專利名稱：一種鑒定水稻和陸稻的方法
技術領域：
本發明涉及到一種鑒定栽培稻水稻或陸稻生態型的方法，尤其涉及到一種利用SSR標記快速、高效鑒定栽培稻地方品種水稻或陸稻生態型的分子方法。
背景技術：
栽培稻是世界上最重要的糧食作物之一，為全球一半以上的人口提供糧食。栽培稻生產消耗的水占全部農業用水的一半以上，我國有超過60%的水田會受到不同程度的干旱危害，因此干旱缺水成為威脅我國糧食安全的重要問題之一。在這樣嚴峻的形勢下，節水抗旱稻(water-saving and drought-resistant rice, W)R)的研發就成為了水稻育種工作中重要的方向，它可以為水稻生產的可持續發展和和諧生態社會的建設做出貢獻。節水抗旱稻的核心理念，就是將陸稻中普遍存在的抗旱性導入到高產的水稻中，培育出在常規條件下產量高、質量好且能在輕度或中度干旱脅迫條件下仍能保持較高產量和品質的栽培稻品種。因此收集、鑒定、保存和利用水稻、陸稻種質資源是發展和培育節水抗旱稻和維持我國糧食生產可持續發展的關鍵和保障。水稻(irrigatedrice)和陸稻(upland rice)是亞洲栽培稻中兩種最重要的生態型，分別占栽培稻種質面積的55%和12%。其中水稻適應于存在灌溉與蓄水設施的農業生境，具有優質、高產、抗病蟲害等特性；而陸稻往往種植于中低產田，并且缺乏灌溉和蓄水條件，因此有耐旱、節水、營養高效等特性。但是水稻和陸稻在表型上難以區分，以往的種質收集與保存工作中往往根據資源采集時的生境簡單分類，因此容易造成栽培稻種質資源水、陸生態 型的混淆，給種質資源的利用與研究造成了極大的困擾。因此無論在栽培稻種質資源的收集與利用，以及節水抗旱稻的研發中，都亟需一種可靠和快速的方法對栽培稻地方種的水稻和陸稻生態型進行鑒定。雖然水稻、陸稻沒有十分明顯的表型差異，但由于水稻和陸稻長期處于不同的農業生境和以及人類差異化的選擇作用下，水稻種質和陸稻種質必然會在遺傳上產生一定水平的分化，這種分化集中體現在與干旱脅迫相關的基因上。
發明內容
本發明的目的是提供一種可靠和快速的區分鑒定栽培稻中水稻和陸稻種質資源的方法，其采用的方法是利用位于干旱誘導的基因內部的簡單重復序列(SSR)分子標記快速區分水稻、陸稻的分子鑒定方法。具體是利用水稻和陸稻群體中多個產生顯著遺傳分化位點的DNA序列的特異性差異片斷，設計擴增引物組合及其衍生物，對偏水稻型等位基因型和陸稻型等位基因型分別進行賦值，并根據這些多位點鑒定值之和來確定水稻和陸稻生態型的方法。為了實現上述的技術目的，本發明提供一種鑒定栽培稻水稻或陸稻種質生態型方法，其包含的步驟有:從水稻植株的組織或器官提取DNA樣品，對DNA樣品進行聚合酶鏈(PCR)擴增，對PCR產物進行電泳檢測，利用分析軟件讀取PCR產物片段大小，確定PCR產物的基因型，對PCR基因型進行賦值，計算綜合鑒定值，根據綜合鑒定值的大小，確定水稻或陸稻的生態型。本發明的優先實施方案是，所述水稻植株的組織或器官包含有水稻的種子、幼苗、成株、莖、葉。本發明的優先實施方案是，所述的聚合酶鏈(PCR)擴增體系為三引物PCR體系。本發明的優先實施方案是，所述三引物PCR體系中每組引物包含三條序列，所述三條序列包括一對SSR特異性引物和一條M13通用引物。本發明的優先實施方案是，所述一條M13通用引物5’端熒光標記。本發明的優先實施方 案是，所述一對SSR特異性引物中退火溫度較高的一條引物5’端連接一段M13序列。本發明的優先實施方案是，所述M13序列為CACGACGTTGTAAAACGAC。本發明的優先實施方案是，所述基因型為5對長度為13_40bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列的
權利要求
1.一種鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，包括如下步驟:從水稻植株的組織或器官提取DNA樣品，對DNA樣品進行聚合酶鏈(PCR)擴增，對PCR產物進行電泳檢測，利用分析軟件讀取PCR產物片段大小，確定PCR產物的基因型，對PCR基因型進行賦值，計算綜合鑒定值，根據綜合鑒定值的大小，確定水稻或陸稻的生態型。
2.根據權利要求1所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述水稻植株的組織或器官包含有水稻的種子、幼苗、成株、莖、葉。
3.根據權利要求1所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述的聚合酶鏈(PCR)擴增體系為三引物PCR體系。
4.根據權利要求3所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述三引物PCR體系中每組引物包含三條序列，所述三條序列包括一對SSR特異性引物和一條M13通用引物。
5.根據權利要求4所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述一條M13通用引物5’端突光標記。
6.根據權利要求4所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述一對SSR特異性引物中退火溫度較高的一條引物5’端連接一段M13序列。
7.根據權利要求6所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述M13序列為CACGACGTTGTAAAACGAC。
8.根據權利要求3所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述的聚合酶鏈(PCR)擴增體系的反應條件(20uI體系)為 1)10 X Taq 緩沖液(含 25mM MgC12)2 U I 2)IOmM dNTP Mixture0.4u I 3)20 u M 引物 I0.1 4)20iiM 后引物 2 (含 M13 序列)0.04iil 5)20iiM熒光標記M13引物0.16iil 6)Taq DNA PolymeraseIUnit 7)DNA 模板20-30ng 8)ddH20(雙蒸水)補足至20 ill。
9.根據權利要求8所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述的聚合酶鏈(PCR)擴增體系的反應程序(20uI體系)為: 1)94°C預變性5分鐘； 2)94 °C變性40秒； 3)退火溫度=55-57.5°C，退火時間:30秒； 4)72 °C延伸40秒； 5)循環2)、3)、4)步驟，共34個循環6)72 °C延伸10分鐘。
10.根據權利要求1所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述電泳檢測為熒光毛細管電泳。
11.根據權利要求1所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述電泳檢測為聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
12.根據權利要求1所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述基因型為5對長度為13-40bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列的SSR引物，所述5對SSR引物遺傳信息如表I所示:
13.根據權利要求1或12所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，所述5個SSR 位點各不同基因型的水稻、陸稻鑒定值的信息如表2所示:
14.根據權利要求13所述的鑒定水稻和陸稻的方法，其特征在于，綜合所述鑒定值的大小，確定水稻或陸稻的生態型的依據如表3所示:
全文摘要
本發明屬于生物鑒別與種質資源利用領域，具體涉及一種快速、高效鑒定栽培稻地方種水稻和陸稻生態型的方法,本發明是利用5個在水稻、陸稻生態型間存在較大差異的水稻微衛星(SSR)位點，設計了一種快速、高效鑒定栽培稻水、陸生態型的分子方法。該方法包括樣品DNA的提取，三引物體系PCR擴增，電泳檢測擴增產物，根據大量實驗的結果對不同基因型進行賦值，綜合計算5個位點的綜合鑒定值并通過鑒定值的大小對栽培稻的水、陸生態型進行判斷。該方法準確率高，適用性廣，快速便捷，在栽培稻種質收集、鑒定、研究和利用方面有著廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK103146831SQ20131008700
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月19日 優先權日2013年3月19日
發明者夏輝, 陳亮, 楊華, 樓巧君, 羅利軍 申請人:上海市農業生物基因中心