水稻的分子標記方法
【專利摘要】水稻是最主要的糧食作物之一，也是重要的單字葉模式植物。基于栽培稻兩個亞種秈稻-粳稻的起源方式、分化過程、形成機制、遺傳多樣性分析以及秈稻-粳稻滲入系的鑒定等方面的研究一直是國內外學者關注的科學問題，對于水稻的遺傳育種中優良組合的選配、秈稻-粳稻雜種優勢的利用等實際問題也具有重要的利用價值和研究意義。開發基于秈稻-粳稻差異的分子標記是解決這些科學問題的有力工具之一。
【專利說明】水稻的分子標記方法
【技術領域】
[0001]水稻的分子標記方法屬于分子生物學領域。
【背景技術】
[0002]水稻是世界上重要的糧食作物，世界半數以上的人口以此為生。我國是秈稻和雜交稻的種植大國，水稻與小麥、玉米等禾本科作物在基因排列上具有同線性，目前已成為遺傳學和基因組研究的模式植物，因此進行水稻分子標記方法的研究，對提升我國農作物育種水平和培育新品種具有重要意義，并將幫助全球解決食物問題。
[0003]水稻不僅是最主要的糧食作物之一，而且還是重要的模式植物之一，其相關的遺傳、發育、進化及其育種等研究一直備受科學家重視，研究內容涉及到水稻的基礎及其應用研究的各個方面，基于DNA多態性的分子標記因其具有的獨特優越性而成為解決這些科學問題的有力工具之一。
[0004] 其優越性體現在:①表現穩定，多態性直接以DNA形式表現，無組織器官、發育時期特異性，不受環境條件、基因互作影響數量多，理論上遍及整個基因組；③多態性高，自然界存在許多等位變異，無需專門人為創造特殊遺傳材料，這為大量重要性狀基因緊密連鎖的標記篩選創造了條件對目標性狀表達無不良影響，與不良性狀無必然連鎖部分標記遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體與雜合體成本低，一般實驗室均可進行。對于特定探針或引物可引進或根據發表的特定序列自行合成。基于這些特點，分子標記現已被廣泛用于水稻有關功能基因標記、基因克隆、遺傳圖譜和物理圖譜的繪制、農藝性狀的分子標記輔助選擇、生物進化、遺傳多樣性研究等許多方面研究。
[0005]利用分子標記技術分析生物個體之間DNA序列差別并用于作圖的研究始于1980年。經過十幾年的發展，現在的DNA標記技術已有十多種，

【發明內容】

[0006]水稻是最主要的糧食作物之一，也是重要的單字葉模式植物。基于栽培稻兩個亞種秈稻-粳稻的起源方式、分化過程、形成機制、遺傳多樣性分析以及秈稻-粳稻滲入系的鑒定等方面的研究一直是國內外學者關注的科學問題，對于水稻的遺傳育種中優良組合的選配、秈稻-粳稻雜種優勢的利用等實際問題也具有重要的利用價值和研究意義。開發基于秈稻-粳稻差異的分子標記是解決這些科學問題的有力工具之一。
[0007]1、基于雜交的分子標記
典型代表是DNA限制性片段長度多態性(restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP),該技術是基于Southern雜交的分子標記的方法,是第一代分子標記。其基本原理是將不同個體基因組DNA用限制性內切酶酶切后，與用放射性同位素標記或非同位素標記的DNA分子探針(RFLP標記)進行分子雜交，通過放射性自顯影等技術來顯示酶切片段的大小，從而檢測不同遺傳位點的等位變異(多態性)。RFLP標記呈共顯性，標記準確，不影響表型，數目也較多。但其需要的DNA量較大，分析程序復雜，技術難度大，需要同位素標記探針費時，成本較高。
[0008]2、基于PCR的分子標記
常見的包括RAPD (Random amplified polymorphic DNA),AFLP (Amplified fragmentlength polymorphism), SSR (simple sequence repeats,又稱 microsatellite)、SCAR(sequence-characterized amplified region)、STS(sequence-tagged site)、CAPS(cleaved amplified polymorphiic sequence)等。具體表現為:
(I)隨機擴增片段長度多態性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA)
以隨機引物進行PCR擴增的分子標記。隨機擴增多態性DNA (Random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD),是由Williams和Welsh同時于1990年發展起來的一項技術。該技術用短的(通常為10堿基)隨機序列DNA作為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增而產生多態性。與其它技術相比，RAPD技術具有一些突出優點:①操作簡便，實驗周期短，能在較短時間內篩選大量樣品不必事先了解目的基因和片段序列；③所需樣品量極少，一次擴增僅需20-100 ng的模板DNA ;④引物具普遍適用性,商品化引物可應用于不同生物的研究；⑤適應于自動化操作和分析。由于具有以上優點，RAro標記已被廣泛用于目的基因標記與定位、研究近緣種屬間的遺傳進化關系、構建遺傳圖譜等研究中。但是RAPD技術存在兩個缺點，一是多數位點的標記表現顯性，不能提供完整的信息，另一方面是穩定性及重復性差。RAPD作為一種初步篩選的方法，一旦發現所需要的DNA擴增產物，再用特異序列擴增的方法將RAPD標記轉化為SCAR標記。
[0009](2)限制性酶切與PCR擴增相結合產生的分子標記。AFLP (amplified fragmentlength polymorphism)即擴增片段長度多態性,是一種選擇性地擴增限制性片段的方法，該法先設計針對某種限制性內切酶的通用接頭以及可與接頭序列和限制性酶切位點的序列配對的專用引物，用上述內切酶消化基因組DNA，將通用接頭與限制性片段兩端連接，再用專用引物擴增，最后電泳顯示結果。顯然這種技術兼具RFLP和RAH)兩種方法的優點，其接頭和引物適用于不同的生物類型，而且AFLP能提供比RFLP和RATO更多的特定基因的多態性信息。AFLP標記的多態性強，利用放射性標記在變性的聚丙烯酞胺凝膠上可檢測到100-150個擴增產物，非常適合繪制品種的DNA指紋圖譜及進行分類研究。
[0010](3)特異引物PCR擴增的分子標記。微衛星(microsatellites )或簡單序列重復(simple sequence repeats, SSRs)又稱微衛星 DNA (Microsatellite DNA)、短串聯重復序列(Short seqence repeats, STR),是由少數核甘酸(一般1-6個bp)為重復單位簇集而成的串聯重復序列，總長度為幾十到幾百個bp，隨機分布在整個水稻基因組的不同位置上。SSR標記是以PCR為基礎的分子標記，具有操作簡單、多態性高、穩定性強、共顯性等特點。尤其是隨著國際水稻全基因組測序計劃的完成，該標記又獲得了快速的發展。2002年，McCouch等開發出2240對新的水稻SSR分子標記。2005年，國際水稻基因組測序計劃研究認為，水稻基因組總共含有18828個SSR位點。該標記被廣泛應用在水稻的數量性狀位點(QTL )的定位、基因圖位克隆和比較基因組學及分子標記輔助選擇育種等方面的研究，是目前應用在水稻上最多的一類標記之一。
[0011](4)特異引物PCR擴增與限制性酶切相結合產生的分子標記。CAPS( cleavedamplified polymorphic sequences, CAPS)標記，即酶切擴增多態性序列，是特異引物PCR與限制性酶切相結合而產生的一種DNA標記。其基本原理是根據特定的DNA序列去設計特異性的PCR引物，然后應用這些引物進行PCR擴增；接著用專一性的限制性內切酶對擴增產物進行酶切，最后通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態性。dCAPS( derivedcleaved amplified polymorphic sequences, dCAPS)是Neff 等在CAPS 基礎上發展的，是在CAPS標記的基礎上通過在擴增引物中引入錯配堿基而引入新的限制性內切酶作用位點，經過酶切電泳后產生和CAPS標記類似的多態性。CAPS標記可以由SCAR、STS、EST、SNP等多種標記延伸而來，并可以應用 Blast Digester、SNP2CAPS、dCAPS Finder 2.0 (http:1l helix, wustl.edu /dcaps /dcaps.html)等多種軟件進行開發。目前,CAPS標記已被應用在水稻基因定位與克隆、功能標記的發展、分子標記輔助選擇等方面。該標記具共顯性遺傳，穩定性高，特異性強等優點，但是檢測技術相對復雜，即先對擴增產物進行酶切后再行多態性檢測。
[0012]3、基于DNA序列和芯片的分子標記
主要包括表達序列標記(expressed sequence tags, EST),多樣性序列芯片技術(Diversity A rrays Technology, DArT),單核苷酸多態序列(single nucleotidepolymorphism, SNP),插入缺失長度多態性(insertion deletion length polymorphism,InDel)等。
[0013](I)EST標記。EST是長約300_400bp的基因表達序列片段。EST技術是從來源于不同組織和器官的cDNA文庫中大規模隨機挑選cDNA克隆，對其5’或3’端進行測序，所獲長約300-400bp的基因表達序列。EST序列的長度足以包含其所代表基因的必要信息，因此可以用EST特異性的標記基因。該序列與基因數據庫中已知序列進行比較，從而獲得對生物體生長、發育、代謝、繁殖、衰落死亡等一系列生理生化過程認識的技術，它是以對DNA序列進行測序為核心的新型分子標記的代表之一。在全基因組測序尚未完成時，EST在鑒定基因、發現新基因、基因圖譜的構建、利用EST進行大規模分析基因表達水平等方面起著重要的作用。EST的數量截止到2010年12月13日，公共數據庫NCBI中釋放不同物種的EST數量已經達到52，858，766條，其中水稻的EST數量有25，019，080條。
[0014]EST途徑的不足之處在于通過隨機測序有時難以獲得低豐度表達和那些在特殊環境條件脅迫下誘導表達的基因。要彌補這些不足，必須開展全基因組測序。通過分析基因組序列，獲得基因結構的完整/[目息，如基因在染色體上的排列順序，基因間的間隔結構，啟動子的結構以及內含子的分布等。
[0015](2) DArT標記。DArT標記是于2001年發明的一種新型分子標記技術[17]，它是依賴與芯片雜交來辨別不同基因組之間多態性的方法。DArT標記的特點是具有高通量低成本，一個陣列可同時檢測分布在基因組中的幾百個多態性位點；多態性DArT標記的發現和檢測是平行進行，新的標記發現和標記評價是在同一芯片上進行，無需發展進一步的評價體系；在標記的發現和檢測中不需要預先知道DNA序列信息，這就使得該法可應用于DNA序列信息有或無的所有的物種，對于親緣關系稀少的孤立種質材料更具有適用性；基因組變異可包括特定區域的栽培品種，也可覆蓋該種內包括野生親緣種的遺傳變異，由DArT所揭示的多樣性可不斷地在以往的基礎上進行擴展，因此使用者可根據要求來確定DArT遺傳分析的范圍；該技術重復性穩定，實驗可靠，受染色體倍數性和基因組大小的影響很小；DArT標記具有顯性和共顯性的特點，可克隆進行序列分析而發展為新的標記等等。
[0016](3) SNP分子標記。SNP被稱為第三代DNA遺傳標記。它是指由基因組水平上單堿基的轉換、顛換，以及單堿基的插入或缺失等引起的DNA序列多態性。其廣泛出現在單拷貝DNA序列中，在大多數基因組中存在較高的頻率，在DNA的轉錄區和非轉錄區都能找到SNP，并且一些SNP標記是表型變異的直接原因。SNP數量豐富，遺傳穩定性好，尤其是建立在DNA芯片技術上的大規模自動化檢測，使其具有更加廣泛的應用前景。2002年水稻秈、粳兩個亞種的基因組序列草圖繪制完成，這為SNP的研究提供了極大的便利。Shen等利用生物信息學方法，通過比較水稻品種日本晴和93-11的全基因組序列的差異，構建了日本晴和93-11全基因組DNA序列多態性數據庫，該數據庫包含1703176個SNP和479406個InDel片段，平均每286個堿基就有一個SNP，每953個堿基就有一個InDel。
[0017]總的來說，目前SNP的研究重點還在于SNPs的發現，雖然在秈粳稻基因組序列中存在大量的SNPs，但這些SNPs只是基于代表兩個亞種的兩個具體的基因型獲得的，缺乏廣泛的代表性，這樣的SNP頻率常常會被高估。Jin等在亞種內品種間SNPs數量可能比數據庫中的SNPs更 加少得多，在實際遺傳育種中，我們可能只是針對個別目標性狀的改良，利用的材料常常是親緣關系很近的育種材料，SNP頻率就會更加的低，發現與目標性狀緊密連鎖的SNPs的可能性就更小。因此在實際應用中要精確地評價水稻中SNP的頻率，就要增加實驗材料的基因型數量，以獲取更多的DNA序列的數據作綜合比較。
[0018]目前制約SNPs應用的另一個因素是SNP檢測技術還有待完善，雖然已經實現了檢測技術的高度自動化和高效率，但實驗成本高昂，大大限制了 SNP標記技術的廣泛應用。盡管SNP標記可以轉化為PCR或CAPS標記，但其工作量比其他分子標記未能減少，不能完全發揮SNP標記技術的優越性。因此我們還需要繼續提高SNP檢測技術的自動化程度和檢測效率，降低檢測成本，同時大量發掘與水稻重要經濟性狀或生理性狀相關聯的SNPs，使SNPs在水稻遺傳育種中發揮巨大作用。
[0019](4) Indel標記。Indel標記即插入缺失長度多態性。插入/缺失,指的是兩種親本在全基因組中的差異，相對另一個親本而言，其中一個親本的基因組中有一定數量的核苷酸插入，根據基因組中插入/缺失位點，設計一些擴增這些插入/缺失位點的PCR引物，由此產生PCR產物長度大小的差異即是InDel標記。同SNP標記一樣，InDel標記也是一類基于水稻基因組序列基礎上的新型分子標記。隨著大規模測序技術的發展以及日本晴、93-11等水稻亞種與廣東矮4號等品種基因組序列的完成，大大地促進了水稻InDel標記的發展與應用。
[0020]與SSR標記相比，InDel標記具有在基因組中分布密度高、擴增帶型少、分離效果好、結果穩定等優點；較SNP標記而言，InDel標記具有檢測技術簡單、穩定性高、經濟而實用等優點。跟其他分子標記一樣，InDel標記可被用于水稻相關基因的精細定位與作圖、基因克隆、分子標記輔助選擇育種等方面外，作為從水稻兩個亞種基因組序列開發的標記還有以下幾個應用優勢:水稻秈稻-粳稻的鑒定與品種的合理布局；水稻秈-粳遺傳分化與雜種優勢分子機制研究；育種群體結構與秈稻-粳稻滲入系的鑒定分析。
【權利要求】
1.與SSR標記相比，InDel標記具有在基因組中分布密度高、擴增帶型少、分離效果好、結果穩定等優點；較SNP標記而言，InDel標記具有檢測技術簡單、穩定性高、經濟而實用等優點，跟其他分子標記一樣，InDel標記可被用于水稻相關基因的精細定位與作圖、基因克隆、分子標記輔助選擇育種`等。
【文檔編號】C12Q1/68GK103725760SQ201210382958
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月11日 優先權日:2012年10月11日
【發明者】不公告發明人 申請人:李靜