專利名稱：側耳菌發酵生產截短側耳素的培養基及發酵方法
技術領域：
本發明屬于發酵技術領域，特別是涉及ー種側耳菌生產截短側耳素的培養基及發酵方法。
背景技術：
截短側耳素(Pl euromutilin)是由側耳菌ipieurotus mutilus)通過發酵產生的一類廣譜的ニ萜烯類抗生素，是截短側耳素類半合成衍生物的前體。截短側耳素類是一大類具有較好抗菌活性的抗生素家族，能夠有效抑制大部分革蘭氏陽性菌以及部分革蘭氏陰性菌。目前，國內大部分生產廠家側耳菌的種子培養基基礎原料是酵母粉、葡萄糖、糊精、磷酸ニ氫鉀、硫酸銨；發酵培養基基礎原料是豆油、葡萄糖、熱榨黃豆餅粉、酵母粉、磷酸ニ氫鉀、硫酸鎂、硝酸鈣、氯化鈉和硫酸鉄。以上述培養基基礎發酵生產截短側耳素所存在的問題是
I、截短側耳素發酵培養基采用豆油作為基礎碳源之一，因不同生產廠家提供的豆油質量不一致，導致高溫滅菌后容易出現豆油與固體顆粒結塊現象，產生較多泡沫，泡沫會影響發酵過程中的氧傳遞，導致菌體生長異常。同時，隨著高溫時間延長，豆油中所含有的部分亞油酸、油酸和亞麻酸分解為小分子化合物并進一歩氧化為有機酸，酸價增大，導致發酵液pH下降。pH變化影響發酵培養基中各種酶的活性、菌體對基質的利用速率和細胞結構，從而影響了菌種生長，減少初級、次級代謝產物的合成。另外，豆油中除含有脂肪外，還含有磷月旨，甾醇類物質以及少量蛋白質和麥胚酚等物質，易引起豆油酸敗。豆油在長期儲存中，油色會由淺逐漸變深，原因是油脂自動氧化，生成醛、酮、酸類有機物。所以豆油是不宜長期貯藏。2、發酵培養基中使用熱榨黃豆餅粉，由于生產エ藝的蒸炒溫度在130 140°C，因而導致其含油量和蛋白質含量明顯降低，低于冷榨豆餅粉。所以，發酵過程中，熱榨黃豆餅粉用量加大，最終導致生產成本大，發酵生產成本一般在150 250元/公斤。3、采用上述培養基發酵，由于豆油、熱榨黃豆餅等原輔料利用率低，導致菌渣產量低，影響截短側耳素后提取收率。4、采用上述培養基發酵，發酵效價單位低，其發酵單位僅為9000 11000u/ml。

發明內容
本發明目的就在于克服上述截短側耳素發酵單位低、生產成本高等技術缺陷，提供一種可替代熱榨黃豆餅粉、豆油，達到提高發酵單位，同時最大限度的降低原輔料來源受環境影響因素，保證其供應充足，實現截短側耳素穩定、高效地生產的側耳菌發酵生產截短側耳素的培養基。本發明的另ー目的是提供利用上述培養基生產截短側耳素的發酵方法。為實現上述目的所采取的技術方案為一種側耳菌發酵生產截短側耳素的培養基，包括ー級種子培養基、ニ級種子培養基和發酵培養基，其特征在于ー級種子培養基和ニ級種子培養基中含有冷榨黃豆餅粉和有機硅消泡劑；發酵種子培養基中含有冷榨黃豆餅粉、有機硅消泡劑和玉米油。上述一級種子培養基的組成為葡萄糖5 20g/L、冷榨黃豆餅粉20 50g/L、磷酸氫ニ鉀I 10g/L、硫酸鎂O. I O. 4g/L、硝酸鈣O. I O. 4g/L、氯化鈉O. I O. 2g/L、有機硅消泡劑O. 3 O. 9g/L。
上述ニ級種子培養基的組成為葡萄糖18 22g/L、冷榨黃豆餅粉10 15g/L、磷酸氫ニ鉀I 4g/L、硫酸鎂O. 2 O. 4g/L、硝酸鈣O. 2 O. 4g/L、氯化鈉O. I O. 2g/L、有機硅消泡劑O. 5 O. 9g/L。上述發酵培養基的組成為葡萄糖20 30g/L、冷榨黃豆餅粉15 20g/L、玉米漿15 20g/L、硫酸鎂O. 2 O. 4g/L、磷酸氫ニ鉀I 4g/L、硝酸鈣O. 5 lg/L、酵母粉2 5g/L、玉米油5 15ml/L、有機硅消泡劑O. 2 O. 5g/L。ー種利用上述培養基的發酵方法，其エ藝步驟包括
I) 一級種子培養首先將ー級種子培養基滅菌、冷卻，用無菌空氣保壓(壓カ控制在O. 01 O. 02MPa)。要求滅菌后的一級種子培養基pH控制在5 8 ;氨基氮含量控制在10 50% ;還原糖含量控制在I 5%。在火焰保護下，將已經培養好的側耳菌母瓶種子液接入一級種子罐進行培養，接種量控制在一級種子培養基體積的5 10%。培養條件為罐壓O. 02 O. 06MPa ;罐溫20 28°C;空氣流量0 15h :1 5m3/h ； 15h 移種5 10m3/h ;攬祥轉速100 120r/min ;培養時間40 60h。2) ニ級種子培養先將ニ級種子培養基滅菌，冷卻，用無菌空氣保壓(壓カ控制在O. 01 O. 02MPa)。要求滅菌后的ニ級種子培養基pH控制在5 8 ;氨基氮含量控制在10 50% ;還原糖含量控制在I 5%。然后將一級種子液全部移入ニ級種子罐進行培養。培養條件為罐壓O. 02 O. 06MPa ;罐溫20 28°C;空氣流量0 20h :5 IOm3/h ；20h 移種10 12m3A ;攪拌轉速150 160r/min ;培養時間30 60h。3)發酵培養先將發酵培養基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓(壓カ控制在O. 01 O. 02MPa)。要求滅菌后的發酵培養基pH控制在6 8 ;氨基氮控制在20 80% ;還原糖含量控制在I 5%。然后將ニ級種子液全部移入發酵罐進行培養。整個發酵過程中
a氨基氮控制發酵周期50 180h控制在5 10% ;發酵周期181h 發酵結束控制在I 5% οb發酵周期培養時間200 300h。c pH控制0 60h,pH自然,不受控制；81 180h, pH控制在6 8 ;181h 發酵結束，pH控制在6. 2 7. 8。d 空氣流量0 40h :10 20m3/h ；41 180h :20 40m3/h ；181h 發酵結束15 20m3/h。e壓カ控制罐壓O. 01 O. 05MPaof溫度控制發酵全程溫度控制在20 28°C。g無菌檢查發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌。h菌體濃度0 90h，菌體自然生長，濃度不受控制；91 180h，菌體濃度控制在50 60% ;181h 發酵結束，菌體濃度控制在30 40%。I攪拌轉速0 80h，攪拌轉速控制在80 100r/min ；81 200h，攪拌轉速控制在120 150r/min ；181h 發酵結束，攪拌轉速控制在，100 120r/min。4)在發酵過程中進行補料，
a補油補油選擇玉米油,采用流加法進行補料。發酵周期在50 180h過程中，當脂肪含量< 2%，采用留加的方式補入玉米油，脂肪含量控制在2 3% ;發酵周期181h 發酵結束過程中，脂肪含量< 1%，采用流加的方式補入玉米油，脂肪含量控制在I 2%。b補糖補糖選擇葡萄糖，濃度控制在29 30%，采用流加法進行補料。發酵周期在60 180h過程中，還原糖的含量控制在2 3%，當還原糖濃度< 2%，補入已滅菌的葡萄糖溶液。發酵周期181h 發酵結束過程中，還原糖的含量控制在I 2%，當還原糖濃度< 1%，補入已滅菌的葡萄糖溶液。 c補水發酵過程中，按照エ藝要求必須定時補入一定量的水，其目的是控制菌體濃度，有利于產物的生成。發酵周期91 180h過程中，菌體濃度> 60%，采用留加的方式補入已滅菌的自來水，控制菌體濃度在50 60% ;發酵周期181h 發酵結束，菌體濃度>40%，采用流加的方式補入已滅菌的自來水，控制菌體濃度在30 40%。d補酸或堿0 80h :pH處在發酵自然狀態；81 180h，pH控制在6 8 ;181h 發酵結束，PH 6.2 7.8。當pH檢測結果低于控制范圍的下限，加入10 20%、已滅菌的氫氧化鈉溶液進行調節；當PH檢測結果高于控制范圍的上限，加入30 40%、已滅菌的磷酸氫銨溶液調節PH，控制其在エ藝要求的范圍內。本發明通過優化截短側耳素發酵生產過程中的種子培養基和發酵培養基的成分配比，尤其是以主要是不飽和酸占85%、營養價值高、熱穩定性強，耐高溫，泡沫產生少的玉米油代替豆油，以在70 80°C冷榨溫度下生產出來的含油量和蛋白質含量明顯高于熱榨黃豆餅粉的冷榨黃豆餅粉代替熱榨黃豆餅粉，從而I)減少了原輔料的投料量，降低了發酵成本，其生產成本為100 150元/十億；2)提高了發酵效價，其發酵單位為16000 18000u/ml，遠遠超過現有技術中發酵單位9000 10000u/ml，達到國內外先進發酵水平；3)采用該發酵エ藝，發酵周期在10天左右，菌渣產量高，平均產量為400 500kg/m3，提取收率相對高；4)最大限度的降低原輔料來源的環境影響因素，保證原料的充足供應，實現截短側耳素穩定、高效地生產。
具體實施例方式下面用實例予以說明本發明，應該理解的是，實例是用于說明本發明而不是對本發明的限制。本發明的范圍與核心內容依據權利要求書加以確定。下述實施例的菌種選用側耳菌ipieurotus mutilus):生產使用的菌種來源為母瓶發酵液。母瓶發酵液質量pH5 7 ;菌體濃度10 30% ;鏡檢無雜菌；搖瓶發酵單位13000 14000u/ml。以下實施例中有機硅消泡劑選擇濰坊金水源化工有限公司生產的。實施例I
一級種子培養基配制過程在Im3 —級種子罐中加入葡萄糖5kg、冷榨黃豆餅粉20kg、磷酸氫ニ鉀1kg、硫酸鎂100g、硝酸鈣100g、氯化鈉100g、有機硅消泡劑300g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ，溫度120 122V ;滅菌時間31min，冷卻并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. OlMPa。取樣檢測，其pH為5. 4，氨基氮含量為18. 2%，還原糖含量為I. 3%，符合培養基滅菌要求，等待接種。ニ級種子培養基制備過程在IOm3 ニ級種子罐中加入葡萄糖180kg、冷榨黃豆餅粉100kg、磷酸氫ニ鉀10kg、硫酸鎂2kg、硝酸I丐2kg、氯化鈉1kg、有機娃消泡劑5kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ，溫度120 123°C;滅菌時間31min，冷卻并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. OlMPa。取樣檢測，其pH為5. 8，氨基氮含量為19. 1%，還原糖含量為1.7%，符合培養基滅菌要求，等待接種。發酵培養基制備過程在IOOm3發酵罐中加入葡萄糖2000kg、冷榨黃豆餅粉 1500kg、玉米衆1500kg、硫酸鎂20kg、磷酸氫ニ鉀100kg、硝酸I丐50kg、酵母粉200kg、玉米油500L、有機硅消泡劑20kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ;溫度122 123°C ;時間36min。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. OlMPa。取樣檢測，其pH為6. 2，氨基氮含量為22. 7%，還原糖含量為I. 5%，符合培養基滅菌要求，等待接種。一級種子培養過程控制將符合接種條件(鏡檢無雜菌，菌體濃度15. 4%，pH5. 9、搖瓶效價13584u/ml)的側耳菌母瓶發酵液在火焰保護下，由接種ロ接入以及種子培養罐，接種量控制在種子培養基體積的6. 5%,罐壓控制在O. 02MPa ;罐溫20 23°C ;空氣流量O 15h lm3/h ；15h 移種:5m3/h ;攪拌轉速100r/min。一級種子培養結束，pH6. 3 ;菌體濃度15. 9% ;鏡檢無雜菌；培養時間42h。ニ級種子培養過程控制符合移種條件的一級種子液由移種管道全部移入ニ級種子罐。罐壓控制在O. 02MPa ;罐溫20 23°C;空氣流量0 20h :5m3/h ；21h 移種:10m3/h ;攪拌轉速120r/min。ニ級種子培養結束，pH6. 6 ;菌體濃度24. 3% ;鏡檢無雜菌；培養時間31. 2h。發酵培養基過程控制將符合移種條件的ニ級種子液由移種管道全部移入發酵罐。罐壓控制在O. OlMPa ;發酵溫度控制在20 23°C ;攪拌轉速發酵開始 80h控制在80r/min ；81 200h控制在120r/min ；181h 發酵結束控制在100r/min。空氣流量0 40h控制在10m3/h ；41 180h控制在20m3/h ；181h 發酵結束控制在15m3/h。發酵過程中，.隔8小時取樣進行檢測，pH 81 180h控制在6 8 ；181h 發酵結束控制在6. 2 7. 8 ;氨基氮發酵周期50 180h控制在5 10% ;發酵周期181h 發酵結束控制在I 5% ;菌體濃度91 180h，菌體濃度控制在50 60% ;181h 發酵結束，菌體濃度控制在30 40%ο發酵過程中補玉米油954L ;補水834L、補糖4275kg。發酵結束，菌體濃度32%、氨基氮5. 3%、脂肪O. 03%、還原糖O. 10%,發酵效價為16065u/ml、發酵周期 268h。實施例2
一級種子培養基配制過程在Im3—級種子罐中加入葡萄糖12kg、冷榨黃豆餅粉35kg、磷酸氫ニ鉀5kgL、硫酸鎂250g、硝酸鈣250g、氯化鈉150g、有機硅消泡劑600g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ，溫度120 122°C ;滅菌時間30min，冷卻并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. 015MPa。取樣檢測，其pH為6. 3，氨基氮含量為28. 4%，還原糖含量為3. 4%，符合培養基滅菌要求，等待接種。
ニ級種子培養基制備過程在IOm3 ニ級種子罐中加入葡萄糖200kg、冷榨黃豆餅粉130kg、磷酸氫ニ鉀20kg、硫酸鎂3kg、硝酸鈣3kg、氯化鈉I. 5kg、有機硅消泡劑7kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ;溫度120 123°C ;滅菌時間32min,冷卻并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. 015MPa。取樣檢測，其pH為6. 6，氨基氮含量為32. 4%，還原糖含量為4. 3%，符合培養基滅菌要求，等待接種。發酵培養基制備過程在IOOm3發酵罐中加入葡萄糖2500kg、冷榨黃豆餅粉1800kg、玉米衆1800kg、硫酸鎂30kg、磷酸氫ニ鉀250kg、硝酸I丐75kg、酵母粉350kg、玉米油1000L、有機硅消泡劑350kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 15 O. 14MPa ；溫度122 123°C ;時間35min。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. 015MPa。取樣檢測，其PH為7. 0，氨基氮含量為38. 1%，還原糖含量為3. 6%，符合培養基滅菌要求，等待接種。 —級種子培養過程控制將符合接種條件(鏡檢無雜菌，菌體濃度16. 2%，pH6. I、搖瓶效價13712u/ml)的側耳菌母瓶發酵液在火焰保護下，由接種ロ接入以及種子培養罐，接種量控制在種子培養基體積的6. 2%,罐壓控制在O. 04MPa ;罐溫23 25°C ;空氣流量O 15h 3m3/h ；15h 移種7. 5m3/h ;攪拌轉速110r/min。一級種子培養結束，pH6. 9 ;菌體濃度23. 4% ;鏡檢無雜菌；培養時間49h。ニ級種子培養過程控制符合移種條件的一級種子液由移種管道全部移入ニ級種子罐。罐壓控制在O. 04MPa ;罐溫23 25 V ;空氣流量0 20h :7. 5m3/h ；21h 移種IlmVh ;攪拌轉速135r/min。ニ級種子培養結束，pH6. 8 ;菌體濃度28. 9% ;鏡檢無雜菌；培養時間43. 5h。發酵培養基過程控制將符合移種條件的ニ級種子液由移種管道全部移入發酵罐。罐壓控制在O. 03MPa ;發酵溫度控制在23 25°C ;攪拌轉速發酵開始 80h控制在90r/min ；81 200h控制在135r/min ；181h 發酵結束控制在110r/min。空氣流量0 40h控制在15m3/h ；41 180h控制在30m3/h ；181h 發酵結束控制在17. 5m3/h。發酵過程中，.隔8小時取樣進行檢測，pH 81 180h控制在6 8 ；181h 發酵結束控制在6. 2 7. 8 ;氨基氮發酵周期50 180h控制在5 10% ;發酵周期181h 發酵結束控制在I 5% ;菌體濃度91 180h，菌體濃度控制在50 60% ;181h 發酵結束，菌體濃度控制在30 40%ο發酵過程中補玉米油835L ;補水789L、補糖4086kg。發酵結束，菌體濃度43.2%、氨基氮6. 1%、脂肪1.4%、還原糖1.3%，發酵效價為17472u/ml、發酵周期 256h。實施例3
一級種子培養基配制過程在Im3 —級種子罐中加入葡萄糖20kg、冷榨黃豆餅粉50g、磷酸氫ニ鉀lOkgL、硫酸鎂400g、硝酸鈣400g、氯化鈉200g、有機硅消泡劑900g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ;溫度120 122°C ;滅菌時間30min，冷卻并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. 02MPa。取樣檢測，其pH為6. 5，氨基氮含量為41. 4%，還原糖含量為4. 6%，符合培養基滅菌要求，等待接種。ニ級種子培養基制備過程在IOm3 ニ級種子罐中加入葡萄糖220kg、冷榨黃豆餅粉150kg、磷酸氫ニ鉀40kg、硫酸鎂4kg、硝酸I丐4kg、氯化鈉2kg、有機娃消泡劑9kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ;溫度120 123°C;滅菌時間33min，冷卻并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. OlMPa0取樣檢測，其pH為6. 5，氨基氮含量為36. 7%，還原糖含量為4. 1%，符合培養基滅菌要求，等待接種。發酵培養基制備過程在IOOm3發酵罐中加入葡萄糖3000kg、冷榨黃豆餅粉2000kg、玉米衆2000kg、硫酸鎂40kg、磷酸氫ニ鉀400kg、硝酸I丐100kg、酵母粉500kg、玉米油1500L、有機硅消泡劑500kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10
O.14MPa ;溫度122 123°C ;時間34min。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. 02MPa。取樣檢測，其pH為6. 2，氨基氮含量為54. 3%，還原糖含量為4. 5%，符合培養基滅菌要求，等待接種。一級種子培養過程控制將符合接種條件(鏡檢無雜菌，菌體濃度15. 4%，pH6. 2、搖瓶效價13316u/ml)的側耳菌母瓶發酵液在火焰保護下，由接種ロ接入以及種子培養罐，接種量控制在種子培養基體積的6. 6%,罐壓控制在O. 06MPa ;罐溫25 28V ;空氣流量 O 15h 5m3/h ；15h 移種:10m3/h ;攪拌轉速120r/min。一級種子培養結束,pH6. 4 ;菌體濃度24. 7% ;鏡檢無雜菌；培養時間44h。ニ級種子培養過程控制符合移種條件的一級種子液由移種管道全部移入ニ級種子罐。罐壓控制在O. 06MPa ;罐溫25 28°C;空氣流量:0 20h :10m3/h ;21h 移種:12m3/h ;攪拌轉速150r/min。ニ級種子培養結束，pH6. 7 ;菌體濃度31. 8% ;鏡檢無雜菌；培養時間37. lh。發酵培養基過程控制將符合移種條件的ニ級種子液由移種管道全部移入發酵罐。罐壓控制在O. 05MPa ;發酵溫度控制在25 28°C ;攪拌轉速發酵開始 80h控制在100r/min ；81 200h控制在150r/min ；181h 發酵結束控制在120r/min。空氣流量0 40h控制在20m3/h ；41 180h控制在40m3/h ；181h 發酵結束控制在20m3/h。發酵過程中，.隔8小時取樣進行檢測，pH 81 180h控制在6 8 ；181h 發酵結束控制在6. 2 7. 8 ;氨基氮發酵周期50 180h控制在5 10% ;發酵周期181h 發酵結束控制在I 5% ;菌體濃度91 180h，菌體濃度控制在50 60% ;181h 發酵結束，菌體濃度控制在30 40%ο發酵過程中補玉米油911L ;補水1045L、補糖4194kg。發酵結束，菌體濃度51. 2%、氨基氮8. 1%、脂肪I. 2%、還原糖I. 4%，發酵效價為16128u/ml、發酵周期 268h。實施例4 對比實例以熱榨豆餅粉、豆油為原料，按照截短側耳素發酵エ藝生產截短側耳素。一級種子培養基配制過程在Im3 —級種子罐中加入葡萄糖13kg、熱榨黃豆餅粉35kg、磷酸氫ニ鉀5kgL、硫酸鎂250g、硝酸鈣250g、氯化鈉150g、有機硅消泡劑600g。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ，溫度120 122°C ;滅菌時間31min，冷卻并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. OlMPa。取樣檢測，其pH為6. 5，氨基氮含量為23. 1%，還原糖含量為1.7%，符合培養基滅菌要求，等待接種。ニ級種子培養基制備過程在IOm3 ニ級種子罐中加入葡萄糖200kg、熱榨黃豆餅粉130kg、磷酸氫ニ鉀20kg、硫酸鎂3kg、硝酸鈣3kg、氯化鈉I. 5kg、有機硅消泡劑7kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 10 O. 14MPa ;溫度120 123°C ;滅菌時間33min,冷卻并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. 015MPa。取樣檢測，其pH為6. 3，氨基氮含量為23. 5%，還原糖含量為2. 4%，符合培養基滅菌要求，等待接種。發酵培養基制備過程在IOOm3發酵罐中加入葡萄糖2500kg、熱榨黃豆餅粉1800kg、玉米衆1800kg、硫酸鎂30kg、磷酸氫ニ鉀250kg、硝酸I丐75kg、酵母粉350kg、豆油1000L、有機硅消泡劑350kg。完成配料后進行滅菌處理，滅菌條件壓カO. 15 O. 14MPa ；溫度122 123°C ;時間34min。冷卻，并用無菌空氣保壓，壓カ控制在O. 015MPa。取樣檢測，其PH為6. 7，氨基氮含量為27. 9%，還原糖含量為2. 0%，符合培養基滅菌要求，等待接種。一級種子培養過程控制將符合接種條件(鏡檢無雜菌，菌體濃度16. 7%，pH6. 3、搖瓶效價13587u/ml)的側耳菌母瓶發酵液在火焰保護下，由接種ロ接入以及種子培養罐，接種量控制在種子培養基體積的6. 3%,罐壓控制在O. 04MPa ;罐溫23 25°C ;空氣流量O 15h 3m3/h ；15h 移種-J. 5m3/h ;攪拌轉速110r/min。一級種子培養結束，pH6. 3 ;菌體濃度18. 2% ;鏡檢無雜菌；培養時間48h。ニ級種子培養過程控制符合移種條件的一級種子液由移種管道全部移入ニ級種 子罐。罐壓控制在O. 04MPa ;罐溫23 25 V ;空氣流量0 20h :7. 5m3/h ；21h 移種IlmVh ;攪拌轉速135r/min。ニ級種子培養結束，pH6. 8 ;菌體濃度28. 9% ;鏡檢無雜菌；培養時間43. 5h。發酵培養基過程控制將符合移種條件的ニ級種子液由移種管道全部移入發酵罐。罐壓控制在O. 03MPa ;發酵溫度控制在23 25°C ;攪拌轉速發酵開始 80h控制在90r/min ；81 200h控制在135r/min ；181h 發酵結束控制在110r/min。空氣流量0 40h控制在15m3/h ；41 180h控制在30m3/h ；181h 發酵結束控制在17. 5m3/h。發酵過程中，.隔8小時取樣進行檢測，pH 81 180h控制在6 8 ；181h 發酵結束控制在6. 2 7. 8 ;氨基氮發酵周期50 180h控制在5 10% ;發酵周期181h 發酵結束控制在I 5% ;菌體濃度91 180h，菌體濃度控制在50 60% ;181h 發酵結束，菌體濃度控制在30 40%ο發酵過程中補豆油1156L ;補水1245L、補糖4154kg。發酵結束，菌體濃度39. 2%、氨基氮4. 8%、脂肪I. 2%、還原糖I. 3%，發酵效價為13819u/ml、發酵周期 261h。
權利要求
1.一種側耳菌發酵生產截短側耳素的培養基，包括一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基，其特征在于一級種子培養基和二級種子培養基中含有冷榨黃豆餅粉和有機硅消泡劑；發酵種子培養基中含有冷榨黃豆餅粉、有機硅消泡劑和玉米油。
2.按照權利要求I所述的側耳菌發酵生產截短側耳素的培養基，其特征在于上述一級種子培養基的組成為葡萄糖5 20g/L、冷榨黃豆餅粉20 50g/L、磷酸氫二鉀I IOg/L、硫酸鎂O. I O. 4g/L、硝酸鈣O. I O. 4g/L、氯化鈉O. I O. 2g/L、有機硅消泡劑O. 3 .O.9g/L。
3.按照權利要求I所述的側耳菌發酵生產截短側耳素的培養基，其特征在于上述二級種子培養基的組成為葡萄糖18 22g/L、冷榨黃豆餅粉10 15g/L、磷酸氫二鉀I 4g/L、硫酸鎂O. 2 O. 4g/L、硝酸鈣O. 2 O. 4g/L、氯化鈉O. I O. 2g/L、有機硅消泡劑O. 5 .O.9g/L。
4.按照權利要求I所述的側耳菌發酵生產截短側耳素的培養基，其特征在于上述發酵培養基的組成為葡萄糖20 30g/L、冷榨黃豆餅粉15 20g/L、玉米漿15 20g/L、硫酸鎂O. 2 O. 4g/L、磷酸氫二鉀I 4g/L、硝酸 丐O. 5 lg/L、酵母粉2 5g/L、玉米油5 .15ml/L、有機硅消泡劑O. 2 O. 5g/L。
5.一種利用權利要求I至4任意一項培養基生產截短側耳素的發酵方法，其工藝步驟包括將已經培養好的側耳菌母瓶種子液接入含有一級種子培養基的一級種子罐中進行一級種子液的培養，至菌體濃度15 25%，pH值6 8時全部移入含有二級種子培養基的二級種子罐中進行二級種子液的培養，至菌體濃度20 40%，pH值6 8時全部移入含有發酵培養基的發酵罐中進行發酵液的培養，至發酵液中菌體濃度30 - 40%，氨基氮在5 10%，脂肪在I 2%，還原糖在I 2%，化學效價達到16000 18000u/ml時發酵終止。
6.按照權利要求5所述的發酵方法，其特征是在側耳菌母瓶種子液接入一級種子培養基之前，首先要將一級種子培養基滅菌、冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在0.01 .O.02MPa，要求滅菌后的種子液pH控制在5 8 ;氨基氮含量控制在10 50% ;還原糖含量控制在I 5%。
7.按照權利要求5所述的發酵方法，其特征是在一級種子液移入二級種子培養基之前，首先要將將二級種子培養基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在0.01 .O.02MPa，要求滅菌后的種子液pH控制在5 8 ;氨基氮含量控制在10 50% ;還原糖含量控制在I 5%。
8.按照權利要求5所述的發酵方法，其特征是在二級種子液移入發酵培養基之前，首先要將發酵培養基滅菌，冷卻，并用無菌空氣保壓，壓力控制在O. 01 O. 02MPa,要求滅菌后的發酵液PH控制在6 8 ;氨基氮控制在20 80% ;還原糖含量控制在I 5%。
9.按照權利要求5或6所述的發酵方法，其特征是所述側耳菌母瓶種子液的接種量控制在一級種子培養基體積的5 10%。
10.按照權利要求5所述的發酵方法，其特征在于所述一級種子液的培養條件為罐壓.O.02 O. 06MPa ;罐溫20 28°C ;空氣流量0 15h :1 5m3/h ；15h 移種5 IOm3/h ;攪拌轉速100 120r/min ;培養時間40 60h。
11.按照權利要求5所述的發酵方法，其特征在于所述二級種子液的培養條件為罐壓.O.02 O. 06MPa ;罐溫 20 28°C;空氣流量0 20h 5 10m3/h ；21h 移種10 12m3/h ；;攪拌轉速120 150r/min ;培養時間:30 60h。
12.按照權利要求5所述的發酵方法，其特征在于所述發酵液的培養條件為 a氨基氮控制發酵周期50 180h控制在5 10% ;發酵周期181h 發酵結束控制在I 5% ； b發酵周期培養時間200 300h ； c pH控制0 60h, pH自然,不受控制；81 180h, pH控制在6 8 ；181h 發酵結束，pH控制在6. 2 7. 8 ； d空氣流量0 40h :10 20m3/h ；41 180h :20 40m3/h ；181h 發酵結束:15 20m3/h ； e壓力控制罐壓O. 01 O. 05MPa ； f溫度控制發酵全程溫度控制在20 28°C ; g無菌檢查發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌； h菌體濃度0 90h，菌體自然生長，濃度不受控制；91 180h，菌體濃度控制在50 60%； 18Ih 發酵結束，菌體濃度控制在30 40% ； I攪拌轉速0 80h，攪拌轉速控制在80 100r/min ；81 200h，攪拌轉速控制在120 150r/min ；181h 發酵結束，攪拌轉速控制在100 120r/min。
13.按照權利要求5所述的發酵方法，其特征是在發酵過程中進行補料， a.補油補充玉米油，在發酵50 180h過程中，當脂肪含量<2%，采用流加的方式補入玉米油，脂肪含量控制在2 3% ;在發酵ISlh 發酵結束過程中，當脂肪含量< 1%，采用流加的方式補入玉米油，脂肪含量控制在I 2% ； b.補糖補糖選擇濃度為29 30%葡萄糖，在發酵60 180h過程中，當還原糖濃度< 2%，補入葡萄糖溶液，還原糖的含量控制在2 3%，在發酵181h 發酵結束過程中，當還原糖濃度< 1%，補入葡萄糖溶液，還原糖的含量控制在I 2% ； c.補水，在發酵周期91 180h過程中，當菌體濃度>60%,補入已滅菌的自來水,控制菌體濃度在50 60%，在發酵181h 發酵結束，當菌體濃度> 40%，補入已滅菌的自來水，控制菌體濃度在30 40% ； d.根據需要補酸或堿使發酵過程中pH滿足下列條件在發酵開始 80h，pH處在發酵自然狀態，在發酵81 180h，pH控制在6 8，181h 發酵結束，pH 6. 2 7. 8。
全文摘要
本發明涉及一種側耳菌生產截短側耳素的培養基及發酵方法，該培養基包括一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基，其特征在于一級種子培養基和二級種子培養基中含有冷榨黃豆餅粉和有機硅消泡劑；發酵種子培養基中含有冷榨黃豆餅粉、有機硅消泡劑和玉米油。本發明通過采用由玉米油、冷榨豆餅粉替代豆油、熱榨豆餅粉，優化其培養基配方，克服截短側耳素的發酵單位低、單罐菌絲體數量少等技術缺陷，提供一種提高發酵單位，改善菌體發酵質量，同時最大限度的降低原輔料來源不受環境影響，保證其供應充足，實現了截短側耳素穩定、高效的生產。
文檔編號C12P15/00GK102660596SQ201210112089
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者任勇, 奇乃, 王 義, 王文超, 納卓斌 申請人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司