專利名稱：抑制流感病毒相關基因的siRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及抑制小窩蛋白2和表面活性蛋白D基因表達的siRNA、siRNA的核苷酸序列、可編碼該siRNA的重組載體以及可編碼轉錄因子A和對氧磷酸酶3的重組載體，以及它們各自的基因在制備和篩選抗流感藥物方面的用途。
背景技術：
病毒入侵宿主過程伴隨著宿主基因表達變化，最終決定感染細胞和病毒各自的命運。病毒感染宿主后需要利用宿主細胞的代謝過程完成病毒自身的復制，在這一過程病毒必然會調控宿主細胞內基因組的表達，抑制抗病毒基因表達，增強對病毒復制有益的基因表達。因此，病毒感染宿主細胞后，宿主細胞內表達變化的這些基因往往和病毒復制有密切的關系。通過生物學手段調控宿主細胞內這些基因中一個或同時調控多個基因表達可能具有抑制流感病毒復制的作用，具有潛在預防和治療流感病毒感染的應用價值。流感病毒為正粘病毒科流感病毒屬分節段單股負鏈RNA病毒。病毒粒子剛分尚時呈多晶形，在體內傳代后變成球形，直徑80-120nm(PaleSe，et al.，2007)。病毒粒子由0.8-1 %的RNA、70-75%的蛋白質、20%的脂類和5_8%的糖類組成，此處比例均為質量比。流感病毒分為A、B、C三型，其中A型(甲型)最為重要。甲型流感病毒能引起人類、豬、馬和各種禽類的自然感染和發病。由于其表面抗原HA和NA容易變異，已知HA有16個亞型(H1-H16)，NA有9個亞型(N1-N9)，它們之間的不同組合，使甲型流感病毒有許多亞型(如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1等)，在豬體中主要流行HlNl和H3N2亞型。不同動物有不同的流感病毒，如豬流感、人流感、馬流感，一般情況下這些流感只感染各自的本屬動物。但是，流感病毒具有宿主種的適應性。在不同種動物的個體之間也容易發生傳播，形成感染多種動物的新流感病毒。另一個特點是豬這種動物比較特殊，豬對其它動物的流感病毒也易感，這是其它動物不具有的特性。所以一旦豬同時感染了人流感、豬流感、禽流感等，這多種病毒會在豬體內發生重組，可能就會出來一種既能感染豬、人、禽的流感病毒。所以狹義的豬流感不是人獸共患病。流感在人與人之間傳播范圍很有限，跟流感的傳播途徑有關。比如2009年甲型流感，就是人流感、豬流感、禽流感共同感染豬后產生的新流感病毒，最開始感染的人基本都是接觸過或跟豬關系密切的人，隨后會有更多人感染流感病毒。人類發展史上流感病毒的大爆發都給社會經濟發展、人的健康帶來重大危害。為預防和治療流感，各國都投入了大量人力物力，不斷研究治療方法和藥物。近年來，從宿主細胞內尋找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一個熱門領域。人類發展史上流感病毒的大爆發都給社會經濟發展、人的健康帶來重大危害。為預防和治療流感，各國都投入了大量人力物力，不斷研究治療方法和藥物。近年來，針對宿主細胞內具有抗病毒功能的基因或蛋白作為靶點研發抗病毒藥物是一個熱門領域。以細胞內功能分子作為抗病毒治療的靶點具有廣譜抗病毒、不易產生耐藥毒株的優勢，逐漸成為研究開發抗病毒治療藥物的熱點途徑。近年來國際高水平論文多次報道在宿主細胞內信號通路中篩選具有潛在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如， 鋅指抗病毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein, ZAP)能通過降解特異病毒RNA進而抑制鼠白血病病毒等多種病毒的復制，被證明是一種重要的抗病毒因子(Chen et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A.105，4352-4357)。利用鋅指蛋白為載體攜帶特異的酶阻斷T細胞中的 CCR5 表達，可促進 T 細胞清除 HIV 病毒(Holt et al.(2010)Nat.Biotechnol.28，839-847) <^3泛素連接酶RNF5定位于線粒體，通過泛素化修飾MITA (也稱為STING)并引起其降解而負調控病毒感染后I型干擾素表達(Zhong et al.(2009) Immunity.30,397-407)。Tetherin (宿主細胞蛋白)以二聚體錨定HIV在其復制的細胞膜上，阻斷病毒從胞漿膜出芽釋放(Perez-Caballero et al.(2009)Cell.139，499-511)。AP0BEC3G(ApolipoproteinBmRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G)可誘導HIV基因變異，使病毒不能復制(Shirakawa et al.(2008) Nat.Struct.Mol.Biol.15,1184-1191)。目前細胞周期素依賴激酶、前列腺素、熱休克蛋白作為藥靶分子廣泛用于如，HCMV、HIV、HSV、腺病毒和乳頭狀瘤等病毒病治療。RNAi是一種高效的特異性強的基因阻斷技術，近年來發展迅速，很快就成為功能基因組研究的有力工具。通過實驗手段將dsRNA分子導入細胞內，特異性地降解細胞內與其序列同源的mRNA，封閉內源性基因表達，從反向遺傳的角度研究人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應用此項技術分離了果蠅胰島素信號轉導途徑通路中的各種成分。近來也有實驗報道通過RNAi研究細胞內脂質平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前，曾利用反義RNA與靶mRNA序列互補的特性來抑制其表型的發生，但由于反義RNA對內源性表達的基因抑制作用較弱，往往會產生一些過渡表型，易造成對基因功能判斷錯誤，目前已通過審批認為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物Vitravene。RNAi特異性更高，作用更迅速，副反應小，在有效地沉默靶基因的同時，對細胞本身的調控系統也沒有影響。最近在人類體細胞里已經成功地對近20種基因功能進行了“敲除”，尤其是因此而了解了人類空泡蛋白TsglOl對HIV在人體內增殖的作用，進一步深化了對HIV的研究。Leonid等以脊髓灰質炎病毒為模型，利用RNAi來誘導細胞的胞內免疫，產生抗病毒效應，尤其是針對RNA病毒。對于易突變的病毒，可設計多種靶向病毒基因保守序列的dsRNA，減少它對dsRNA的抵抗。Maen等也應用RNAi技術成功地阻斷了 MCF-7乳腺癌細胞中一種異常表達的與細胞增殖分化相關的核轉錄因子基因21的功能。RNAi技術的應用，不僅能大大推動人類后基因組計劃(蛋白組學)的發展，高通量地篩選藥物靶基因，逐條檢測人類基因組的表達抑制情況來明確基因的功能，并且它還將應用于基因治療、新藥開發、生物醫學研究等領域，用RNAi技術來抑制基因的異常表達，為治療各種疾病開辟了新的途徑。由于近年來分子生物學技術和細胞生物學技術的快速發展，分子藥理學研究也不斷深入，新的藥物作用靶點、功能蛋白質、基因表達的變化，生物活性成分等不斷發現，為藥物篩選提供了大量新的靶點，如新的受體、酶等。這些新的靶點為新藥篩選提供了新的信息和機會。細胞分子水平藥物篩選模型的應用為自動化操作奠定了基礎，使藥物篩選由傳統的手工篩選形式轉變為由計算機控制的自動化大規模篩選的新技術體系，形成了高通量藥物篩選。高通量藥物篩選的優點:實現了藥物篩選的規模化，較大限度地利用了藥用物質資源，提高了藥物發現的概率， 同時提高了發現新藥的質量；篩選實驗是在微量篩選系統中完成的，樣品用量一般在微克級(μ g)，節省了樣品資源，奠定了“一藥多篩”的物質基礎，同時節省了實驗材料，降低了單藥篩選成本；高通量藥物篩選為高度自動化操作減少了操作誤差的發生，降低了勞動強度，而且提高了藥物篩選的效率和結果的準確性；具有多學科理論和技術結合的特點。藥物篩選模型是發現新藥的重要條件。新模型的建立將會帶動新型藥物的出現。分子生物學、細胞生物學、計算機科學的發展，特別是人類基因組計劃的完成，為醫藥研究帶來了良好的機遇，也為建立新的藥物篩選模型，提供了理論、技術、材料等多方面的優勢條件。因此，我們應充分利用各學科的發展技術建立更多新的篩選模型，促進新藥的發現。DNA疫苗是上世紀九十年代發展起來的新技術，即將外源基因克隆到真核表達載體上構建DNA疫苗質粒，DNA疫苗經過各種途徑注射到動物基體內后，可被宿主細胞吸收和攝取，進入宿主細胞的細胞核中轉錄成mRNA,再在胞楽;中翻譯成蛋白質。其中一部分蛋白質在降解后與MHCI類分子結合，并被遞呈到細胞表面被CD8T細胞的受體識別，而激活細胞毒性T細胞的活性；另一部分蛋白質也可以分泌出去，再像外源蛋白一樣被抗原提呈細胞攝取，在吞噬溶酶體內降解成多肽，并進一步與MHCII類分子結合，有抗原提呈細胞提呈到細胞表面被Th2細胞的受體識別，然后由Th2細胞分泌的細胞因子作用于B細胞，而刺激以抗體產生為主的體液免疫。DNA疫苗不僅可誘導產生體液免疫，而且可誘導強烈而持久的細胞免疫，還可避免向外界排毒，而且DNA疫苗與減毒和弱毒疫苗不一樣，其不存在毒力反強等問題。其安全性及高效性是傳統疫苗所達不到的，所以，該技術在病毒、細胞內寄生所引起的傳染病、寄生蟲以及腫瘤防治中顯示出巨大的潛力。Wolff對重組質粒可以在小鼠體內表達進行了報道，外源蛋白可以在小鼠體內表達長達60天，提示質粒DNA可以在體內相當一段時間內進行表達，可以用作治療性作用，并引起了廣泛的研究。基因治療對于癌癥、動脈粥樣硬化、骨質疏松、關節炎、阿耳茨海默氏病因為特定基因活動異常而引起的疾病的預防和治療很有前景。該療法是一種將核酸引入人細胞以用來修改它們的遺傳特性而達到治療目的的治療策略。通常，該核酸是能夠編碼起治療作用，破壞作用或者標記作用的蛋白質的雙鏈DNA分子(dsDNA)。該核酸也可能是與宿主細胞里的目標序列結合，通過阻止mRNAs或者啟動子來抑制特定基因表達的反義RNA或者單鏈DNA(ssDNA)。至今，以質粒為基礎的基因治療、癌癥疫苗等已經超過了 600例，質粒DNA的基因免疫模擬了病原體在細胞內的基因表達途徑，已經成功地應用來治療下肢的局部缺血，心血管再生，并極有希望通過核酸疫苗來預防現代醫學的疑難雜癥，包括瘧疾、艾滋病、乙肝和結核病等。對于基因治療，質粒不能整合入基因組DNA也許是個缺點，但是質粒可以附加體的形式存在于細胞核中，也可以持續表達相當長的一段時間。

發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是設計抑制宿主體內和流感病毒復制相關基因的siRNA序列，構建能夠編碼該siRNA的重組載體，以及含有該序列開放閱讀框的重組載體在制備抗流感藥物方面的應用。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一是:一種針對小窩蛋白2基因的siRNA，其中本發明所述的siRNA對應的靶序列是小窩蛋白2基因的mRNA，本發明所述的siRNA的長度為16-30bp， 且可使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達下降60%以上。其中所述的哺乳動物包括選自豬、犬、鼠、人等哺乳動物，本發明中較佳的是豬，本發明的siRNA在豬中具有較好的沉默基因的效果。本發明中所述的siRNA，長度為16_30bp，更佳地為18_25bp。較佳的，所述的siRNA含有選自SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或如序列表中SEQ ID NO ; I表示。更佳地，所述的siRNA的3’端含有2個T或含有2個U的延伸結構。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之二是:一種編碼所述的抑制小窩蛋白2表達的siRNA的重組載體。根據本發明，所述的重組載體采用的載體可以是本領域常規的載體，包括腺病毒載體，如以5型(Ad5)、2型(Ad2)為基礎的各種腺病毒載體，慢病毒載體，選自HIV-1型載體，HIV-2型載體，SIV型載體，FIV型載體等。將所述siRNA片段克隆到載體質粒中，即得本發明的重組載體。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之三是:一種組合物，其中含有0.001-99.99wt%本發明所述的針對小窩蛋白2的siRNA和可接受的載體、稀釋劑或賦形齊U。其中，所述的載體、稀釋劑或賦形劑，更佳地是藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，包括水溶性、難溶性或腸溶性等載體材料，或粉、糊精、糖粉，硫酸鈣二水化合物、磷酸氫鈣、 氧化鎂、碳酸鎂、碳酸鈣、 氫氧化鋁凝膠粉和活性炭中的一種或多種。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之四是:所述的siRNA在制備或篩選抗流感藥物中的用途。其中，所述的siRNA可以作為唯一的抗流感病毒活性成分，也可以和其他抗流感病毒藥物聯合使用。本發明所述的siRNA在制備抗流感藥物的用途中，更佳地可采用如下技術方案:如通過吸入的方式給藥，不僅使用方便，而且可以增加其在感染部位的藥物濃度。并且，由于感染早期病毒數量小，充足的siRNA可以更有效地抑制病毒的復制，從而起預防和治療的效果；流感中RNAi藥物靶點選擇較多，可以復方或多重用藥，不易產生耐藥毒株；最后RNAi與流感疫苗不同，不需要使用者具有健全的免疫系統。本發明還可以更佳地采取如下技術方案:如通過靜脈注射或肌肉注射SiRNA序列或編碼該siRNA重組載體等方式，使該siRNA在生物體內得以高效、持久表達從而達到RNA免疫或基因治療流感病毒的目的。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之五是:所述的siRNA在抑制流感病毒復制中的用途。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之六是:一種篩選抗流感藥物的方法，包括以下步驟:(I)使候選藥物與感染流感病毒的細胞接觸，所述的細胞是小窩蛋白2基因沉默的細胞；(2)測試流感病毒滴度；(3)選擇使流感病毒滴度下降的候選藥物。其中，更佳地步驟(I)中所述小窩蛋白2基因表達沉默細胞是通過使宿主細胞含有所述基因的小干擾RNA或者是含有編碼有所述小干擾RNA的重組載體使該基因沉默。其中，所述細胞可以采用293T (人腎上皮細胞系)、BHK (倉鼠腎細胞)、VER0 (非洲綠猴腎細胞)、IBRS22(豬腎細胞)或MDCK(犬腎細胞)等細胞系，本發明優選MDCK細胞。其中，通過該細胞與流感病毒接觸，經過一段時間后在顯微鏡下觀察細胞受損害的程度，比較以抗流感藥物處理和對照試驗的細胞中的流感病毒的病毒滴度，便可知道該抗流感藥是否能減少病毒對細胞的損害。本發明所述方法，更佳地可采用如下方案:藥物的細胞毒性檢測，MDCK細胞在96孔細胞培養板中培養形成單層后，加入不同濃度的藥液，繼續培養3天，用MTT法檢測藥物對MDCK細胞的毒性。藥物抗流感病毒作用檢測，MDCK細胞在96孔細胞培養板中培養形成單層后，用100TCID50的流感病毒感染細胞，再加入無毒濃度下的系列濃度的含藥培養液，繼續培養3天，經CPE法確定藥物對流感病毒的抑制作用。本發明所述方法，較佳地還可以采用如下技術方案；流感病毒RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)主要參與病毒的基因組復制與轉錄。對于復制，RdRp以病毒基因組RNA(vRNA)為模板催化生成與其互補的RNA鏈(cRNA)，cRNA隨后可以作為模板合成vRNA裝配進入子代病毒。對于轉錄，RdRp在合成cRNA的基礎上在其3’端加入多聚A尾，5’端加入帽子結構，形成成熟的mRNA進行蛋白質合成。本實驗根據合成RNA鏈時消耗底物ATP、UTP、CTP和GTP使體系中ATP濃度逐漸降低，測定體系中剩余的ATP含量以反應出反應進行程度。通過檢測該細胞株 中流感病毒RNA聚合酶變化水平，評估小窩蛋白2沉默細胞對抗流感藥物的敏感程度。其中所述病毒滴度檢測方法，MTT方法，CPE方法，細胞培養等方法，均為本領域常規實驗方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之七是:一種針對表面活性蛋白D基因的siRNA，所述的siRNA對應的靶序列是表面活性蛋白D基因的mRNA，所述siRNA的長度為16-30bp，且可使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達量下降60%以上。其中所述的哺乳動物包括選自豬、犬、鼠、人等哺乳動物，本發明中較佳的是豬，本發明的siRNA在豬中具有較好的沉默基因的效果。本發明中所述的siRNA長度為16_30bp，更佳地為18_25bp。較佳的，所述的siRNA含有選自SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或如序列表中SEQ ID NO:2表示。所述的siRNA，更佳地序列3’端含有2個T或含有2個U的延伸結構。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之八是:一種編碼所述的抑制表面活性蛋白D表達的siRNA的重組載體。根據本發明，所述的重組載體采用的載體可以是本領域常規的載體，包括腺病毒載體，包括以5型(Ad5)、2型(Ad2)為基礎的各種腺病毒載體，慢病毒載體包括HIV-1型載體，HIV-2型載體，SIV型載體，FIV型載體等。。將所述siRNA片段克隆到載體質粒中，即得本發明的重組載體。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之九是:一種組合物，其中含有0.001-99.99wt%本發明所述的針對表面活性蛋白D的siRNA序列和可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。其中所述的載體、稀釋劑和賦形劑，更佳地是藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。例如為水溶性、難溶性或腸溶性等載體材料、粉、糊精、糖粉、硫酸鈣二水化合物、磷酸氫鈣、氧化鎂、碳酸鎂、碳酸鈣、氫氧化鋁凝膠粉和納米材料中的一種或多種。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十是:所述的抑制表面活性蛋白D的siRNA在制備或篩選抗流感藥物中的用途。其中，所述的siRNA可以作為唯一的抗流感病毒活性成分，也可以和其他抗流感病毒藥物聯合使用。其中，更佳地可采用如下技術方案:如通過吸入的方式給藥，不僅使用方便，而且可以增加其在感染部位的藥物濃度。并且，由于感染早期病毒數量小，充足的siRNA可以更有效地抑制病毒的復制，從而起預防和治療的效果；流感中RNAi藥物靶點選擇較多，可以復方或多重用藥，不易產生耐藥毒株；最后RNAi與流感疫苗不同，不需要使用者具有健全的免疫系統。本發明還可以更佳地采取如下技術方案:如通過靜脈注射或肌肉注射SiRNA序列或編碼該siRNA重組載體等方式，使該siRNA在生物體內得以高效、持久表達從而達到RNA免疫或基因治療流感病毒的目的。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之i^一是:一種篩選抗流感藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟:(I)使候選藥物與感染流感病毒的細胞接觸，所述的細胞是表面活性蛋白D基因沉默的細胞；(2)測試流感病毒滴度:(3)選擇使流感病毒滴度下降的候選藥物。本發明所述的方法，更佳地步驟(I)中所述表面活性蛋白D基因表達沉默細胞是通過使宿主細胞含有所述基因的小干擾RNA或者是含有編碼有所述小干擾RNA的重組載體使該基因沉默。其中，所述細胞可以采用293T (人腎上皮細胞系)、BHK (倉鼠腎細胞)、VER0 (非洲綠猴腎細胞)、IBRS22(豬腎細胞)或MDCK (犬腎細胞)等細胞系，本發明優選MDCK。本發明所述方法，通過該細胞與流感病毒接觸，經過一段時間后在顯微鏡下觀察細胞受損害的程度，比較以抗流感藥物處理和對照試驗的細胞經流感病毒感染后的存活率或生長情況，便可知道該抗流感藥是否能減少病毒對細胞的損害。其中，更佳地可采用如下方案:(I)藥物的細胞毒性檢測，MDCK細胞在96孔細胞培養板中培養形成單層后，加入不同濃度的藥液，繼續培養3天，用MTT法檢測藥物對MDCK細胞的毒性。(2)藥物抗流感病毒作用檢測，MDCK細胞在96孔細胞培養板中培養形成單層后，用100TCID50的流感病毒感染細胞，再加入無毒濃度下的系列濃度的含藥培養液，繼續培養3天，經CPE法確定藥物對流感病毒的抑制作用。本發明所述方法，較佳地還可以采用如下技術方案:(I)流感病毒 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)主要參與病毒的基因組復制與轉錄。對于復制，RdRp以病毒基因組RNA(vRNA)為模板催化生成與其互補的RNA鏈(cRNA)，cRNA隨后可以作為模板合成vRNA裝配進入子代病毒。對于轉錄，RdRp在合成cRNA的基礎上在其3’端加入多聚A尾，5’端加入帽子結構，形成成熟的mRNA進行蛋白質合成。本實驗根據合成RNA鏈時消耗底物ATP、UTP、CTP和GTP使體系中ATP濃度逐漸降低， 測定體系中剩余的ATP含量以反應出反應進行程度。
(2)通過檢測該細胞株中流感病毒RNA聚合酶變化水平，評估表面活性蛋白D基因沉默細胞對抗流感藥物的敏感程度。其中所述病毒滴度檢測方法，MTT方法，CPE方法，細胞培養等方法，均為本領域常規實驗方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十二是:一種含有轉錄因子A的基因開放閱讀框的重組載體。較佳的，所述載體通過以下制備方法獲得:(I)把Genbank中登錄號為NM 001130211.1的轉錄因子A基因序列輸入到DNAStar軟件(DNASTAR公司，美國)EditSeq中，選取序列中從起始密碼子“ATG”到終止密碼子“TGA”、“TAG”或“TAA”之間最長的序列741bp堿基；(2)分別在Y和3'端設計擴增全長PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位點，CGG作為保護性堿基，下游引物5'端添加EcoR V酶切位點；(3)上游引物 5' -CGGAAGCTTATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT-3'；(4)下游引物 5' -CGGGATATCTCAACACTCCTCAGTGTCTTTC-3/ ；(5)以豬肺泡巨噬細胞提取的總RNA的反轉錄產物為模板，用設計的上下游引物PCR擴增得到轉錄因子A序列，然后經過酶切后連接到真核表達載體相應酶切位點。其中，真核表達載體可以 采用pCMVp-NE0-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4 等常見真核表達載體，本發明中，更佳地采用P⑶NA 3.1 (+)載體。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十三是:一種所述的含有轉錄因子A開放閱讀框的重組載體在制備或篩選抗流感藥物中的用途。本發明更佳地，可以將該重組載體用于轉染不同細胞系，轉染的方法可以是，DEAE-葡聚糖法，磷酸鈣法，陽離子脂質體法，陽離子聚合物法，病毒介導法，生物顆粒傳法(基因槍粒子轟擊法)，顯微注射法，電穿孔法等，本技術方案優選脂質體轉染法。轉染的細胞可以是各種真核細胞，本技術方案優選MDCK (犬腎細胞)。本發明還可以將該重組載體用于基因治療，如可以通過靜脈注射或肌肉注射等方式，在生物體內得以進行高效、持久表達從而達到DNA免疫或基因治療流感病毒的目的。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十四是:一種用于篩選藥物的細胞模型，其含有所述的含有轉錄因子A開放閱讀框的重組載體。其中，所述的細胞可以是各種真核細胞，包括293T(人腎上皮細胞系)、BHK(倉鼠腎細胞)、VERO (非洲綠猴腎細胞)、IBRS22(豬腎細胞)和MDCK (犬腎細胞)等細胞系等。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十五是:一種篩選抗流感藥物的方法，本發明所述方法，包括以下步驟:(I)使候選藥物與感染流感病毒的細胞接觸，所述的細胞是過表達轉錄因子A基因的細胞；(2)測試流感病毒滴度；(3)選擇使流感病毒滴度下降的候選藥物。本發明所述方法，步驟(I)所述的過表達該基因的細胞，更佳地是通過增加細胞內該基因的拷貝數或者改良該基因的調控元件使該基因過表達。 本發明所述方法，所述細胞可以選自293T (人腎上皮細胞系)、BHK (倉鼠腎細胞)、VERO(非洲綠猴腎細胞)、IBRS22(豬腎細胞)和MDCK(犬腎細胞)等細胞系，本發明優選MDCKo本發明所述方法，通過該細胞與流感病毒接觸，經過一段時間后在顯微鏡下觀察細胞受損害的程度，比較以抗流感藥物處理和對照試驗的細胞中流感病毒的病毒滴度，便可知道該抗流感藥是否能減少病毒對細胞的損害。本發明所述方法，更佳地可采用如下方案:(I)藥物的細胞毒性檢測，MDCK細胞在96孔細胞培養板中培養形成單層后，加入不同濃度的藥液，繼續培養3天，用MTT法檢測藥物對MDCK細胞的毒性。(2)藥物抗流感病毒作用檢測，MDCK細胞在96孔細胞培養板中培養形成單層后，用100TCID50的流感病毒感染細胞，再加入無毒濃度下的系列濃度的含藥培養液，繼續培養3天，經CPE法確定藥物對流感病毒的抑制作用。本發明所述方法，較佳地還可以采用如下技術方案:(I)流感病毒 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)主要參與病毒的基因組復制與轉錄。對于復制，RdRp以病毒基因組RNA(vRNA)為模板催化生成與其互補的RNA鏈(cRNA)，cRNA隨后可以作為模板合成vRNA裝配進入子代病毒。對于轉錄，RdRp在合成cRNA的基礎上在其3’端加入多聚A尾，5’端加入帽子結構，形成成熟的mRNA進行蛋白質合成。本實驗根據合成RNA鏈時消耗底物ATP、UTP、CTP和GTP使體系中ATP濃度逐漸降低，測定體系中剩余的ATP含量以反應出反應進行程度。(2)通過檢測該細胞株中流感病毒RNA聚合酶變化水平，評估轉錄因子A基因過表達細胞對抗流感藥物的敏感程 度。其中所述病毒滴度檢測方法，MTT方法，CPE方法，細胞培養等方法，均為本領域常規實驗方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十六是:一種含有對氧磷酸酶3基因的開放閱讀框的重組載體，。較佳的，所述載體通過以下制備方法獲得:(I)從Genbank中登錄號為匪001044604.1的對氧磷酸酶3中，選取從序列中從起始密碼子“ATG”到終止密碼子“TGA”、“TAG”或“TAA”之間最長的序列1065bp堿基；(2)分別在Y和3'端設計擴增全長PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位點，CGG作為保護性堿基，下游引物5'端添加EcoR I酶切位點；(3)上游引物 5' -CGGAAGCTTATGGGGAAGCTGGTGGCTCTGA-3'；(4)下游引物 5' -CGGGAATTCCTAGAGCACACAGTACAGAGCT-3'；(5)以豬肺泡巨噬細胞提取的總RNA的反轉錄產物為模板，用設計的上下游引物PCR擴增得到轉錄因子A序列，然后經過酶切后連接到真核表達載體相應酶切位點。其中，真核表達載體可以采用pCMVp-NE0-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4 等常見真核表達載體，本發明中，更佳地采用P⑶NA 3.1 (+)載體。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十七是:一種本發明所述的含有對氧磷酸酶3開放閱讀框的重組載體在制備或篩選抗流感藥物中的用途。本發明更佳地，可以將該重組載體用于轉染不同細胞系，轉染的方法可以是，DEAE-葡聚糖法，磷酸鈣法，陽離子脂質體法，陽離子聚合物法，病毒介導法，生物顆粒傳法(基因槍粒子轟擊法)，顯微注射法，電穿孔法等，本技術方案優選脂質體轉染法。轉染的細胞可以是各種真核細胞，本技術方案優選MDCK (犬腎細胞)。
本發明還可以將該重組載體用于基因治療，如可以通過靜脈注射或肌肉注射等方式，在生物體內得以進行高效、持久表達從而達到DNA免疫或基因治療流感病毒的目的。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十八是:一種用于篩選藥物的細胞模型，其含有所述的含有對氧磷酸酶3基因的開放閱讀框的重組載體。其中，所述的細胞可以是各種真核細胞，選自293T (人腎上皮細胞系)、BHK (倉鼠腎細胞)、VER0 (非洲綠猴腎細胞)、IBRS22(豬腎細胞)和MDCK (犬腎細胞)細胞系等。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之十九是:一種篩選抗流感藥物的方法，本發明所述方法，包括以下步驟:(I)使候選藥物與感染流感病毒的細胞接觸，所述的細胞是過表達對氧磷酸酶3基因的細胞；(2)測試流感病毒滴度；(3)選擇使流感病毒滴度下降的候選藥物。本發明所述方法，步驟(I)所述的過表達該基因的細胞，更佳地是通過增加細胞內該基因的拷貝數或者改良該基因的調控元件使該基因過表達。本發明所述方法，所述細胞可以采用293T (人腎上皮細胞系)、BHK (倉鼠腎細胞)、VERO(非洲綠猴腎細胞)、IBRS22(豬腎細胞)和MDCK(犬腎細胞)等細胞系，本發明優選MDCK。本發明所述方法，通過該細胞與流感病毒接觸，經過一段時間后在顯微鏡下觀察細胞受損害的程度，比較以抗流感藥物處理和對照試驗的細胞中流感病毒的病毒滴度，便可知道該抗流感藥是否能減少病毒對細胞的損害。本發明所述方法，更佳地可采用如下方案:(I)藥物的細胞毒性檢測，MDCK細胞在96孔細胞培養板中培養形成單層后，加入不同濃度的藥液，繼續培養3天，用MTT法檢測藥物對MDCK細胞的毒性。(2)藥物抗流感病毒作用檢測，MDCK細胞在96孔細胞培養板中培養形成單層后，用100TCID50的流感病毒感染細胞，再加入無毒濃度下的系列濃度的含藥培養液，繼續培養3天，經CPE法確定藥物對流感病毒的抑制作用。本發明所述方法，較佳地還可以采用如下技術方案:(I)流感病毒 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)主要參與病毒的基因組復制與轉錄。對于復制，RdRp以病毒基因組RNA(vRNA)為模板催化生成與其互補的RNA鏈(cRNA)，cRNA隨后可以作為模板合成vRNA裝配進入子代病毒。對于轉錄，RdRp在合成cRNA的基礎上在其3’端加入多聚A尾，5’端加入帽子結構，形成成熟的mRNA進行蛋白質合成。本實驗根據合成RNA鏈時消耗底物ATP、UTP、CTP和GTP使體系中ATP濃度逐漸降低，測定體系中剩余的ATP含量以反應出反應進行程度。(2)通過檢測該細胞株中流感病毒RNA聚合酶變化水平，評估對氧磷酸酶3基因過表達細胞對抗流感藥物的敏感程度。其中所述病毒滴度檢測方法，MTT方法，CPE方法，細胞培養等方法，均為本領域常規實驗方法。相比于現有技術，本發明的有益效果如下:本發明本發明以宿主細胞內具有抗病毒功能的基因或蛋白為靶點， 提供了抗流感病毒的藥物以及抑制流感病毒復制的方法。本發明是通過調控細胞內所述基因的表達得以實現的。發明具有預防和治療流感病毒感染的應用價值，對開發更好的抗流感藥物，對控制流感病毒的大爆發，減少流感病毒的大爆發對社會經濟發展、人的健康帶來的重大危害，具有重要的意義。


以下結合

本發明的特征和有益效果。圖1是Western-blot檢測沉默犬腎細胞中小窩蛋白2表達的結果，其中1:siRNA-小窩蛋白2 ；2 =SiRNA-小窩蛋白2對照；3:未接毒對照；4:正常細胞。圖2是Western-blot檢測沉默犬腎細胞中表面活性蛋白D表達的結果，其中1:siRNA-表面活性蛋白D ；2 =SiRNA-表面活性蛋白D對照；3 ;未接毒對照；4:正常細胞。圖3是沉默犬腎細胞中小窩蛋白2表達后流感病毒滴度圖。圖4是沉默犬腎細 胞中表面活性蛋白D表達后流感病毒滴度圖。圖5是構建的P⑶NA 3.1-轉錄因子A載體圖譜。圖6是構建的P⑶NA 3.1-對氧磷酸酶3載體圖譜。圖7是細胞中轉錄因子A和對氧磷酸酶3免疫印跡檢測結果，其中1:pCDNA 3.1-轉錄因子A ；2:pCDNA 3.1空載體對照；3:正常細胞4:pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3 ；5:pCDNA 3.1空載體對照；6:正常細胞。圖8是外源提高表達犬腎細胞中轉錄因子A后流感病毒滴度結果。圖9是外源提高表達犬腎細胞中對氧磷酸酶3后流感病毒滴度結果。圖10是小窩蛋白2沉默的犬腎細胞中加入金剛烷胺后流感病毒滴度圖。圖11是表面活性蛋白D沉默的犬腎細胞中加入金剛烷胺后流感病毒滴度圖。圖12是外源提高轉錄因子A表達的犬腎細胞中加入金剛烷胺后流感病毒滴度圖。圖13是外源提高對氧磷酸酶3表達的犬腎細胞中加入金剛烷胺后流感病毒滴度圖。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。實施例中所用的試劑除特別說明之外，均市售可得。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發明中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。實施例中所用豬流感病毒H3N2Swine/Guangdong/l/2006(SwGDl/05)毒株，其生物學特性能代表我國的豬流感病毒特點，源自中國農科院上海獸醫研究所豬傳染病研究室。6孔細胞培養板，美國Coming產品。DMEM 培養基，美國 GIBCO 產品，REF:16000_044。青霉素，美國GIBCO公司產品，REF:15140_122。鏈霉素，美國GIBCO公司產品，REF: 15140-122。犬腎細胞(MDCK細胞)，購自中科院上海生命科學研究院細胞庫。1.5ml離心管,美國Axygen公司產品。
丙酮，江蘇強盛化工有限公司，許可證號:XK13-201-00227。PBS，購自美國 GIBCO 公司，REF:20012_027。PBST:配制方法參考《分子克隆實驗指南》第三版。羊抗小鼠FITC標記的熒光抗體，美國Invitrogen公司產品，Code:CA11034s。100%甘油，國藥集團化學試劑有限公司。實施例1調控宿主細胞內基因表達抑制流感病毒復制1.siRNA (小干擾RNA)沉默宿主細胞內基因表達抑制流感病毒復制(I) siRNA 分子設計本實施例選擇小窩蛋白2基因，GeneID =100125375 ;表面活性蛋白D，GeneID:397198，使用Dharmacon在線設計軟件設計siRNA分子，設計小窩蛋白2基因特異性的siRNA干擾序列；并以“siRNA-小窩蛋白”隨意打亂序列作為對照。設計表面活性蛋白D基因特異性的siRNA干擾序列；并以“siRNA-表面活性蛋白D”隨意打亂序列作為對照。設計的siRNA雙鏈干擾分子主體序列為19個堿基，正義鏈3/端多加兩個UU，反義鏈3/端多加兩個TT。設計的序列如下:針對小窩蛋白2 靶序列 5’ -GCAAATACGTGATCTACAA-3’ ；siRNA-小窩蛋白 2 正義鏈序列 5’ -GCAAAUACGUGAUCUACAAUU-3’ ；siRNA-小窩蛋白 2 反義鏈序列 3’ -TTCGUUUAUGCACUAGAUGUU-5’ ；siRNA-小窩蛋白 2 對照正義鏈序列 5’ -CGAUAGAUGUACACAUACAUU-3’ ；siRNA-小窩蛋白 2 對照反義鏈序列 3’ -TTGCUAUCUACAUGUGUAUGU-5’ ；針對表面活性蛋白D靶序列5’ -GAGCAGAAATGAAGACCTA-3，；siRNA-表面活性蛋白 D 正義鏈序列 5’ -GAGCAGAAAUGAAGACCUAUU-3’ ；siRNA-表面活性蛋白 D 反義鏈序列 3’ -TTCUCGUCUUUACUUCUGGAU-5’ ； siRNA-表面活性蛋白 D 對照正義鏈 5’ -CAGAGUGACAGAAGACAUAUU-3’ ；siRNA-表面活性蛋白 D 對照反義鏈 3，-TTCUCUCACUGUCUUCUGUAU-5'。經NCBI blast分析干擾序列與“小窩蛋白或表面活性蛋白D”以外的基因同源性小于50%，對照序列與豬基因組所有序列同源性小于50%。根據該設計的siRNA序列，由Dharmacon公司體外人工合成雙鏈siRNA。(2) siRNA分子轉染細胞將胰酶消化的MDCK細胞用無血清的DMEM(美國GIBCO產品，REF =16000-044) (100個單位青霉素(美國GIBCO公司產品，REF =15140-122)和100個單位鏈霉素(美國GIBCO公司產品，REF:15140-122))傳于6孔細胞培養板(美國Coming產品)中，細胞密度4X106細胞/孔，繼續培養于37°C、5% CO2溫箱中。待細胞生長滿培養板底的80-90%，本發明所述雙鏈siRNA分子用FuGENE HD試劑(Roche公司，美國，產品編號:04709705001)轉染到MDCK細胞中，操作過程按說明書。同時設轉染對照干擾序列樣品siRNA-小窩蛋白2對照、未轉染對照、正常細胞對照。(3) siRNA轉染細胞接毒及樣品收集MDCK細胞轉染siRNA分子后24h接種流感病毒H3N2，接種劑量I X IO3EID50/孔(6孔板)。在接種病毒后第24h、48h、 72h收取樣品。方法如下:將細胞培養板中細胞、連同細胞培養液凍融3次，5000g/min離心IOmin,保留上清,棄沉淀。測定上清中流感病毒滴度。病毒滴度測定方法參考《國家流感中心標準操作規程(修訂版)，2007年》。實驗結果(圖1)表明，MDCK細胞中小窩蛋白2、表面活性蛋白D表達被siRNA分子沉默后接種流感病毒，在24h、48h、72h細胞中流感病毒滴度和對照組相比顯著降低，并
且差異顯著。細胞中小窩蛋白2被siRNA分子沉默后(如上接種病毒后第24h樣品)，Western-blot檢測結果見圖1，結果表明沉默組中小窩蛋白2表達水平明顯低于對照。細胞中表面活性蛋白D被siRNA分子沉默后(如上接種病毒后第24h樣品)，Western-blot檢測結果見圖2，結果表明沉默組中表面活性蛋白D表達水平明顯低于對照。siRNA-小窩蛋白2和siRNA-小窩蛋白2對照組相比p值分別Sp = 0.0004 (24h)、0.001 (48h)、0.015 (72h) ；siRNA-表面活性蛋白D和siRNA-表面活性蛋白D對照組相比p值分另Ij為 P = 0.004 (24h)、0.001 (48h) ,0.009 (72h)。上述實驗結果證明通過調控小窩蛋白2和表面活性蛋白基因表達能夠抑制宿主細胞內流感病毒的復制。2.外源性提高宿主細胞內基因表達抑制流感病毒復制

(I)外源表達第I組中基因表達載體的構建將轉錄因子A (TFAM) (GeneID:397279 ;基因數據庫登錄號:NM_001130211.1)連接到 pCDNA 3.1(+)載體(Invitrogen 公司，美國；貨號:V790-20)HindIII 和 EcoR V 酶切位點間，具體構建方法包括以下步驟:(I)把Genbank中登錄號為NM_001130211.1的轉錄因子A基因序列輸入到DNAStar軟件(DNASTAR公司，美國)EditSeq中，選取序列中從起始密碼子“ATG”到終止密碼子“TGA”、“TAG”或“TAA”之間最長的序列741bp堿基；(2)分別在Y和3'端設計擴增全長PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位點，CGG作為保護性堿基，下游引物5'端添加EcoR V酶切位點；(3)上游引物 5 ' -CGG AAGCTT ATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT-3 '(雙劃線為HindIII酶切位點)；(4)下游引物 5' -CGG GATATC TCAACACTCCTCAGTGTCTTTC-3 '(雙劃線為 EcoRV酶切位點);(5)以豬肺巨噬細胞提取總RNA反轉錄產物為模板，用設計的上下游引物PCR擴增得到轉錄因子A序列，然后經過酶切后連接到pCDNA 3.1 (+)載體相應酶切位點。構建成功的載體命名為P⑶NA 3.1-轉錄因子A，見圖5。將對氧磷酸酶3 (P0N3) (GeneID:733674 ;基因數據庫登錄號:ΝΜ_001044604.1)基因開放閱讀框連接到pCDNA 3.1 (+)載體(Invitrogen公司，美國；貨號:V790-20)HindIII和EcoR I酶切位點間，具體構建方法包括以下步驟:(I)把Genbank中登錄號為ΝΜ_001044604.I的對氧磷酸酶3基因序列輸入到DNAStar軟件(DNASTAR公司，美國)EditSeq中，選取從序列中從起始密碼子“ATG”到終止密碼子“TGA”、“TAG”或“TAA”之間最長的序列1065bp堿基；(2)分別在5’和3，端設計擴增全長PCR引物，上游引物5’端添加HindIII酶切位點，CGG作為保護性堿基，下游引物5’端添加EcoR I酶切位點；
(3)上游引物 5 ’ -CGG AAGCTT ATGGGGAAGCTGGTGGCTCTGA-3 ’ (雙劃線為 Hindi 11酶切位點)；(4)下游引物 5’-CGG^^XQCTAGAGCACACAGTACAGAGCT-3’(雙劃線為 EcoR I酶切位點)；(5)以豬肺巨噬細胞提取總RNA反轉錄產物為模板，用設計的上下游引物PCR擴增得到轉錄因子A序列，然后經過酶切后連接到pCDNA 3.1 (+)載體相應酶切位點。構建成功的載體命名為P⑶NA 3.1-對氧磷酸酶3，見圖6。(2)重組載體轉染細胞及表達宿主蛋白將胰酶消化的MDCK細胞用無血清的DMEM(美國GIBCO產品，REF =16000-044) 100個單位青霉素(美國GIBCO公司產品，REF =15140-122)和100個單位鏈霉素(美國GIBCO公司產品，REF:15140-122))傳于6孔細胞培養板(美國Coming產品)中，細胞密度4X IO6細胞/孔，繼續培養于37° C、5%C02溫箱中。待細胞生長滿培養板底的80-90%，用FuGENE HD試劑(Roche公司，美國，產品編號:04709705001)把pCDNA3.1-轉錄因子A、pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3載體分別轉染到MDCK細胞中，操作過程按說明書。同時設轉染P⑶NA 3.1 (+)空載體的細胞對照。細胞轉染后24h，收集轉染pCDNA 3.1-轉錄因子A、pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3、PCDNA3.1 (+)空載體和正常細胞樣品。細胞總蛋白提取:用PBS漂洗6孔細胞板中細胞2次，然后加Iml PBS將細胞用細胞刮鏟刮下，4°C，3000g離心5min沉淀細胞，棄上清。向細胞沉淀加入100 μ I的細胞裂 解液(碧云天公司，產品編號:Ρ0013)，重懸細胞，在冰上裂解5min，然后用超聲波細胞破碎儀(Sonics公司，美國，型號VCX105PB)瞬時破碎(40HZ，1S)，沸水煮5min,4°C下13000g離心IOmin,棄去沉淀。取2μ I蛋白上清用BCA試劑盒(碧云天公司，產品編號:Ρ0012)測定蛋白濃度，按照說明書操作。余下蛋白上清加入5XSDS PAGEbuffer (配制方法見《分子克隆實驗指南》第三版)，沸水煮5min,4°C下13000g離心5min,取上清進行蛋白質電泳。變性SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白轉印(步驟參考《分子克隆實驗指南》第三版):每個蛋白樣品上樣量為30 μ g，SDS-PAGE電泳儀(北京六一儀器廠)80V電壓層積蛋白，120V電壓分離蛋白，直至電泳結束。蛋白轉印使用硝酸纖維素膜(Whatman公司，美國，產品型號:10401396)。伯樂電泳槽恒壓65V，2h。轉印結束后NC膜浸入5% (v/v)的TBST-脫脂乳中進行封閉。室溫作用2h后，棄去封閉液，用含I % (v/v)吐溫20的TBST (pH7.6)緩沖液漂洗3次，洗去殘留脫脂乳，即可進行抗體孵育。抗體反應及顯色:加入一抗，對氧磷酸酶3抗體(Abeam,美國，產品編號:ab40969),轉錄因子 A 抗體(antikoerper-online.de 公司，德國，產品編號:ABIN484435)。4°C下輕搖振蕩過夜(12h-16h)，然后用100% TBST洗3次后，每次5min。之后加入HRP (辣根過氧化物酶)標記的二抗，室溫作用2h，用TBST漂洗3次后，每次5min。ECL試劑盒(Pierce公司，美國，產品編號:32106)顯色在暗室中操作。操作按照ECL試劑盒說明書。檢測內參對照:將已顯色的膜浸入抗體剝脫液(碧云天公司，產品編號:P0025)中，50°C孵育30min，每IOmin震蕩一次，然后用TBST緩沖液(配制方法:參考《分子克隆實驗指南》第三版)漂洗3次,加入封閉液再封閉15min,使用抗β-actin抗體(碧云天公司，產品編號:AA128)作為一抗檢測樣品中蛋白量。
檢測結果見圖5，表明MDCK細胞中轉染pCDNA 3.1-轉錄因子A、pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3后，細胞中“轉錄因子A”和“對氧磷酸酶3”的表達量高于轉染P⑶NA 3.1(+)空載體組和正常細胞組。(3)外源性提高MDCK細胞中“轉錄因子A”或“對氧磷酸酶3”具有抑制流感病毒作用細胞轉染pCDNA 3.1-轉錄因子A、pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3或pCDNA 3.1 (+)空載體后24h，接種劑量I X IO3EID5c/孔出孔板)豬流感病毒。在接種病毒后第24h、48h、72h收取樣品。方法如下:將細胞培養板中細胞、連同細胞培養液凍融3次，5000轉/min離心lOmin，保留上清，棄沉淀。測定上清中流感病毒滴度。病毒滴度測定方法參考《國家流感中心標準操作規程(修訂版)，2007年》。實驗結果(圖6、7)表明，MDCK細胞中轉錄因子A、對氧磷酸酶D被外源性提高表達，在24h、48h、72h細胞中流感病毒滴度和對照組相比顯著降低，并且差異顯著。轉染pCDNA 3.1-轉錄因子A組與轉染P⑶NA 3.1 (+)空載體組相比P值分別為P = 0.002 (24h)、0.014(48h),0.0005 (72h);轉染pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3組和轉染pCDNA3.1(+)空載體組相比 P 值分別為 P = 0.015(24h)、0.008(48h)、0.012(72h)。轉染 pCDNA3.1(+)空載體組和正常細胞中病毒滴度差異不顯著(P > 0.05)。上述實驗結果表明調控轉錄因子A和對氧磷酸酶3基因表達能夠抑制宿主細胞內流感病毒的復制。實施例2調控宿主細胞內基因表達顯著提高流感病毒藥物的抗病毒效果本實施例中通過調節犬腎細胞中蛋白表達后再感染H3N2豬流感病毒，利用向細胞培養液中加入金剛烷胺，研究調控細胞中蛋白對金剛烷胺抗流感病毒增強效果。金剛烷胺通過干擾流感病毒粒子M2蛋白離子通道，抑制病毒的復制的功能。I沉默犬腎細胞中小窩蛋白2顯著提高金剛烷胺抑制流感病毒效果(I)沉默犬腎細胞中小窩蛋白2表達具體步驟同實施例1。(2)金剛烷胺準備鹽酸金剛烷胺購自阿法埃莎(天津)化學有限公司，用生理鹽水配制成20mg/ml，過濾除菌，4°C保存。(3) siRNA分子轉染細胞具體步驟同實施例1。聯合用藥組在細胞培養液中加金剛烷胺，終濃度至0.4 μ g/ml，分組如下:siRNA-小窩蛋白+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)、siRNA-小窩蛋白2對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)、未轉染對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)和正常細胞對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml) ο(4) siRNA轉染細胞接毒及樣品收集同實施例1。實驗結果如圖10所示，表明MDCK細胞中小窩蛋白2表達被siRNA分子沉默后能顯著提高金剛烷胺抑制流感病毒的效果。24h、48h、72h細胞中流感病毒滴度siRNA-小窩蛋白+金剛燒胺(0.4 μ g/ml)組顯著低于siRNA-小窩蛋白2對照+金剛燒胺(0.4 μ g/ml)組，P 值分別為 P = 0.016 (24h)、0.0Ol (48h)、0.0Ol (72h)。
上述實驗結果證明調控細胞內小窩蛋白2基因表達能夠提高金剛烷胺抑制流感病毒復制的效果。2沉默犬腎細胞中表面活性蛋白D顯著提高金剛烷胺抑制流感病毒效果(I)沉默犬腎細胞中表面活性蛋白D表達具體步驟同實施例1。(2)金剛烷胺準備鹽酸金剛烷胺購自阿法埃莎(天津)化學有限公司，用生理鹽水配制成20mg/ml，過濾除菌，4°C保存。(3) siRNA分子轉染細胞具體步驟同實施例2。聯合用藥組在細胞培養液中加金剛烷胺，終濃度至0.4 μ g/ml，分組如下:siRNA-表面活性蛋白D+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)、siRNA-表面活性蛋白D對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)、未轉染對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)和正常細胞對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml) ο(4) siRNA轉染細胞接毒及樣品收集同實施例1。實驗結果如圖11所示，表明MDCK細胞中表面活性蛋白D表達被siRNA分子沉默后能顯著提高金剛烷胺抑制流感病毒的效果。24h、48h、72h細胞中流感病毒滴度siRNA-表面活性蛋白D+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)組顯著低于siRNA-表面活性蛋白D對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)組，P 值分別為 p = 0.020 (24h)、0.025 (48h)、0.130 (72h)。

上述實驗結果證明調控細胞中表面活性蛋白D基因表達能夠提高金剛烷胺抑制流感病毒復制的效果。3外源性提高宿主細胞內轉錄因子A表達顯著提高金剛烷胺抑制流感病毒效果(I)外源表達第I組中基因表達載體的構建具體步驟同實施例1。(2)重組載體轉染細胞及表達宿主蛋白具體步驟同實施例1。(3)外源性提高MDCK細胞中轉錄因子A后金剛烷胺抑制流感病毒復制的效果細胞轉染pCDNA 3.1-轉錄因子A或pCDNA 3.1 (+)空載體后24h，接種劑量1X103EID50/孔，聯合用藥組在細胞培養液中加金剛烷胺，終濃度至0.4 μ g/ml，設置以下實驗組:轉染P⑶NA 3.1-轉錄因子A+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)、轉染p⑶NA 3.1 (+)空載體+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)、未轉染對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)和正常細胞對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)。在接種病毒后第24h、48h、72h收取樣品。方法如下:將細胞培養板中細胞、連同細胞培養液凍融3次,5000轉/min離心IOmin,保留上清,棄沉淀。測定上清中流感病毒滴度。病毒滴度測定方法參考《國家流感中心標準操作規程(修訂版)，2007年》。實驗結果表明，圖12所示，MDCK細胞中轉錄因子A被外源性提高表達，在24h、48h、72h細胞中轉染pCDNA 3.1-轉錄因子A+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)組和轉染pCDNA3.1(+)空載體+金剛烷胺(0.4yg/ml)相比顯著降低，并且差異顯著，p值分別為p =0.310(24h),0.013(48h)、0.007 (72h)。上述實驗結果表明調控第I組中基因表達能夠顯著增強金剛烷胺抑制流感病毒復制。
4外源性提高宿主細胞內對氧磷酸酶3表達顯著提高金剛烷胺抑制流感病毒效果(I)外源表達第I組中基因表達載體的構建具體步驟同實施例2。(2)重組載體轉染細胞及表達宿主蛋白具體步驟同實施例2(3)外源性提高MDCK細胞中對氧磷酸酶3后金剛烷胺抑制流感病毒復制的效果細胞轉染pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3或pCDNA 3.1 (+)空載體后24h，接種劑量1X103EID50/孔，聯合用藥組在細胞培養液中加金剛烷胺，終濃度至0.4 μ g/ml，設置以下實驗組:轉染P⑶NA 3.1-對氧磷酸酶3+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)、轉染p⑶NA 3.1 (+)空載體+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)、未轉染對照+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)和正常細胞對照+金剛烷胺(0.4yg/ml)。在接種病毒后第24h、48h、72h收取樣品。方法如下:將細胞培養板中細胞、連同細胞培養液凍融3次,5000轉/min離心IOmin,保留上清,棄沉淀。測定上清中流感病毒滴度。病毒滴度測定方法參考《國家流感中心標準操作規程(修訂版)，2007年》。實驗結果13表明，MDCK細胞中對氧磷酸酶3被外源性提高表達，在24h、48h、72h細胞中轉染P⑶NA 3.1-對氧磷酸酶3+金剛烷胺(0.4 μ g/ml)組和轉染p⑶NA 3.1 (+)空載體+金剛烷胺(0.4 μ g/ml )相比顯著降低，并且差異顯著，p值分別為p = 0.042 (24h)、0.088(48h)、0.069 (72h)。上述實驗結果表明調控細胞中對氧磷酸酶3基因表達能夠顯著增強金剛烷胺抑制流感病毒復制。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇被單獨應用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。應理解，在閱讀了本發明的上述內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種針對小窩蛋白2基因的siRNA，其特征在于，所述的SiRNA對應的靶序列是小窩蛋白2基因的mRNA，所述的siRNA的長度為16_30bp，且可使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達下降60%以上。
2.如權利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA含有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
3.如權利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA如序列表中SEQID ΝΟ:1表/Jn ο
4.一種針對表面活性蛋白D基因的siRNA，其特征在于，所述的siRNA對應的靶序列是表面活性蛋白D基因的mRNA，所述的siRNA的長度為16_30bp，且可使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達量下降60%以上。
5.如權利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA含有選自SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
6.如權利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA序列如序列表中SEQIDNO:2表示。
7.如權利要求2或5所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA序列3’端還含有2個T或含有2個U的延伸結構。
8.如權利要求1-7任一項所述的siRNA在制備或篩選抗流感藥物中的用途，或者在抑制流感病毒復制中的用途。
9.一種含有轉錄因子A的基因開放閱讀框的重組載體，其特征在于，由包括以下步驟的方法制備， (1)在Genbank中登錄號為ΝΜ_001130211.1的轉錄因子A基因序列中，選取序列中從起始密碼子“ATG”到終止密碼子“TGA”、“TAG”或“TAA”之間最長的序列741bp堿基； (2)分別在5'和3'端設計擴增全長PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位點，CGG作為保護性堿基，下游引物5'端添加EcoRV酶切位點: (3)上游引物5' -CGGAAGCTTATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT-3'；(4)下游引物5' -CGGGATATCTCAACACTCCTCAGTGTCTTTC-3/ ； (5)以豬肺泡巨噬細胞提取的總RNA的反轉錄產物為模板，用設計的上下游引物PCR擴增得到轉錄因子A，然后經過酶切后連接到真核表達載體相應酶切位點。
10.一種含有對氧磷酸酶3的基因放閱讀框的重組載體，其特征在于，由包括以下步驟的方法制備， (1)從Genbank登錄號為NM_001044604.1的對氧磷酸酶3基因序列中，選取從序列中從起始密碼子“ATG”到終止密碼子“TGA”、“TAG”或“TAA”之間最長的序列1065bp堿基； (2)分別在5'和3'端設計擴增全長PCR引物，上游引物5'端添加HindIII酶切位點，CGG作為保護性堿基，下游引物5'端添加EcoR I酶切位點； (3)上游引物5' -CGGAAGCTTATGGGGAAGCTGGTGGCTCTGA-3'； (4)下游引物5' -CGGGAATTCCTAGAGCACACAGTACAGAGCT-3'； (5)以豬肺泡巨噬細胞提取的總RNA的反轉錄產物為模板，用設計的上下游引物PCR擴增得到對氧磷酸酶3序列，然后經過酶切后連接到真核載體相應酶切位點。
11.如權利要求9或10所述的重組載體，其特征在于，所述步驟(5)中的真核表達載體是 pCDNA 3.1(+)載體。
12.如權利要求9-11任一項所述的重組載體在制備或篩選抗流感藥物中的用途。
13.—種用于篩選藥物的細胞模型,其特征在于,含有如權利要求9-11任一項所述的重組載體。
全文摘要
本發明公開了針對小窩蛋白2、表面活性蛋白D的siRNA及重組載體；含有轉錄因子A、對氧磷酸酶3轉錄盒重組載體的構建方法和相應的細胞模型和篩選藥物的方法。本發明優點在于，所提供的siRNA使經其轉染后的哺乳動物細胞的mRNA或蛋白表達下降60％以上；該siRNA和重組載體可用于基因治療流感或針對流感病毒進行核酸免疫；本發明提供的細胞模型，可用于病毒研究，特別是豬流感病毒致病機理研究，也可用于建立篩選抗病毒藥物模型，特別是抗流感藥物細胞模型。
文檔編號C12Q1/48GK103215267SQ20121001971
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者馬志永, 史子學, 魏建超, 邵東華, 王少輝, 李蓓蓓, 晏文君, 朱紫祥 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所