專利名稱：一株重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶c的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和微生物發酵技術領域，具體涉及一株重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法。
背景技術：
磷脂酶C (PLC)，又可稱為可定向分解磷脂生成甘油二酯和磷酸單酯，細菌來源的磷脂酶C根據底物特異性的不同主要分為磷脂酰特異性磷脂酶C (PC-PLC)和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C (PI-PLC)0 PLC水解產物甘油二酯是一種生理活性物質，在細胞信號傳導途徑上起著第二信使的作用，能激活蛋白激酶C (PKC)而引起細胞增殖、分化、收縮、分泌和代謝等功能變化，此外還具有明顯的抗血小板粘附、聚集等功能，因此又被稱作溶血性磷脂 酶C。溶血性PLC對新型抗血小板藥物、心腦血管疾病類藥物的開發具有一定的潛在價值，對抗靜脈血栓及高血壓醫療方面的研究意義重大。隨著對PLC研究的不斷深入及工業發展的需求，PLC的應用價值已經逐漸從藥品生產擴展至油脂精煉、磷脂改性、食品加工等領域。例如在油脂精煉中，利用PLA和PLC混合物進行酶法脫膠，可完全除去磷脂，比水、酸或苛性堿脫膠具有更高的油產率；食品工業中PLC可用來改善在面包在烤制時其表面產生的老化現象，緩和梨皮狀表皮。近年來，隨著PLC在食品、醫藥、飼料等領域的廣泛應用，國內外學者對其進行了大量的研究。國外對PLC的研究一直處于領先水平，例如1982年Vasil等人構建了一株 P. aeruginosaPA02003 (pVB81) -CT，其所產溶血性 PLC 的酶活達到了 442. 8U/ml(Vasil ML, Berka MR, Gray GL, Nakai H. Cloning of aphosphate-regulated hemolysingene (phospholipase C)from Pseudomonasaeruginosa. Journal of Bacteriology,1982,152 :431-440. ) ；1990年Ostroff等人將構建的重組質粒pGEM2/PLC_H導入到E. coliBL21 (DE3)中，成功得到了一株產溶血性PLC的菌株，該菌株的PLC活性可達到166. 7U/ml (Ostroff RM, VasilAI, Vasil ML. Molecular comparison of a nonhemolytic and ahemolyticphospholipase C from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology,1990,172(10) :5915-5923.) ; 1997 年 Cota-Gomez 等人成功構建了 E. coli BL21 (DE3)pGEM-plcHR，該菌株可產溶血性PLC，其酶活達到24. IU/毫克(Cota-Gomez A, Vasil Al,Kadurugamuwa J,Beveridge TJ,Schweizer HP, Vasil ML. PlcRl and PlcR2are putativecalcium-binding proteins required for secretion of the hemolyticphospholipaseC of Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity, 1997,65 :2904-2913. X 國內對磷脂酶C的研究雖起步較晚，但也取得了一定成果，例如2005年陳濤等人對篩選到的產PLC菌株Bacillus cereus Shenzhen754_l進行三次紫外線和兩次Co60_ Y射線誘變處理，篩選出三株高PLC活性的誘變株，酶活分別達到14. 878、16. 450、16. 400U/ml (陳濤，王常高，劉曉輝，何東平.高產磷脂酶C菌株的誘變選育.天然產物研究與開發，2005，17 (6)712-716. ) ;2007年高林對Bacillus cereus Shenzhen 754-1進行培養條件的優化，將酶活提高至26U/mL (高林.磷脂酶C高產菌株的篩選、鑒定和培養條件的優化研究.安徽農業大學的碩士學位論文，2007. );2010年詹逸舒篩選到一株Bacillus cereus Z-13，用卵黃瓊脂杯碟法測定該菌株所產生的PLC的沉淀圈(乳白色沉淀圈)，其直徑可達30_，酶活達到23.31U/ml (詹逸舒.產磷脂酶C菌株的篩選及其酶學性質的研究.湖南農業大學的碩士學位論文，2010.)。與動植物來源的PLC相比，上述微生物來源的PLC具有更短的生產周期，但仍存在如下弊端如野生菌株分離純化耗資大，大多數具有潛在病原性，在食品安全性方面存在一定隱患；基因工程菌株其構建和產酶工藝較為復雜，產酶量還有待提高。因此，目前高純度的PLC商業化生產尚未實現。

發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的在于提供一株重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法。利用該菌株通過液體發酵來生產溶血性磷脂酶C，產酶量和酶活性高，安全性好，制酶工藝簡單，成本低。 本發明的技術方案如下一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET_plcH，保藏編號為 CCTCCNo. M 2012425。所述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-p IcH, CCTCC No. M 2012425由下述方法制得(I)以保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的基因組為模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ ID N0:1所示；(2)將步驟(I)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表達載體pET-28a ( + )上，得到重組載體；(3)將步驟(2)所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，構建得到重組大腸桿菌。本發明還提供了一種用上述重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH, CCTCCNo. M2012425制備溶血性磷脂酶C的方法，是以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備溶血性磷脂酶C。其具體步驟如下(I)種子培養將所述重組大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCC No.M2012425接種于種子培養基中，于30 37°C振蕩培養8 12h，搖床轉速150 200r/min ；(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比3 10%的接種量接種至發酵培養基，于30 37°C振蕩培養4 6h小時，搖床轉速150 200r/min ；再添加乳糖，于20 30°C振蕩誘導培養14 22h，搖床轉速150 200r/min ;最后添加甘氨酸，于相同條件下繼續振蕩誘導培養18 36h，發酵完畢，得到發酵液；(3)粗酶液的提取將步驟(2)所得發酵液離心；收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細胞沉淀并超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內粗酶液。其進一步的技術方案為步驟(I)所述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨9 Ilg,酵母粉4 6g,NaCl9 llg，其余成分為水。步驟(2)所述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨9 llg，酵母粉5 24g，甘油 0 5g，其余成分為 0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2)。
步驟(2)所述乳糖的添加量為每升所述發酵培養基0. I 5g。步驟(2)所述甘氨酸的添加量為每升所述發酵培養基0 3g。本發明所提供的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，已于2012年10月24日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC NO :M2012425，地址中國，武漢，武漢大學。該菌株以下簡稱重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-plcH CCTCC M 2012425。本發明有益的技術效果在于與現有產溶血性磷脂酶C的野生分離菌株以及基因工程菌株相比，本發明構建了一株目的基因來源于銅綠假單胞菌(P. aeruginosa),可高產溶血性磷脂酶C的基因工程重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH CCTCC M 2012425，利用該菌株通過液體發酵來生產溶血性磷脂酶C，產酶量高，其酶活性最高可達2130. 38U/ml，比原菌株(銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)，保藏編號CGMCCNo. I. 205)提高了約4. 3倍，且安全性好；該制酶方法生產工藝簡單、成本低、易于工藝放大，在油脂精煉、磷脂改性、醫療等領域具有一定的應用前
旦
o溶血性磷脂酶C酶活和溶血能力的測定方法如下(I)硼砂卵黃平板法以及哥倫比亞血瓊脂平板法定性測定酶活。將發酵液進行超聲破碎，取100 200 U L破碎后的上清液加入等距放置在硼砂卵黃或哥倫比亞血瓊脂平板上的牛津杯中，于37° C溫育12 24h，以生成的分解圈(透明圈或渾濁圈)和溶血圈的大小分別代表酶活和溶血能力的高低。(2)p-NPPC法定量測定酶活。P-NPPC是卵磷脂的一種底物結構類似物，PLC可水解p-NPPC生成對硝基苯酹,對硝基苯酹是一種黃色物質,在410nm處有最大吸收峰,利用分光光度法測定發酵液在410nm處的吸光值，可反映PLC水解p-NPPC產生對硝基苯酚的量，根據對硝基苯酚標準曲線可定量計算出相應酶活力大小；以IL反應液體系計，其組成如下lmmol ZnCl2、600g 山梨醇、IOmmol p-NPPC、其余成分為 0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2), ImL反應體系中加入100 u L的發酵液，于37° C反應30min ;酶活力單位定義如下在pH 7. 2，溫度為37° C的條件下，每分鐘水解p-NPPC產生Inmol對硝基苯酚所需的酶的量為I個酶活力單位(U)。上述測定方法中，所述硼砂卵黃培養基成分如下NaCl 6. 6g/L，硼酸10. 9g/L，硼砂I. 9g/，瓊脂15g/L，卵黃液20g/L，其余成分為水，pH7. 2 7. 4，于I X IO5Pa高壓滅菌20mino上述測定方法中，所述哥倫比亞血瓊脂培養基的制備方法如下將4. 4g哥倫比亞血瓊脂基礎(購自北京陸橋技術有限責任公司)加入到IOOml去離子水中，于IXlO5Pa高壓滅菌20min,冷卻至50° C,加入5 7mL無菌脫纖維綿羊血(購自廣州蕊特生物科技有限公司)，搖勻后傾注平板，即得。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的具體實施方式
做進一步的描述，以下實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中所使用實驗材料如下大腸桿菌感受態細胞E. coli JM109和E. coli BL21 (DE3)購自寶生物工程(大連)有限公司；銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為=CGMCC No. I. 205 ；pMD 18T-simple Vector、T4DNA連接酶和10 X T4連接酶Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司；pET-28a ( + )購自Novagen ;限制性內切酶Bam HI、Sac I以及共有Buffer購自Fermentas0實施例I溶血性磷脂酶C基因的克隆根據NCBI上提供的P. aeruginosaPAOl的plcH基因(NC 002516. 2)的序列設計引物，其中，上游 引物為5’ -CGGGATCCATGACCGAAAACTGGAAATTC~3/ (下劃線表示Bam HI酶切位點)，下游引物為5' -CGAGCTCTCAGGTCGCTGCGATGTC-3'(下劃線表示Sac I酶切位點)。以保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的基因組DNA為模板，運用PCR的方法克隆得到溶血性磷脂酶C基因，并與載體pMD18T-Simple連接構建克隆載體pMD-plcH，將該克隆載體轉化大腸桿菌感受態細胞E. coli JM109，挑選陽性克隆，測序驗證，其堿基序列如SEQ ID NO :1所示，結果表明溶血性磷脂酶C基因克隆成功。實施例2重組質粒pET-plcH的構建用Bam HI和Sac I對重組載體pMD-plcH和表達載體pET_28a ( + )進行雙酶切，酶切反應體系為 IOu L pET-28a ( + ) 8u L, Bam HI 和 Sac I 各 0. 5 y L、Bam HI 和 Sac I共用Buffer IuL0回收目的基因和載體DNA，并用T4DNA連接酶進行連接，連接反應體系IOyL:目的基因 5iiL、載體 DNA 3 ii L、10X T4 連接酶 Buffer I y L、T4DNA 連接酶 I y L，于16°C 反應 12h。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞E. coli JM109，轉化方法如下(I)取 E. coli JM109 100 ii L 置于無菌 I. 5ml EP 管中；(2)加入上述連接產物并輕輕混勻；(3)將上述EP管置于42°C金屬浴，精確計時90s，勿搖動EP管；(4)轉移EP管于冰浴中，冷卻2min ；(5)每管加入無菌LB培養基800ii L，置于37°C培養箱復蘇Ih ；(6)以8000r/min的轉速離心2min，吸去800 u L上清培養基，用移液槍輕輕吹吸剩余培養基和細胞，并轉移至含終濃度100 u g/ml卡那霉素的LB固體平板，涂勻并于37°C培養箱培養16 24h ；(7)挑取陽性克隆，并經Bam HI和Sac I雙酶切驗證。實施例3 重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /PET-pIcHCCTCC M 2012425 的構建將構建好的重組質粒pET-plcH轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，轉化方法如下(I)取 E. coli BL21 (DE3) 100 ii L 置于無菌 I. 5ml 的 EP 管中；(2)加入上述重組質粒pET-plcH并輕輕混勻；(3)將上述EP管置于42°C金屬浴，精確計時90s，勿搖動EP管；(4)轉移EP管于冰浴中，冷卻2min ；(5)每管加入無菌LB培養基800 iiL，置于37°C培養箱復蘇Ih ；(6)以8000r/min的轉速離心2min，吸去800 u L上清培養基，用移液槍輕輕吹吸剩余培養基和細胞，并轉移至終濃度100 u g/ml卡那霉素的LB固體平板，涂勻并于37°C培養箱培養16 24小時；(7)挑取轉化子，酶切驗證重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET_plcH構建成功，與等體積的體積分數為30%的甘油混勻，于-70°C保藏。用重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH CCTCC M 2012425制備溶血性磷脂酶C實施例4(I)種子培養取50 ii L上述保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接種于種子培養基中，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養10h，搖床轉速150r/min ;上述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨IOg,酵母粉5g,NaCl IOg,其余成分為水，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比5%的接種量接種至發酵培養基，發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于 37°C振蕩培養4h小時，搖床轉速200r/min ;添加乳糖至終濃度為0. lg/L，在回旋式搖床上于25°C振蕩誘導培養14h，搖床轉速為150r/min ;發酵完畢，得到發酵液；上述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨10g，酵母粉5g，其余成分為0. 25mol/L Tris-HCl (pH7.2)，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(3)粗酶液的提取將步驟(2)所得發酵液于4°C離心lOmin，轉速8000r/min ;收集菌體細胞沉淀，用25mmol/L Tris-HCl (pH7. 2)重懸菌體，置于超聲破碎儀中超聲破碎lOmin，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內粗酶液。利用p-NPPC法定量測得胞內粗酶液的酶活達到573. 201U/ml,比保藏編號為CGMCC No. I. 205 的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)提高了約 15% 實施例5(I)種子培養取50 ii L上述保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接種于種子培養基中，在回旋式搖床上于30°C振蕩培養8h，搖床轉速200r/min ;上述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨9g,酵母粉4g, NaCl 9g,其余成分為水,于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比10%的接種量接種至發酵培養基，發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于30°C振蕩培養6h小時，搖床轉速150r/min ;添加乳糖至終濃度為lg/L，在回旋式搖床上于20°C振蕩誘導培養22h，搖床轉速為220r/min ;發酵完畢，得到發酵液；上述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨9g，酵母粉24g，其余成分為0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2)，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。( 3 )粗酶液的提取同實施例4利用p-NPPC法定量測得胞內粗酶液的酶活達到722. 89U/ml,比保藏編號為CGMCCNo. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)提高了約40*%。實施例6(I)種子培養取50 ii L上述保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接種于種子培養基中，在回旋式搖床上于35°C振蕩培養12h，搖床轉速180r/min ;上述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨llg，酵母粉6g,NaCl llg，其余成分為水，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比5%的接種量接種至發酵培養基，發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于35°C振蕩培養5h小時，搖床轉速180r/min ;添加乳糖至終濃度為0. lg/L，在回旋式搖床上于30°C振蕩誘導培養18h，搖床轉速為180r/min ;再添加甘氨酸至終濃度為lg/L，于相同條件下繼續振蕩誘導培養18h ;發酵完畢，得到發酵液；上述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨Hg，酵母粉14g，甘油lg，其余成分為0. 25mol/L Tris_HCl(pH7. 2)，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(3)粗酶液的提取將步驟(2)所得發酵液于4°C離心lOmin，轉速8000r/min，收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細胞沉淀，用25mmol/L Tris-HCl (pH7. 2)重懸菌體，置于超聲破碎儀中超聲破碎lOmin，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內粗酶液；利用p-NPPC法定量測得胞內和胞外粗酶液的總酶活達到959. 14U/ml,比保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)提高了約I. 9倍。實施例7(I)種子培養取50 ii L上述保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接種于種子培養基中，在回旋式搖床上于32°C振蕩培養9h，搖床轉速150r/min ;上述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨IOg,酵母粉4g, NaCl 9g,其余成分為水，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比10%的接種量接種至發酵培養基，發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于32°C振蕩培養4h小時，搖床轉速150r/min ;添加乳糖至終濃度為0. lg/L，在回旋式搖床上于22°C振蕩誘導培養16h，搖床轉速為150r/min ；，再添加甘氨酸至終濃度為2. 5g/L，于相同條件下繼續振蕩誘導培養28h ;發酵完畢，得到發酵液；上述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨llg，酵母粉14g，甘油2g，其余成分為0. 25mol/L Tris-HCl(pH7. 2)，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(3)粗酶液的提取同實施例6利用p-NPPC法定量測得胞內和胞外粗酶液的總酶活達到1130. 28U/ml,比保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)提高了約2. 2倍。實施例8(I)種子培養取50 ii L上述保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接種于種子培養基中，在回旋式搖床上于30°C振蕩培養llh，搖床轉速180r/min ;上述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨9g,酵母粉5g, NaCl IOg,其余成分為水，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比10%的接種量接種至發酵培養基，發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于30°C振蕩培養6h小時，搖床轉速180r/min ;添加乳糖至終濃度為5g/L，在回旋式搖床上于28°C振蕩誘導培養20h，搖床轉速為180r/min ;發酵完畢，得到發酵液；上述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨9g，酵母粉17g，甘油3g，其余成分為0. 25mol/L Tris-HCl(pH7. 2),于 IX IO5Pa 高壓下滅菌 20min。(3)粗酶液的提取同實施例4利用p-NPPC法定量測得胞內粗酶液的酶活達到1422. 37U/ml,比保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)提高了約2. 8倍。
實施例9(I)種子培養取50 ii L上述保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接種于種子培養基中，在回旋式搖床上于35°C振蕩培養8h，搖床轉速200r/min ;上述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨llg，酵母粉6g,NaCl llg，其余成分為水，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比10%的接種量接種至發酵培養基，發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于35°C振蕩培養5h小時，搖床轉速200r/min ;添加乳糖至終濃度為2. 5g/L，在回旋式搖床上于20°C振蕩誘導培養14h，搖床轉速為200r/min ;發酵完畢，得到發酵液；上述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨llg，酵母粉20g，甘油4g，其余成分為0. 25mol/L Tris-HCl(pH7. 2),于 IX IO5Pa 高壓下滅菌 20min。
( 3 )粗酶液的提取同實施例4利用p-NPPC法定量測得胞內粗酶液的酶活達到1208. 42U/ml，比保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)提高了約2. 4倍。實施例10(I)種子培養取50 ii L上述保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接種于種子培養基中，在回旋式搖床上于32°C振蕩培養10h，搖床轉速150r/min ;上述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨9g,酵母粉4g,NaCl 9g,其余成分為水,于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比10%的接種量接種至發酵培養基，發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于34°C振蕩培養4h小時，搖床轉速150r/min ;添加乳糖至終濃度為5g/L，在回旋式搖床上于25°C振蕩誘導培養18h，搖床轉速為150r/min ;再添加甘氨酸至終濃度為3g/L，于相同條件下繼續振蕩誘導培養28h ;發酵完畢，得到發酵液；上述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨9g，酵母粉5g，甘油5g，其余成分為0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2)，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。( 3 )粗酶液的提取同實施例6利用p-NPPC法定量測得胞內和胞外粗酶液的總酶活達到2130. 38U/ml,比保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)提高了約4. 3倍。實施例11(I)種子培養取50 ii L上述保藏的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M 2012425接種于種子培養基中，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養12h，搖床轉速200r/min ;上述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨llg，酵母粉6g,NaCl llg，其余成分為水，于I X IO5Pa高壓下滅菌20min。(2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比10%的接種量接種至發酵培養基，發酵培養基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養6h小時，搖床轉速200r/min ;添加乳糖至終濃度為5g/L，在回旋式搖床上于30°C振蕩誘導培養22h，搖床轉速為200r/min ;再添加甘氨酸至終濃度為2g/L，于相同條件下繼續振蕩誘導培養36h ;發酵完畢，得到發酵液；上述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨 llg，酵母粉 20g，甘油 5g，其余成分為 0. 25mol/L Tris-HCl (pH7. 2)，于 I X IO5Pa 高壓下滅菌20min。( 3 )粗酶液的提取同實施例6利用p-NPPC法定量測得胞內和胞外粗酶液的總酶活達到1756. 61U/ml,比保藏編號為CGMCC No. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)提高了約3. 5。綜上所述，實施例10所述制酶方法具·有最高的產酶量，為最佳實施例。
權利要求
1.一株重組大腸桿菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/pET-plcH，保藏編號為 CCTCCNo. M 2012425。
2.根據權利要求I所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-pIcH, CCTCC No. M2012425，其特征在于由下述方法制得 (1)以保藏編號為CGMCCNo. I. 205的銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)的基因組為模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ ID NO :I所示； (2)將步驟(I)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表達載體pET-28a( + )上，得到重組載體； (3)將步驟(2)所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，構建得到重組大腸桿菌。
3.用權利要求I 2任一項所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCCNo. M2012425制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備溶血性磷脂酶C。
4.根據權利要求3所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于具體步驟如下 (1)種子培養將所述重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCC No. M2012425接種于種子培養基中，于30 37°C振蕩培養8 12h，搖床轉速150 200r/min ； (2)液體發酵培養將經過步驟(I)培養所得活化種子液按體積百分比3 10%的接種量接種至發酵培養基，于30 37°C振蕩培養4 6h小時，搖床轉速150 200r/min ;再添加乳糖，于20 30°C振蕩誘導培養14 22h，搖床轉速150 200r/min ;最后添加甘氨酸，于相同條件下繼續振蕩誘導培養18 36h，發酵完畢，得到發酵液； (3)粗酶液的提取將步驟(2)所得發酵液離心；收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細胞沉淀并超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內粗酶液。
5.根據權利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步驟(I)所述種子培養基成分按克/升計為蛋白胨9 Ilg,酵母粉4 6g, NaCl 9 llg，其余成分為水。
6.根據權利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步驟(2)所述發酵培養基成分按克/升計為蛋白胨9 Ilg,酵母粉5 24g,甘油O 5g,其余成分為O. 25mol/L Tris-HCl (ρΗ7· 2)。
7.根據權利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步驟(2)所述乳糖的添加量為每升所述發酵培養基O. I 5g。
8.根據權利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步驟(2)所述甘氨酸的添加量為每升所述發酵培養基O 3g。
全文摘要
本發明提供一種重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法。用目的基因來源于銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-plcH，CCTCC No.M 2012425作為發酵菌株進行液體發酵來制備溶血性磷脂酶C，其制備方法包括種子培養、液體發酵培養以及粗酶液的提取。利用本發明菌株通過液體發酵來生產溶血性磷脂酶C，產酶量和酶活性高，安全性好，制酶工藝簡單，成本低，易于工藝放大，在油脂精煉、磷脂改性、醫療等領域具有一定的應用前景。
文檔編號C12N15/55GK102978146SQ20121048063
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月23日 優先權日2012年11月23日
發明者張梁, 石貴陽, 趙金星, 丁重陽, 顧正華 申請人:江南大學