號C12Q1/04GK102242206SQ201110177719
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者孟鎮, 熊正河, 鐘其頂 申請人:中國食品發酵工業研究院