專利名稱：生產脂質的方法
技術領域：
本發明涉及生產脂質的方法。具體而言，本發明涉及提高轉基因生物或其部分中的一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量的方法。在一個特定的實施方案中，本發明涉及酰基轉移酶例如單酰基甘油酰基轉移酶(MGAT)在提高植物、植物種子和/或葉、藻類和真菌中的一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量中的用途。_2]
背景技術：
植物脂質諸如種子油三酰基甘油(TAG)具有許多用途，例如烹飪用途(起酥油、質地、調味)、工業用途(用于肥皂、蠟燭、香水、化妝品、適合作為干燥劑、絕緣體、潤滑劑)，以及提供營養價值。使用植物脂質生產生物燃料的興趣也在不斷增長。牛物燃料替代能源的增長需求可通過植物源生物燃料的可再生供應而得到至少部分的滿足。要成為礦物燃料的可行替代方案，生物燃料應當在生產中提供凈能量增益(net energygain)，具有環境效益、經濟競爭力并且能夠大量生產，而不減少食品供應，這是目前在現有生物燃料生產中遇到的一個不遂人意的附帶問題。植物代表了脂質的重要來源，因為許多物種都會在種子中積聚脂質作為主要貯藏成分。在種子中，營養貯藏脂質(取決于物種，占種子重量的15-50%)的主要形式為三酰基甘油(TAG)。然而，脂質合成的初級底物是在綠色光合組織(葉和莖)中生成的碳水化合物，它們隨后在葉綠體中代謝生成游離脂肪酸和乙酰輔酶A(乙酰基-CoA)單元，即TAG的基本原料。因此，植物葉子是TAG原料合成的主要部位。油料種子中積聚的TAG的量可部分地由質體中產生的脂肪酸的量決定(Bao和Ohlrogge，1999)。TAG的最終貯藏發生在種子的小型圓球樣細胞器(稱為油體(oil body))中。TAG只代表了大約0.2-0.3%的葉的生物質是。

高生物質植物尤其是闊葉高生物質植物具有巨大的生物燃料潛能。每英畝可產生100-400噸低成本、高價值生物質材料的植物尤其有用，特別是當高成本、勞動力需求、化學投入或與低生物質植物生產相關的地理限制這些因素都不存在時。單酰基甘油酰基轉移酶單酰基甘油酰基轉移酶(MGAT)與哺乳動物相關，主要與哺乳動物的腸道相關，在腸道中該酶催化由單酰基甘油(MAG)和脂肪酰基輔酶A直接合成二酰基甘油(DAG)。相比之下，存在于植物中的主要TAG合成途徑為Kennedy途徑，或不包括MGAT步驟的磷酸甘油途徑(

圖1)。在Kennedy途徑中，DAG在兩步反應中由酰化甘油主鏈形成，該兩步反應是:通過溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAAT)發生初始酰化，該酶將脂肪酰基輔酶A加到溶血磷脂酸(LySoPA，LPA)底物上；以及隨后從產物磷脂酸(PA)中移除磷酸酯基團，得到無機磷酸酯(Pi)和DAG。相比之下，MGAT通過用來自脂肪酰基輔酶A的酰基使MAG酰化而直接催化形成DAG。在合成DAG后，另一種酶，二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT)酰化DAG形成TAG。待分離的第一種MGAT基因來自小鼠(MGATl)，該基因編碼膜結合的不溶性酶(Yen等，2002)。其他類似的MGAT基因已在動物中得以表征，包括來自小鼠的第二種MGAT基因(MGAT2)和三種人類基因，但是尚未證實已從植物中克隆出編碼MGAT的基因(Cao等，2003 ；Cheng 等，2003)。二酰基甘油酰基轉移酶DGAT是催化植物、真菌和哺乳動物中產生TAG的最終酶促步驟的整合膜蛋白。該酶負責將酰基從酰基輔酶A (酰基-CoA)轉移到DAG形成TAG。DGAT與植物和真菌中的膜和脂體組分相關，尤其是在油料種子中，其中DGAT有助于貯藏用作能源儲備的碳。已知DGAT可調控TAG結構并指導TAG合成。此外，已知的是，DGAT反應為脂質合成特異性的。在野生型植物中，酰基輔酶A依賴性DGAT以種子特異性方式的過表達導致種子油沉積和平均種子重量的增加(Jako等，2001)。為了最大程度提高脂質商業生產的產率，需要提高轉基因生物或其部分諸如植物、種子、葉、藻類和真菌中脂質水平的更多方法，尤其是非極性脂質諸如DAG和TAG。發明概沭本發明人令人吃驚地證實，MGAT基因或相關基因的轉基因表達導致諸如植物細胞的細胞中脂質產率的明顯提高。本發明人還鑒定了轉基因生物諸如植物中DAG和TAG合成的新途徑，該途徑不同于熟知的Kennedy途徑。因此，本發明提供生產提取的脂質的方法，該方法包括以下步驟:i)獲得包含一種或多種外源多核苷酸的轉基因非人生物或其部分，其中該轉基因非人生物或其部分當與不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應生物或其部分進行比較時具有升高水平的一種或多種非極性脂質，以及ii)從該轉基因非人生物或其部分提取脂質，從而產生所述提取的脂質。在一個實施方案中，該轉基因非人生物或其部分的總非極性脂質含量當與相應的生物或其部分相比時是升高的。該轉基因非人生物或其部分可進一步通過單一或組合的特征(i)、(ii)、(iii)進行定義:特征(i)定量該一種或多種非極性脂質水平或總非極性脂質含量升高的程度，其可以表示為按重量計的升高程度，或表示為與相應非人生物或其部分中的水平相比的相對升高值；和/或特征(ii)規定植物的屬或種，或者真菌或藻類的種，或其他細胞類型；以及特征(iii)規定升高的所述一種或多種特定脂質。對于特征(i)，在一個實施方案中，所述一種或多種非極性脂質的升高程度比相應的非人生物或其部分按重量計高至少0.5%、至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%或至少24%(w/w),優選達到按重量計約25%(w/w)的最大升高值。
另外對于特征(i)，在一個優選的實施方案中，所述轉基因非人生物或其部分的總非極性脂質含量當與相應的生物或其部分相比時是升高的。在一個實施方案中，總脂質含量比相應的非人生物或其部分按重量計升高至少0.5%、至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%或至少24%(w/w),優選達到按重量計約25%(w/w)的最大升高值。
進一步地，對于特征(i)，在一個實施方案中，所述一種或多種非極性脂質的水平和/或總非極性脂質含量比相應的非人生物或其部分在相對的基礎上高至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。另外對于特征(i)，所述一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量的升高程度比相應的非人生物或其部分在相對的基礎上可以高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍，優選達到約12倍的最大值。對于特征(ii)，在一個實施方案中，轉基因非人生物為植物、藻類或適合發酵的生物，諸如酵母或其他真菌，優選為含油酵母或其他真菌。植物可以為例如蕓苔屬、陸地棉、亞麻、向日葵屬、紅花、大豆、玉米、擬南芥、兩色高梁、高粱(Sorghum vulgare)、燕麥、三葉草屬、油掠(Elaesis guineenis)、本氏煙(Nicotiana benthamiana)、大麥(Hordeumvulgare)、羽扇豆(Lupinus angustifolius)、亞洲栽培稻(Oryza sativa)、光稃稻(Oryzaglaberrima)、亞麻莽、異源三倍體芒草奇崗或中國芒。對于特征(iii)，TAG、DAG、TAG和DAG、MAG、多不飽和脂肪酸(PUFA)、或具體PUFA(諸如二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、α亞麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA))、或它們中兩種或更多種的組合得以升高。TAG、DAG、TAG和DAG、MAG、PUFA或具體PUFA的升高程度可如上面的特征(i)所定義。在一個優選的實施方案中，MAG為2-MAG。優選地，DAG和/或TAG，更優選DAG和TAG的總和得以升高。

在優選的實施方案中，所述一種或多種非極性脂質和/或總非極性脂質含量通過特征Q)、( )和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的組合定義。在一個實施方案中，所述部分為植物的種子、果實、塊莖、根或營養部分。植物的營養部分可以為地上植物部分或綠色部分諸如葉子或莖干。在另一個實施方案中，所述部分為多細胞生物的細胞。特定植物部分的所述一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量的升高程度可以如上面的特征(i)所定義。蕓苔屬、陸地棉、亞麻、向日葵屬、紅花、亞洲栽培稻、光稃稻、亞麻薺、大豆或玉米的植物部分優選為種子，而兩色高梁、高粱、燕麥、三葉草屬、油棕、本氏煙、大麥、羽扇豆、異源三倍體芒草奇崗或中國芒的優選部分為營養部分，具體地講為葉子和莖干。在一個實施方案中，所述部分為植物種子，而提取的脂質為種子油。本發明的方法可進一步包括從轉基因植物收獲種子，從種子壓榨種子油，和/或在一個或多個步驟中純化種子油。種子可以例如來自油菜植物、玉米植物、大豆植物、羽扇豆植物、花生植物、向日葵植物、棉花植物、紅花植物或亞麻植物。在一個實施方案中，種子的總油含量或總脂肪酸含量按重量計比不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應種子高至少0.5%(w/w)至25%(w/w)。在一個實施方案中，種子油的相對DAG含量比相應的種子高至少10%、至少10.5%、至少11%、至少11.5%、至少12%、至少12.5%、至少13%、至少13.5%、至少14%、至少14.5%、至少15%、至少15.5%、至少16%、至少16.5%、至少17%、至少17.5%、至少18%、至少18.5%、至少19%、至少19.5%、至少20%(w/w)。在一個實施方案中，種子的DAG含量升高的量如特征(i)所定義，而種子來自如特征(ii)所定義的屬和/或種。在一個實施方案中，種子油的相對TAG含量比相應的種子高至少5%、至少5.5%、至少6%、至少6.5%、至少7%、至少7.5%、至少8%、至少8.5%、至少9%、至少9.5%或至少10% (w/W)。在一個實施方案中，種子的TAG含量升高的量如特征(i)所定義，而種子來自如特征(ii)所定義的屬和/或種。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(《/V)為至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%或至少55%的油菜種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%或至少10%的玉米種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%或至少30%的大豆種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%或至少16%的羽扇豆種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%或至少55%的花生種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%或至少55%的向日葵種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%或至少50%的棉花種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%或至少45%的紅花種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少36%、至少37%、至少38%、至少39%或至少40%的亞麻種子。在一個實施方案中，種子為油含量按重量計(w/w)為至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%或至少45%的亞麻薺種子。在另一個實施方案中，生物部分為營養植物部分，并且營養植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量比不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應營養植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量在相對的基礎上高至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%(w/w)。在一個優選的實施方案中，MAG為2-MAG。在一個實施方案中，營養植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量由營養植物部分的可提取脂質中的這些脂質組分的量決定。在進一步的實施方案中，轉基因營養植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量升高的量如特征(i)所定義。
在一個實施方案中，所述生物或其部分或從其提取的脂質的總非極性脂質含量的脂肪酸含量的至少60%(mol%)為油酸。在另一個實施方案中，所述生物或其部分的PUFA含量當與相應的生物或其部分進行比較時是升高的。在此背景下，PUFA含量既包含酯化的PUFA(包括TAG、DAG等)也包含非酯化的PUFA。在一個實施方案中，所述生物或其部分的PUFA含量優選由生物或其部分的可提取脂質中PUFA的量決定。PUFA含量的升高程度可以如特征(i)所定義。PUFA含量可以包含EDA、ARA、ALA、SDA、ETE、ETA、EPA、DPA、DHA或它們中兩種或更多種的組合。在另一個實施方案中，生物或其部分或由其提取的脂質中的PUFA的水平與相應的生物或其部分或由其提取的脂質相比時是升高的。PUFA可以為EDA、ARA、ALA、SDA、ETE、ETA、EPA、DPA、DHA或它們中兩種或更多種的組合。PUFA的升高程度可以如特征⑴所定義。在一個實施方案中，所述一種或多種非極性脂質(諸如TAG、DAG、TAG和DAG、MAG、PUFA或特定的PUFA)的水平和/或總非極性脂質含量可通過使用氣相色譜對得自提取的脂質的脂肪酸甲酯進行分析而測定。測定任何這些含量的備選方法在本領域中是已知的，并包括不需要從生物或其部分中提取脂質的方法，例如通過近紅外(NIR)或核磁共振(NMR)進行分析。在一個實施方案中，所述一種或多種外源多核苷酸編碼:i)單酰基甘油酰基轉移酶(MGAT)，ii) 二酰基甘油酰 基轉移酶2 (DGAT2)，iii)MGAT和甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)，或i V) MGAT 和 DGAT，或V) MGAT、GPAT 和 DGAT。在一個實施方案中，所述外源多核苷酸編碼催化sn-1 MAG或sn-2 MAG的酰化以分別形成sn-1，3 DAG或sn_l，2/2，3-DAG的MGAT。在一個優選的實施方案中，MGAT催化sn-2 MAG的酰化形成sn_l，2/2，3-DAG。編碼MGAT的外源多核苷酸可包含以下一種或多種:i)選自SEQ ID NO:1至44任一者的核苷酸序列，ii)編碼包含具有SEQ ID NO:45至82任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或iv)在嚴格條件下與i)至iii)的任一雜交的核苷酸序列。在一個實施方案中，所述外源多核苷酸編碼MGAT1,其包含以下一種或多種:i)選自SEQ ID NO: 1、3至5或7至23任一者的核苷酸序列，ii)編碼包含具有SEQ ID NO:45至61的任一所提供的序列的氨基酸多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或iv)在嚴格條件下與i)至iii)的任一雜交的核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述外源多核苷酸編碼MGAT2,其包含以下一種或多種:i)選自SEQ ID NO:2、6或24至37任一者的核苷酸序列，ii)編碼包含具有SEQ ID NO:62至75的任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或iv)在嚴格條件下與i)至iii)任一雜交的核苷酸序列。在另一個實施方案中,所述外源多核苷酸編碼MGAT3,其包含以下一種或多種:i)選自SEQ ID NO:38至44任一者的核苷酸序列，ii)編碼包含具有SEQ ID NO:76至82的任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或iv)在嚴格條件下與i)至iii)的任一雜交的核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述外源多核苷酸編碼催化sn-1，3 DAG或sn-1, 2/2，3-DAG、優選sn_l，2/2，3-DAG的酰化以形成TAG的DGAT。在一個實施方案中，所述外源多核苷酸編碼DGAT2,其包含以下一種或多種:i)選自SEQ ID NO:204至211任一者的核苷酸序列，ii)編碼包含具有SEQ ID NO:212至219的任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或iv)在嚴格條 件下與i)至iii)的任一雜交的核苷酸序列。在一個優選的實施方案中，DGAT2包含SEQ ID NO:204的核苷酸序列和/或編碼包含具有SEQ ID N0:212所提供的序列的氨基酸的多肽的核苷酸序列。在另一個實施方案中，所述外源多核苷酸編碼甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)。在一個優選的實施方案中，GPAT還具有磷酸酶活性并產生MAG(即，催化G-3-P形成sn_lLPA或sn-2 LPA并從LPA移除磷酸酯基團形成MAG的GPAT)。在一個進一步優選的實施方案中，GPAT為sn-2 GPAT (即，優先由G_3_P產生sn_2 LPA)并具有磷酸酶活性以產生2-MAG，例如擬南芥GPAT4或GPAT6。編碼GPAT的外源多核苷酸可包含以下一種或多種:i)選自SEQ ID NO:84至141任一者的核苷酸序列，ii)編碼包含具有SEQ ID NO: 144至201的任一所提供的序列的氨基酸的多肽或其生物活性片段的核苷酸序列，iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，或iv)在嚴格條件下與i)至iii)的任一雜交的核苷酸序列。在另一個或附加的實施方案中，所述外源多核苷酸編碼以下GPAT，其具有磷酸酶活性，包含SEQ ID N0:225、226和227所提供的一個或多個保守氨基酸序列，或與其至少50%、優選至少60%、更優選至少65%相同的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述一種或多種外源多核苷酸編碼突變MGAT和/或DGAT和/或GPAT。例如，所述一種或多種外源多核苷酸可編碼相對于野生型MGAT和/或DGAT和/或GPAT具有如表I所示的保守氨基酸取代的MGAT和/或DGAT和/或GPAT。在一個實施方案中，所述轉基因非人生物或其部分包含編碼MGAT的第一外源多核苷酸和編碼GPAT的第二外源多核苷酸。所述第一和第二多核苷酸可作為單獨的分子而提供或可作為鄰接的單個分子而提供。在一個優選的實施方案中，GPAT為具有磷酸酶活性的GPAT，諸如擬南芥GPAT4或GPAT6。具有磷酸酶活性的GPAT起到在轉基因非人生物或其部分中催化從G-3-P形成MAG的作用(即，酰化G-3-P形成LPA，隨后移除磷酸酯基團形成MAG)。MGAT然后通過用衍生自脂肪酰基輔酶A的酰基使MAG酰化而起到在轉基因非人生物或其部分中催化DAG形成的作用。MGAT諸如擬南芥MGATl如果也具有DGAT活性還可起到在轉基因非人生物或其部分中催化TAG形成的作用。轉基因非人生物或其部分可包含編碼(例如)DGAT的第三外源多核苷酸。所述第一、第二和第三多核苷酸可作為單獨的分子而提供或可作為鄰接的單個分子而提供。DGAT通過用衍生自脂肪酰基輔酶A的酰基使DAG酰化(優選通過MGAT途徑產生)而起到在轉基因非人生物或其部分中催化TAG形成的作用。在另一個實施方案中，所述轉基因非人生物或其部分包含編碼MGAT的第一外源多核苷酸和編碼DGAT的第二外源多核苷酸。所述第一和第二多核苷酸可作為單獨的分子而提供或可作為鄰接的單個分子而提供。所述轉基因非人生物可包含編碼(例如)GPAT的第三外源多核苷酸，優選為具有磷酸酶活性的GPAT，諸如擬南芥屬GPAT4或GPAT6。所述第一、第二和第三多核苷酸可作為單獨的分子而提供或可作為鄰接的單個分子而提供。在進一步的實施方案中，所述轉基因生物或其部分的所述一種或多種非極性脂質水平和/或所述總非極性脂質含量比不含所述一種或多種外源多核苷酸但包含編碼擬南芥DGATl (SEQ ID NO:83)的外源多核苷酸的相應生物或其部分按重量計高至少0.5%(w/w)和/或在相對的基礎上高至少l%(w/w)。在又一個實施方案中，所述轉基因非人生物或其部分進一步包含一個或多個引入的突變，和/或包含下調所述非人轉基因生物或其部分的內源酶的產生和/或活性的外源多核苷酸，所述內源酶選自DGAT、sn-l GPAT、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基轉移酶(LPAAT)、酰基輔酶A:溶血卵磷脂酰基轉移酶(LPCAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或它們中兩種或更多種的組合。sn-1 GPAT可以為處于野生型狀態時無可檢測的磷酸酶活性的GPAT，例如GPATl或GPAT3。GPATl可具有SEQ ID NO: 202所提供的氨基酸序列，或其同源物。GPAT3可具有SEQ ID N0:203所示的氨基酸序列，或其同源物。

所述外源多核苷酸可以(例如)選自:反義多核苷酸、有義多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA、編碼結合所述內源酶的多肽的多核苷酸，以及雙鏈RNA。另一方面，本發明提供生產提取的脂質的方法，該方法包括以下步驟:i)獲得包含外源單酰基甘油酰基轉移酶(MGAT)的轉基因光養生物或其部分，其中該轉基因光養生物或其部分與不含所述外源MGAT的此種生物或其部分相比具有升高水平的非極性脂質，以及ii)從轉基因光養生物或其部分提取脂質，從而產生提取的脂質。在另一方面，本發明提供包含一種或多種外源多核苷酸的轉基因非人生物或其部分，其中該轉基因非人生物或其部分當與不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應生物或其部分進行比較時具有升高水平的一種或多種非極性脂質。在一個優選的實施方案中，該轉基因非人生物或其部分的總脂質含量與相應的生物或其部分相比時是升高的。所述一種或多種脂質和/或總非極性脂質含量的升高程度可如特征(i)所定義。所述轉基因非人生物或其部分可如特征(ii)所定義。所述非極性脂質可如特征(iii)所定義。所述轉基因非人生物或其部分可通過特征和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的組合所定義。在一個實施方案中，所述轉基因非人生物或其部分的所述一種或多種非極性脂質的水平比相應的生物或其部分按重量計高至少0.5%(w/w)和/或在相對的基礎上高至少1%(w/w),或進一步如特征(i)所定義。在進一步的實施方案中，所述轉基因非人生物或其部分的所述總非極性脂質含量比相應的非人生物或其部分按重量計高至少0.5%(w/w)和/或在相對的基礎上高至少1%(w/w),或進一步如特征(i)所定義。在一個實施方案中，所述轉基因非人生物或其部分或由其提取的脂質的PUFA含量與相應的生物或其部分或由其提取的脂質相比時是升高的。PUFA含量的升高程度可以如特征⑴所定義。在另一個實施方案中，所述轉基因非人生物或其部分或由其提取的脂質中的PUFA的水平與相應的生物或其部分或由其提取的脂質相比時是升高的。PUFA的升高程度可以如特征⑴所定義。在進一步的實施方案中，所述轉基因生物或其部分的所述一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量比不含所述一種或多種外源多核苷酸但包含編碼擬南芥DGATl的外源多核苷酸的相應生物或其部分按重量計高至少0.5%(w/w)和/或在相對的基礎上高至少l%(w/w)。在一個實施方案中，所述轉基因非人生物為植物、藻類或適合發酵的生物諸如酵母或真菌。植物可如特征(ii)所定義。本發明還提供包含編碼以下物質的一種或多種外源多核苷酸的轉基因非人生物:i)MGAT,ii)DGAT2iii)MGAT 和 GPATi V) MGAT 和 DGAT，或V) MGAT、GPAT 和 DGAT。所述轉基因非人生物的特征可進一步在于本文所定義的一個或多個特征。所述一種或多種外源多核苷酸可包含如上所定義的序列。在另一方面，本發明提供獲得產生一種或多種非極性脂質的能力增強的細胞的方法，該方法包括i)向細胞引入編碼以下物質的一種或多種外源多核苷酸a) MGAT，b) DGAT2c) MGAT 和 GPATd) MGAT 和 DGAT，或e) MGAT、GPAT 和 DGAT
其中所述一種或多種外源多核苷酸可操作地連接至一種或多種能夠指導所述一種或多種外源多核苷酸在細胞中表達的啟動子，ii)在細胞中表達所述一種或多種外源多核苷酸，
iii)分析細胞的脂質含量，以及iv)選擇當與不含所述外源多核苷酸的相應細胞相比時具有升高水平的一種或多種非極性脂質的細胞。在一個優選的實施方案中，所選細胞的總脂質含量與相應細胞相比時是升高的。在一個實施方案中，所選細胞的所述一種或多種非極性脂質和/或總非極性脂質含量比相應的細胞按重量計高至少0.5% (w/w)和/或在相對的基礎上高至少l%(w/w)，或進一步如特征Q)所定義。在另一個實施方案中，所選細胞的PUFA含量與相應細胞相比時是升高的。PUFA含量的升高程度可以如特征(i)所定義。在另一個實施方案中，所選細胞中PUFA的水平與相應細胞相比時是升高的。PUFA的升高程度可以如特征(i)所定義。在該方面，所述一種或多種外源多核苷酸可包含如上所定義的序列。進一步地，所述一種或多種外源多核苷酸在本方法前可能并不清楚是否編碼MGAT、DGAT2、MGAT和GPAT、MGAT和DGAT、或MGAT、GPAT以及DGAT，但相反可以為它們的候選物。因此，本方法可用作一種測定法以鑒定或選擇編碼MGAT、DGAT2、MGAT和GPAT(優選地，也具有磷酸酶活性的GPAT) ,MGAT和DGAT、或MGAT、GPAT (優選地，也具有磷酸酶活性的GPAT)以及DGA的多核苷酸。GPAT的表達在GPAT也具有磷酸酶活性時可導致細胞中的MAG水平升高，MGAT的表達可導致細胞中的DAG水平升高，而DGAT的表達可導致細胞中的TAG水平的升高。MGAT的表達在MGAT也具有DGAT活性時還可導致細胞中的TAG水平升高。MGAT和DGAT的表達可導致細胞中的DAG和/或TAG水平升高。MGAT和GPAT的表達可導致細胞中的MAG (如果GPAT也具有磷酸酶活性)和/或DAG水平升高。MGAT和GPAT的表達在MGAT也具有DGAT活性時還可導致細胞中的TAG水平升高。MGAT、GPAT和DGAT的表達可導致細胞中的MAG (如果GPAT也具有磷酸酶活性)和/或DAG和/或TAG水平升高。在一個實施方案中，所選的細胞為根據本發明的細胞。在一個實施方案中，所述外源多核苷酸穩定整合到細胞基因組中。本方法可進一步包括從細胞再生轉基因生物和/或從細胞獲得子代(例如獲得種子)的步驟，這些步驟可在步驟i)之后的任何時間點進行。在一個備選實施方案中，所述外源多核苷酸在細胞中瞬時表達。在另一方面，本發明提供使用本發明的方法獲得的轉基因細胞或植物，或其子代。在另一方面，本發明提供編碼以下物質的一種或多種外源多核苷酸i)MGAT,ii)DGAT2iii)MGAT 和 GPATi V) MGAT 和 DGAT，或V) MGAT、GPAT 和 DGAT，用于產生當與不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應生物或其部分相比時具有增強的產生一種或多種非極性脂質的能力的轉基因非人生物或其部分的用途。能力的增強程度可以如特征(i)所定義。所述轉基因 非人生物或其部分可如特征(ii)所定義，或可通過特征(i)、(ii)和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的組合所定義。所述一種或多種外源多核苷酸可包含如上所定義的序列。在另一方面，本發明提供植物的轉基因種子，該種子包含一種或多種外源多核苷酸并與不含所述外源多核苷酸的相應種子相比具有升高的一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量。升高的程度可以如特征⑴所定義。所述轉基因種子可來自如特征(ii)所定義的屬和/或種。所述轉基因種子可通過特征和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的組合所定義。所述一種或多種外源多核苷酸可包含如上所定義的序列。在另一方面，本發明提供產生本發明的種子的轉基因植物。所述轉基因植物可以為例如蕓苔屬、陸地棉、亞麻、向日葵屬、紅花、大豆、玉米、擬南芥、兩色高梁、高粱、燕麥、三葉草屬、油棕、本氏煙、大麥、羽扇豆、亞洲栽培稻、光稃稻、亞麻薺、異源三倍體芒草奇崗或中國芒。在另一方面，本發明提供生產種子的方法，該方法包括:i)使本發明的轉基因植物生長，以及ii)收獲種子。在另一方面，本發明提供發酵方法，包括以下步驟:i)提供含有液體組合物的容器以及發酵和脂肪酸生物合成所需的成分，所述液體組合物包含適合發酵的本發明的轉基因非人生物，以及ii)提供有利于所 述容器中所含的所述液體組合物發酵的條件。在另一方面，本發明提供可通過本發明的方法、本發明的轉基因非人生物、本發明的轉基因細胞、本發明的轉基因植物或本發明的轉基因種子獲得的提取的脂質。該可提取脂質具有升高的TAG含量、DAG含量、TAG和DAG含量、MAG含量、PUFA含量、或具體PUFA含量和/或總非極性脂質含量。在一個優選的實施方案中，MAG為2-MAG。TAG含量、DAG含量、TAG和DAG含量、MAG含量、PUFA含量、具體PUFA含量和/或總非極性脂質含量的升高程度可如特征(i)所定義。本發明還提供所含的DAG含量按總提取脂質的重量計為至少l%(w/w)或至少2%(w/w)的提取脂質。優選地，提取脂質還包含可檢測水平的MAG。在一個實施方案中，提取脂質為油菜、玉米、大豆、羽扇豆、花生、向日葵、棉花、紅花或亞麻油。脂質可以包含可檢測水平的芥酸、環丙烯脂肪酸(CPFA)和/或硫代葡糖苷。本發明還提供本發明的轉基因非人生物或其部分、本發明的轉基因細胞、本發明的轉基因植物、本發明的轉基因種子或本發明的提取脂質的用途，以制造工業產品。該工業產品可以(例如)為燃料。燃料可包含最低水平的根據本發明的提取脂質，諸如至少10%、至少20%或至少30% (w/w)。在另一方面，本發明提供生產燃料的方法，該方法包括:i)任選地在存在催化劑的情況下使本發明的脂質與醇反應以產生烷基酯，以及ii)任選地將烷基酯與基于石油的燃料共混。在一個實施方案中，烷基酯為甲酯。本方法生產的燃料可包含最低水平的本發明的脂質，諸如至少10%、至少20%或至少30%(w/w)。在另一方面，本發明提供生產飼料的方法，該方法包括將本發明的轉基因非人生物或其部分、本發明的轉基因細胞、本發明的轉基因植物、本發明的轉基因種子、或本發明的提取脂質、或其提取物或部分與至少一種其他食物成分混合。在另一方面，本發明提供飼料、化妝品或化學品，它們包含本發明的轉基因非人生物或其部分、本發明的轉基因細胞、本發明的轉基因植物、本發明的轉基因種子、或本發明的提取脂質、或其提取物或部分。在另一方面，本發明提供鑒定以下核酸分子的方法，該核酸分子編碼在細胞中產生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基轉移酶，該方法包括:i)獲得包含可操作地連接到在細胞中具有活性的啟動子的核酸分子的細胞，其中該核酸分子包含如本文所定義的核苷酸序列和/或編碼具有SEQ ID NO:220、221、222、223、224、225、226和227所提供的一種或多種氨基酸序列或與其至少50%、優選至少60%、更優選至少65%相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，ii)確定在細胞中產生的MAG、DAG和/或TAG的水平當與不含所述核酸的相應細胞相比時是否是升高的，以及iii)鑒定編碼在細胞中產生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基轉移酶的核酸分子。在一個實施方案中，該核酸分子包含編碼SEQ ID NO: 220、221、222、223和224所提供的一種或多種保守DGAT2和/或MGAT1/2氨基酸序列的核苷酸序列。在一個優選的實施方案中，該核酸分子包含編碼SEQ ID NO: 220和/或SEQ ID NO: 224所提供的保守氨基酸序列的核苷酸序列。在另一個或附加的實施方案中，該核酸分子包含編碼SEQ ID N0:225、226和227所提供的一種或多種保守GPAT氨基酸序列，或與其至少50%、優選至少60%、更優選至少65%相同的氨基酸序列的核苷酸序列。在一個實施 方案中，本方法用于鑒定具有增強的產生DAG和/或TAG的能力的MGAT。在另一個實施方案中，本方法用于鑒定具有磷酸酶活性和增強的產生MAG的能力的GPAT。在一個優選的實施方案中，本方法用于鑒定具有磷酸酶活性和增強的產生2-MAG的能力的sn-2 GPAT。在另一個實施方案中，本方法用于鑒定一起具有增強的產生MAG和/或DAG和/或TAG (優選TAG)的能力的MGAT和GPAT。在一個優選的實施方案中，本方法用于鑒定具有產生2-MAG的磷酸酶活性并與MGAT —起具有增強的產生sn_l，2/2，3 DAG和/或TAG的能力的 sn-2 GPAT。在另一個實施方案中，本方法用于鑒定具有增強的產生TAG的能力的DGAT。在另一個實施方案中，本方法用于鑒定一起具有增強的產生DAG和/或TAG (優選TAG)的能力的MGAT和DGAT。在另一個實施方案中，本方法用于鑒定一起具有增強的產MAG和/或DAG和/或TAG (優選TAG)的能力的MGAT、GPAT和DGAT。在一個優選的實施方案中，GPAT具有磷酸酶活性以產生MAG。在一個進一步優選的實施方案中，GPAT為具有產生2-MAG的磷酸酶活性的 sn-2 GPAT0在一個實施方案中，本方法進一步包括在步驟i)前向細胞中引入核酸分子。在另一個實施方案中，本發明進一步包括由步驟i)的細胞再生轉基因植物以及任選地從轉基因植物獲得種子的步驟。在一個實施方案中，該細胞為植物細胞。產生MAG和/或DAG和/或TAG的能力的升高程度可如特征(i)所定義。在一個優選的實施方案中，MAG為2-MAG。細胞可來自如特征(ii)所定義的屬和/或種。細胞可通過特征(i)、(ii)和(iii)，或特征(i)和(ii)，或特征(i)和(iii)的組合所定義。在另一個實施方案中，MGAT和/或GPAT和/或DGAT在細胞中提高TAG的產生的量高于擬南芥DGATl (SEQ ID NO:83)。在另一方面，本發明提供分離的和/或重組的多核苷酸，其包含:i)選自SEQ ID NO:1至6任一者的核苷酸序列，或ii)與i)至少80%相同的核苷酸序列。在另一方面,本發明提供包含本發明的多核苷酸的載體。在另一方面，本發明提供包含本發明的多核苷酸或本發明的載體的轉基因細胞。在另一方面，本發明提供包含本發明的多核苷酸、本發明的載體或本發明的轉基因細胞的轉基因非人生物或其部分。在一個實施方案中，所述轉基因生物為植物、藻類或適合發酵的生物諸如酵母或真菌。在另一個實施方案中，所述部分為植物的種子、果實、塊莖、根或營養部分。本領域技術人員將會認識到，在不脫離廣義描述的本發明范圍的情況下，可以對具體實施方案中所示的發明進行多種變型和/或修改。因此，本實施方案在所有方面都應視為示例性而非限制性的。本文所述的每個實施方案加以必要的變通將適用于各個其他實施方案，除非另外特別說明。在本說明書全文中，詞語“包含”或變型形式諸如“包括”或“含有”將被理解為意在包含所述的要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟的群組，但不排除任何其他要素、整數或步驟，或要素、整數或步驟的群組。術語“和/或”例如“X和/或Y”應被理解為表示“X和Y”或“X或Y”，并且應當用來明確支持兩種含義或任一種含義。附圖簡沭圖1.各種脂質合成途徑的圖示，它們中的大多數均在DAG處匯合，DAG是脂質合成中的中心分子。該模型包括一條形成sn-2 MAG的可能路線，而sn-2 MAG可被雙官能MGAT/DGAT用于由甘油-3-磷酸(G-3-P)形成DAG。縮寫如下:G-3-P:甘油-3-磷酸LysoPA:溶血磷脂酸PA:磷脂酸MAG:單酰基甘油DAG: 二酰基甘油TAG:三酰基甘油酰基-Cok和FA-CoA:酰基輔酶A和脂肪酰基輔酶APC:磷脂酰膽堿GPAT:甘油-3-磷酸酰基轉移酶； 甘油-3-磷酸O-酰基轉移酶；酰基輔酶A:sn_甘油-3-磷酸1-0-酰基轉移酶；EC 2.3.1.15
GPAT4:甘油_3_磷酸酰基轉移酶4GPAT6:甘油_3_磷酸酰基轉移酶6LPAAT: 1-酰基-甘油_3_磷酸酰基轉移酶；1_酰基甘油_3_磷酸O-酰基轉移酶；酰基輔酶A: 1-酰基-sn-甘油-3-磷酸2-0-酰基轉移酶；EC 2.3.1.51PAP:磷脂酸磷酸酶；磷脂酸磷酸酯酶；磷脂酸磷酸水解酶；磷脂酸磷酸酶；EC3.1.3.4MGAT:一種具有單酰基甘油酰基轉移酶(MGAT ;2_酰基甘油O-酰基轉移酶酰基輔酶A:2-酰基甘油O-酰基轉移酶；EC 2.3.1.22)活性的酰基轉移酶M/DGAT:一種具有單酰基甘油酰基轉移酶(MGAT ;2_酰基甘油O-酰基轉移酶；酰基輔酶A:2-酰基甘油O-酰基轉移酶；EC 2.3.1.22)和/或二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT ;二酰基甘油O-酰基轉移酶；酰基輔酶A:1, 2- 二酰基-sn-甘油O-酰基轉移酶；EC2.3.1.20)活性的酰基轉移酶LPCAT:酰基輔酶A:溶血卵磷脂酰基轉移酶；1_酰基甘油磷酸膽堿O-酰基轉移酶；酰基輔酶A: 1-酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿O-酰基轉移酶；EC 2.3.1.23PLD-Z:磷脂酶D zeta ;膽堿磷酸酶；卵磷脂酶D ;磷脂二酯酶II ；EC 3.1.4.4CPT:CDP_膽堿:二酰基甘油膽堿磷酸轉移酶；1-烷基-2-酰基甘油膽堿磷酸轉移酶；烷基酰基甘油膽堿磷酸轉移酶；膽堿磷酸轉移酶；磷酰膽堿甘油酯轉移酶；EC 2.7.8.2
PDCT:磷脂酰膽堿:二酰基甘油膽堿磷酸轉移酶PLC:磷脂酶 C ；EC 3.1.4.3PDAT:磷脂:二酰基甘油酰基轉移酶；磷脂:1，2- 二酰基-sn_甘油O-酰基轉移酶；EC 2.3.1.158P1:無機磷酸鹽圖2.在用編碼pl9 (陰性對照)、擬南芥DGATl、小家鼠(Mus musculus)MGATl以及DGATl與MGATl的組合(每一者均由35S啟動子表達)的構建體轉化的本氏煙葉子組織中的相對DAG和TAG升高。在促進葉子組織中DAG和TAG兩者的積聚方面，MGATl酶遠比DGATl酶的活性高。與僅DGATl的表達相比，MGATl基因的表達導致了葉子組織中DAG和TAG的積聚達兩倍之多。圖3.在用編碼pl9 (陰性對照)、擬南芥DGATl、小家鼠MGAT2以及MGAT2與DGATl組合的構建體轉化的本氏煙葉子組織中的相對TAG升高。誤差條表示三個平行樣品的標準誤差。圖4.從供給sn-2_MAG[14C]和未標記油酸的瞬時轉化的本氏煙葉子裂解物中分離的MG、DAG和TAG級分隨時間進程的放射性(DPM)。所用的構建體如圖3所示。圖5.如圖4所示，但供給[14C]G-3_P和未標記的油酸。圖6.TLC板的放射自顯影圖，顯示了在酵母測定中通過擬南芥DGATl和小家鼠MGATl但非小家鼠MGAT2形成TAG。該測定如實施例5所述。序列表的標注SEQ ID NO:1 小家鼠(Mus musculus)密碼子優化的 MGATlSEQ ID NO:2小家鼠密碼子優化的MGAT2SEQ ID N0:3 玻璃海鞘(Ciona intestinalis)密碼子優化的預測 MGATl
SEQ ID N0:4 赤擬谷盜(Tribolium castaneum)密碼子優化的預測 MGATl
SEQ ID N0:5 斑馬魚(Danio rerio)密碼子優化的 MGATlSEQ ID NO:6斑馬魚密碼子優化的MGAT2SEQ ID N0:7 小家鼠 MGATl 多核苷酸(AF384162)SEQ ID N0:8 智人(Homo spaniens)MGATl 多核苷酸(AF384163)SEQ ID N0:9黑猩猩(Pan troglodytes)預測MGATl多核苷酸轉錄變體(XMJ)Ol 166055)SEQ ID NO: 10黑猩猩預測MGATl多核苷酸轉錄變體2 (XM_0526044.2)SEQ ID NO: 11 家犬(Canis familiar is)預測 MGATl 多核苷酸(XM_545667.2)SEQ ID NO: 12 家牛(Bos taurus)MGATl 多核苷酸(NM_001001153.2)SEQ ID NO: 13 褐家鼠(Rattus norvegicus)MGATl 多核苷酸(NM_001108803.1)SEQ ID NO: 14 斑馬魚 MGATl 多核苷酸(ΝΜ_001122623.1)SEQ ID NO: 15 秀_ 隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)預測 MGATl 多核苷酸(NM_073012.4)SEQ ID NO: 16秀麗隱桿線蟲預測MGATl多核苷酸(NM_182380.5)SEQ ID NO: 17秀麗隱桿線蟲預測MGATl多核苷酸(NM_065258.3)SEQ ID NO: 18秀麗隱桿線蟲預測MGATl多核苷酸(NM_075068.3)SEQ ID NO: 19秀麗隱桿線蟲預測MGATl多核苷酸(NM_072248.3)SEQ ID N0:20 乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)預測 MGATl 多核苷酸(XM_455588.1)SEQ ID NO:21 棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)預測 MGATl 多核苷酸(NM_208895.1)SEQ ID NO:22 稻痕病菌(Magnaporthe oryzae)預測 MGATl 多核苷酸(ΧΜ_368741.I)SEQ ID NO:23 玻璃海鞘預測 MGATl 多核苷酸(ΧΜ_002120843.1)SEQ ID NO:24 小家鼠 MGAT2 多核苷酸(ΑΥ157609)SEQ ID NO: 25 智人 MGAT2 多核苷酸(ΑΥ157608)SEQ ID NO:26 黑猩猩預測 MGAT2 多核苷酸(ΧΜ_522112.2)SEQ ID NO:27 家犬預測 MGAT2 多核苷酸(ΧΜ_542304.1)SEQ ID NO:28 家牛 MGAT2 多核苷酸(ΝΜ_001099136.I)SEQ ID NO:29 褐家鼠 MGAT2 多核苷酸(ΝΜ_001109436.2)SEQ ID NO: 30 紅原雞(Gallus gallus)預測 MGAT2 多核苷酸(XM_424082.2)SEQ ID N0:31 斑馬魚 MGAT2 多核苷酸(ΝΜ_001006083.1)SEQ ID NO:32 黑腹果妮(Drosophila melanogaster)MGAT2 多核苷酸(NM_136474.2)SEQ ID NO: 33 黑腹果蠅 MGAT2 多核苷酸(NM_136473.2)SEQ ID NO: 34 黑腹果蠅 MGAT2 多核苷酸(NM_136475.2)SEQ ID NO:35 網比亞按蚊(Anopheles gambiae)MGAT2 多核昔酸(ΧΜ_001688709.1)
SEQID NO:36 岡比亞按蚊 MGAT2 多核苷酸(XM_315985)SEQID NO:37 赤擬谷盜預測 MGAT2 多核苷酸(XM_970053.1)SEQID NO: 38 智人 MGAT3 多核苷酸(AY229854)SEQID NO: 39黑猩猩預測MGAT3多核苷酸轉錄變體I (XMJ)Ol 154107.1)SEQID NO: 40黑猩猩預測MGAT3多核苷酸轉錄變體2 (XM_001154171.1)SEQID NO: 41黑猩猩預測MGAT3多核苷酸轉錄變體3 (XM_527842.2)SEQID NO:42 家犬預測 MGAT3 多核苷酸(ΧΜ_845212.I)SEQID NO:43 家牛預測 MGAT3 多核苷酸(ΧΜ_870406.4)SEQID NO:44 斑馬魚預測 MGAT3 多核苷酸(ΧΜ_688413.4)SEQID NO:45 小家鼠 MGATl 多肽(ΑΑΚ84177.1)SEQID NO:46 智人 MGATl 多肽(ΑΑΚ84178.1)SEQID NO:47 黑猩猩預測 MGATl 多肽同種型 I (XPJ)Ol 166055.1)SEQID NO: 48 黑猩猩預測 MGATl 多肽同種型 2 (ΧΡ_526044.2)SEQID NO:49 家犬預測 MGATl 多肽(ΧΡ_545667.2)SEQID NO:50 家牛 MGATl 多肽(ΝΡ_001001153.1)SEQID NO:51 褐家鼠 MGATl 多肽(ΝΡ_001102273.1)SEQID NO: 52 斑馬魚 MGATl 多肽(ΝΡ_001116095.1)SEQID NO:53 秀麗隱桿線蟲預測 MGATl 多肽(ΝΡ_505413.1)SEQID NO: 54 秀麗隱桿線蟲預測 MGATl 多肽(ΝΡ_872180.1)SEQID NO:55 秀麗隱桿線蟲預測 MGATl 多肽(ΝΡ_497659.1)SEQID NO:56 秀麗隱桿線蟲預測 MGATl 多肽(ΝΡ_507469.1)SEQID NO:57 秀麗隱桿線蟲預測 MGATl 多肽(ΝΡ_504649.1)SEQID NO:58 乳酸克魯維酵母預測 MGATl 多肽(ΧΡ_455588.1)SEQID NO:59 棉阿舒囊霉預測 MGATl 多肽(ΝΡ_983542.1)SEQID NO:60 稻瘟病菌預測 MGATl 多肽(ΧΡ_368741.I)SEQID Ν0:61 玻璃海鞘預測 MGATl 多肽(ΧΡ_002120879)SEQID NO:62 小家鼠 MGAT2 多肽(ΑΑ023673.1)SEQID NO:63 智人 MGAT2 多肽(ΑΑ023672.1)SEQID NO:64 黑 猩猩預測 MGAT2 多肽(ΧΡ_522112.2)
SEQID NO:65 家犬預測 MGAT2 多肽(ΧΡ_542304.I)SEQID NO:66 家牛 MGAT2 多肽(NPJ)OlO926O6.1)SEQID NO:67 褐家鼠 MGAT2 多肽(ΝΡ_001102906.2)SEQID NO:68 紅原雞預測 MGAT2 多肽(ΧΡ_424082.2)SEQID NO:69 斑馬魚 MGAT2 多肽(ΝΡ_001006083.1)SEQID NO: 70 黑腹果蠅 MGAT2 多肽(ΝΡ_610318.I)SEQID NO: 71 黑腹果蠅 MGAT2 多肽(ΝΡ_610317.I)SEQID NO: 72 黑腹果蠅 MGAT2 多肽(ΝΡ_610319.2)SEQID NO: 73 岡比亞按蚊 MGAT2 多肽(ΧΡ_001688761)SEQID NO: 74 岡比亞按蚊 MGAT2 多肽(ΧΡ_315985.3)
SEQ ID NO:75 赤擬谷盜預測 MGAT2 多肽(XP_975146)SEQ ID NO:76 智人 MGAT3 多肽(AA063579.1)SEQ ID NO: 77 黑猩猩預測 MGAT3 多肽同種型 I (XPJ)Ol 154107.1)SEQ ID NO: 78 黑猩猩預測 MGAT3 多肽同種型 2 (ΧΡ_001154171.I)SEQ ID NO: 79 黑猩猩預測 MGAT3 同種型 3 (ΧΡ_527842.2)SEQ ID NO:80 家犬預測 MGAT3 多肽(ΧΡ_850305.I)SEQ ID NO:81 家牛預測 MGAT3 多肽(ΧΡ_875499.3)SEQ ID NO:82 斑馬魚預測 MGAT3 多肽(ΧΡ_693505.I)SEQ ID NO:83 擬南芥 DGATl 多肽(CAB44774.1)SEQ ID NO:84 擬南芥 GPAT4 多核苷酸(ΝΜ_100043.4)SEQ ID NO:85 擬南芥 GPAT6 多核苷酸(ΝΜ_129367.3)SEQ ID Ν0:86 擬南芥 BAC F5I10 多核苷酸(AF195115.1)SEQ ID Ν0:87擬南 芥未知蛋白多核苷酸(ΑΥ062466.1)SEQ ID NO:88亞洲栽培稻染色體3多核苷酸(AC118133.4)SEQ ID NO:89 北美云杉(Picea sitchensis)克隆 WS0276_F13 多核苷酸(EF086095.1)SEQ ID NO:90 玉米克隆 ZM_BFc0110Al 多核苷酸(BT067649.1)SEQ ID N0:91 擬南芥克隆 RAFL16-19-H05 多核苷酸(AK228870.1)SEQ ID NO:92 亞洲栽培稻克隆 J065058J01 多核苷酸(AK241033.1)SEQ ID NO:93亞洲栽培稻染色體2多核苷酸(CM000127.1)SEQ ID NO:94亞洲栽培稻染色體5多核苷酸(CM000130.1)SEQ ID NO:95亞洲栽培稻染色體2多核苷酸(CM000139.1)SEQ ID NO:96亞洲栽培稻染色體I多核苷酸(CM000126.1)SEQ ID NO:97亞洲栽培稻染色體3多核苷酸(CM000128.1)SEQ ID NO:98亞洲栽培稻染色體3多核苷酸(CM000140.1)SEQ ID N0:99江南卷柏(Selaginella moellendorffii) SELM0scaffold_102 多核苷酸(GL377667.1)SEQ ID NO: 100 江南卷柏 SELMOscaffold_102 多核苷酸(GL377667.1)SEQ ID NO: 101 江南卷柏 SELMOscaffold_83 多核苷酸(GL377648.1)SEQ ID NO: 102 江南卷柏 SELMOscaffold_57 多核苷酸(GL377622.1)SEQ ID NO: 103 江南卷柏 SELMOscaffold_25 多核苷酸(GL377590.1)SEQ ID NO: 104 江南卷柏 SELMOscaffold_lI 多核苷酸(GL377576.1)SEQ ID NO: 105 江南卷柏 SELMOscaffoId_lI 多核苷酸(GL377576.1)SEQ ID NO: 106 亞洲栽培稻 0s01g0855000 多核苷酸(NM_001051374.2)SEQ ID NO: 107 亞洲栽培稻 0s02g0114400 多核苷酸(ΝΜ_001052203.1)SEQ ID NO: 108:玉米 GPAT8 多核苷酸(ΝΜ_001153970.1)SEQ ID NO: 109:玉米 L0C100282930 多核苷酸(NM_001155835.1)SEQ ID NO: 110:玉米 L0C100382119 多核苷酸(NMJ)Ol 174880.1)SEQ ID NO: 111 擬南芥 GPAT6 多核苷酸(NM_129367.3)
SEQ ID NO: 112 擬南芥 GPAT8 多核苷酸(NM_116264.5)SEQ ID NO: 113 小立碗蘚(Physcomitrella patens)預測蛋白(PHYPADRAFT_128739)多核苷酸(ΧΜ_001764949.1)SEQ ID NO: 114小立碗蘚預測蛋白(PHYPADRAFT_83824)多核苷酸(ΧΜ_001769619.I)SEQ ID NO: 115小立碗蘚預測蛋白(PHYPADRAFT_188308)多核苷酸(XMJ)01769672.1)SEQ ID NO: 116小立碗蘚預測蛋白(PHYPADRAFT_189499)多核苷酸(ΧΜ_001771134.1)SEQ ID NO: 117小立碗蘚預測蛋白(PHYPADRAFT_95487)多核苷酸(XMJ)01780481.1)SEQ ID NO: 118 葡萄(Vitis Vinifera)預測蛋白 L0G100243321 多核苷酸(XM_002268477.1)SEQ ID NO: 119 葡萄預測蛋白 L0C100243093 多核苷酸(ΧΜ_002275312.I)SEQ ID NO: 120 葡萄預測蛋白 L0C100259433 多核苷酸(ΧΜ_002275996.I)SEQ ID NO: 121 葡萄預測蛋白 L0C100264832 多核苷酸(ΧΜ_002279055.I)SEQ ID NO: 122 毛果楊(Populus trichocarpa)預測蛋白多核苷酸(XM_002309088.1)SEQ ID NO: 123毛果楊預測蛋白多核苷酸(XM_002309240.1)SEQ ID NO: 124毛果楊預測蛋白多核苷酸(XM_002322716.1)SEQ ID NO: 125毛果楊預測蛋白多核苷酸(XM_002323527.1)SEQ ID NO: 126 兩色高梁蛋白多核苷酸(XM_002439842.1)SEQ ID NO: 127 兩色高梁蛋白多核苷酸(XM_002458741.1)SEQ ID NO: 128 兩色高梁蛋白多核苷酸(XM_002463871.1)SEQ ID NO: 129 兩色高梁蛋白多核苷酸(XM_002464585.1)SEQ ID NO: 130蓖麻(Ricinus communis)ER甘油憐酸酸基轉移酶多核苷酸(XM_002511827.1)SEQ ID NO: 131蓖麻ER甘油磷酸酰基轉移酶多核苷酸(XM_002517392.1)SEQ ID NO: 132蓖麻ER甘油磷酸酰基轉移酶多核苷酸(XM_002520125.1)SEQ ID NO: 133琴葉擬南芥(Arabidopsis Iyrata)磷脂/甘油酰基轉移酶家族蛋白多核苷酸(XM_002872909.1)SEQ ID NO: 134 琴葉擬南芥 GPAT6 多核苷酸(XM_002881518.1)SEQ ID N0135 油桐(Vernicia fordii)推定 GPAT8 多核苷酸(FJ479753.1)SEQ ID NO 136 亞洲栽培稻 0s03g0735900 多核苷酸(ΝΜ_001057724.1)SEQ ID N0137 擬南芥 GPAT4 多核苷酸(ΝΜ_100043.4)SEQ ID Ν0138毛果楊預測蛋白多核苷酸(ΧΜ_002320102.1)SEQ ID NO: 139 兩色高梁蛋白多核苷酸(ΧΜ_002451332.1)SEQ ID NO: 140蓖麻ER甘油磷酸酰基轉移酶多核苷酸(ΧΜ_002531304.1)SEQ ID NO: 141 琴葉擬南芥 GPAT4 多核苷酸(ΧΜ_002889315.1)
SEQIDNO: 142 擬南芥 GPATl 多核苷酸(ΝΜ_100531.2)SEQIDNO 143 擬南芥 GPAT3 多核苷酸(NM_116426.2)SEQIDNO: 144 擬南芥 GPAT4 多肽(NP_171667.1)SEQIDNO: 145 擬南芥 GPAT6 多肽(NP_181346.1)SEQIDNO: 146 擬南芥 F5I10.4 基因產物多肽(AAF02784.1)SEQIDNO: 147 擬南芥未知蛋白多肽(AAL32544.1)SEQIDNO: 148 亞洲栽培稻蛋白多肽(AAP03413.1)SEQIDNO: 149 北美云杉未知多肽(ABK25381.1)SEQIDNO: 150 玉米未知多肽(ACN34546.1)SEQNOID: 151 擬南芥預測蛋白多肽(BAF00762.1)SEQIDNO: 152亞洲栽培稻未命名蛋白產物多肽(BAH00933.1)SEQIDNO: 153 亞洲栽培稻預測蛋白 0sl_05566 多肽(EAY84189.1)SEQIDNO: 154 亞洲栽培稻預測蛋白 0sl_20155 多肽(EAY98245.1)SEQIDNO: 155 亞洲栽培稻預測蛋白 0sJ_05094 多肽(EAZ21484.1)
SEQIDNO: 156 亞洲栽培稻預測蛋白 0sl_04478 多肽(EEC71826.1)SEQIDNO: 157 亞洲栽培稻預測蛋白 0sl_13423 多肽(EEC76137.1)SEQIDNO: 158 亞洲栽培稻預測蛋白 0sJ_12482 多肽(EEE59882.1)SEQIDNO: 159 江南卷柏預測蛋白 SELM0DRAFT_269600 多肽(EFJ08963.1)SEQIDNO: 160 江南卷柏預測蛋白 SELM0DRAFT_184962 多肽(EFJ08964.1)SEQIDNO: 161 江南卷柏預測蛋白 SELM0DRAFT_235331 多肽(EFJ11200.1)SEQIDNO: 162 江南卷柏預測蛋白 SELM0DRAFT_118155 多肽(EFJ15664.1)SEQIDNO: 163 江南卷柏預測蛋白 SELM0DRAFT_102257 多肽(EFJ24086.1)SEQIDNO: 164 江南卷柏預測蛋白 SELM0DRAFT_170164 多肽(EFJ29816.1)SEQIDNO: 165 江南卷柏預測蛋白 SELM0DRAFT_170165 多肽(EFJ29817.1)SEQIDNO: 166 亞洲栽培稻 0s01g0855000 多肽(ΝΡ_001044839.1)SEQIDNO: 167 亞洲栽培稻 0s02g0114400 多肽(ΝΡ_001045668.1)SEQIDNO: 168 玉米 GPAT8 多肽(NP_001147442.1)SEQIDNO: 169 玉米 L0C100282930 多肽(NP_001149307.1)SEQIDNO: 170 玉米蛋白 L0C100382119 多肽(NP_001168351.1)SEQIDNO: 171 擬南芥 GPAT6 多肽(NP_181346.1)SEQIDNO: 172 擬南芥 GPAT8 多肽(ΝΡ_191950.2)SEQIDNO: 173 小立碗蘚蛋白多肽(ΧΡ_001765001.1)SEQIDNO: 174 小立碗蘚蛋白多肽(ΧΡ_001769671.1)SEQIDNO: 175 小立碗蘚蛋白多肽(ΧΡ_001769724.1)SEQIDNO: 176 小立碗蘚蛋白多肽(ΧΡ_001771186.1)SEQIDNO: 177 小立碗蘚蛋白多肽(ΧΡ_001780533.I)SEQIDNO: 178 葡萄蛋白多肽(ΧΡ_002268513.1)SEQIDNO: 179 葡萄蛋白多肽(ΧΡ_002275348.I)SEQIDNO: 180 葡萄蛋白多肽(ΧΡ_002276032.I)
SEQIDNO: 181 葡萄蛋白多肽(XP_002279091.1)SEQIDNO: 182 毛果楊蛋白多肽(XP_002309124.1)SEQIDNO: 183 毛果楊蛋白多肽(ΧΡ_002309276.I)SEQIDNO: 184 毛果楊蛋白多肽(ΧΡ_002322752.I)SEQIDNO: 185 毛果楊蛋白多肽(ΧΡ_002323563.I)SEQIDNO: 186 兩色高梁蛋白 S0RBIDRAFT_09g022020 多肽(ΧΡ_002439887.I)SEQIDNO: 187 兩色高梁蛋白 S0RBIDRAFT_03g040260 多肽(ΧΡ_002458786.I)SEQIDNO: 188 兩色高梁蛋白 S0RBIDRAFT_01g008880 多肽(ΧΡ_002463916.I)SEQIDNO: 189 兩色高梁蛋白 S0RBIDRAFT_01g022140 多肽(ΧΡ_002464630.I)SEQIDNO: 190蓖麻ER甘油磷酸酰基轉移酶多肽(ΧΡ_002511873.I)SEQIDNO: 191蓖麻ER甘油磷酸酰基轉移酶多肽(ΧΡ_002517438.1)SEQIDNO: 192蓖麻ER甘油磷酸酰基轉移酶多肽(ΧΡ_002520171.I)SEQIDNO: 193琴葉擬南芥磷脂/甘油酰基轉移酶家族蛋白多肽(ΧΡ_002872955.1)SEQIDNO: 194 琴葉擬南芥 GPAT6 多肽(ΧΡ_002881564.I)SEQIDNO: 195 油桐推定 GPAT 多肽(ACT32032.1)SEQIDNO: 196 亞洲栽培稻 0s03g0735900 多肽(ΝΡ_001051189.1)SEQIDNO: 197 擬南芥 GPAT4 多肽(NP_171667.1)SEQIDNO: 198 毛果楊蛋白多肽(ΧΡ_002320138.I)SEQIDNO: 199 兩色高梁蛋白 SORBIDRAFTJMgOO 1060 多肽(ΧΡ_002451377.I)SEQIDNO: 200蓖麻ER甘油磷酸酰基轉移酶多肽(ΧΡ_002531350.I)SEQIDNO: 201 琴葉擬南芥 GPAT4 多肽(ΧΡ_002889361.1)SEQIDNO: 202 擬南芥 GPATl 多肽(ΝΡ_563768.1)SEQIDNO: 203 擬南芥 GPAT3 多肽(ΝΡ_192104.1)SEQIDNO: 204 擬南芥 DGAT2 多核苷酸(MLll5OlL3)SEQIDNO: 205 蓖麻 DGAT2 多核苷酸(ΑΥ916129.1)SEQIDNO:206 油桐 DGAT2 多核苷酸(DQ356682.1)SEQIDNO:207 拉曼被抱霉(Mortierella ramanniana)DGAT2 多核苷酸(AF391089.1)SEQIDNO: 208 智人 DGAT2 多核苷酸(ΝΜ_032564.I)SEQIDNO: 209 智人 DGAT2 多核苷酸(ΝΜ_001013579.2)SEQIDNO:210 家牛 DGAT2 多核苷酸(ΝΜ_205793.2)SEQIDNO:211 小家鼠 DGAT2 多核苷酸(AF384160.1)SEQIDNO: 212 擬南芥 DGAT2 多肽(ΝΡ_566952.I)SEQIDΝ0:213 蓖麻 DGAT2 多肽(AAY16324.1)SEQIDNO:214 油桐 DGAT2 多肽(ABC94474.1)SEQIDNO:215 拉曼被孢霉 DGAT2 多肽(AAK84179.1)
SEQIDNO: 216 智人 DGAT2 多肽(Q96PD7.2)SEQIDNO: 217 智人 DGAT2 多肽(Q58HT5.1)
SEQ ID NO:218 家牛 DGAT2 多肽(Q70VZ8.1)SEQ ID NO:219 小家鼠 DGAT2 多肽(AAK84175.1)SEQ ID NO: 220YFP 三肽保守 DGAT2 和 / 或 MGAT1/2 序列基序SEQ ID NO: 22IHPHG 四肽保守 DGAT2 和 / 或 MGAT1/2 序列基序SEQ ID NO:222EPHS四肽保守植物DGAT2序列基序SEQ ID NO: 223作為推定甘油磷脂結構域一部分的DGAT2的RXGFX (K/R)XAXXXGXXX (L/V) VPXXXFG (E/Q)長保守序列基序SEQ ID NO: 224作為推定中性脂質結合結構域的小鼠DGAT2和MGAT 1/2的FLXLXXXN保守序列基序SEQ ID NO: 225GPAT 的 plsC 酰基轉移酶結構域(PR)1553)SEQ ID NO: 226G PAT的HAD樣水解酶(PF12710)超家族結構域SEQ ID NO: 227磷酸絲氨酸磷酸酶結構域(PR)0702).GPAT4-8包含與此結構域同源的N端區域SEQ ID NO: 228 保守 GPAT 氨基酸序列⑶LVICPEGTTCREPSEQ ID NO: 229保守GPAT/磷酸酶氨基酸序列(基序I)SEQ ID NO: 230保守GPAT/磷酸酶氨基酸序列(基序III)發明詳沭一般技術和定義除非另外明確限定，否則本文所用的所有科技術語應采取本領域(如，細胞培養、分子遺傳學、免疫學、免疫化學、蛋白化學、脂質和脂肪酸化學、生物燃料生產和生物化學領域)技術人員通常所理解的相同含義。除非另外指明，否則本發明所用的重組蛋白、細胞培養和免疫學技術為本領域技術人員熟知的標準程序。此類技術在諸如以下文獻資源中有所描述和解釋:J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons (1984),J.Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour LaboratoryPress (1989)，T.A.Brown (編者)，Essential Molecular Biology:A Practical Approach,卷 I 和 2，IRL Press (1991), D.M.Glover 和 B.D.Hames (編者)，DNA Cloning: A PracticalApproach,卷 1-4, IRLPress (1995 和 1996), F.M.Ausubel 等(編者)，Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-1nterscience (1988,包括到目前為止的所有更新)，Ed Harlow 和 David Lane (編者)Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),和 J.E.Coligan 等(編者)CurrentProtocols in Immunology, John Wiley&Sons (包括到目前為止的所有更新)。所選的定義術語“轉基因非人生物”是指(例如)包含外源多核苷酸(轉基因)或外源多肽的整個植物、藻類、非人動物或適合發酵的生物，諸如酵母或真菌。在一個實施方案中，轉基因非人生物不是動物或其部分。在一個實施方案中，轉基因非人生物是能夠由陽光獲得能量以合成有機化合物作為營養的光養生物(例如植物或藻類)。在另一個實施方案中，轉基因非人生物為光合細菌。在多核苷酸或多肽背景下的術語“外源”是指當以與天然狀態相比時改變的量存在于細胞中時的多核苷酸或多肽。在一個實施方案中，細胞是天然不含所述多核苷酸或多肽的細胞。在另一個實施方案中，外源多核苷酸或多肽來自不同的屬。在另一個實施方案中，外源多核苷酸或多肽來自不同的種。在一個實施方案中，外源多核苷酸或多肽在寄主植物或植物細胞中表達，并且外源多核苷酸或多肽來自不同的種或屬。在一個實施方案中，外源多肽為外源MGAT。如本文所用，術語“提取脂質”是指從包含至少60%(w/w)脂質的轉基因生物或其部分中提取的組合物。如本文所用，術語“非極性脂質”是指可溶于有機溶劑但不溶于水的脂肪酸及其衍生物。脂肪酸可以為游離脂肪酸和/或為酯化形式。酯化形式的實例包括但不限于三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)、單酰基甘油(MAG)。非極性脂質還包括留醇、留醇酯和蠟酯。非極性脂質也稱為“中性脂質”。非極性脂質在室溫下通常為液體。優選地，非極性脂質主要(>50%)包含長度為至少16個碳的脂肪酸。更優選地，非極性脂質中總脂肪酸的至少50%為C18脂肪酸，例如油酸。在一個實施方案中，本發明的非極性脂質中脂肪酸的至少50%、更優選至少70%、更優選至少80%、更優選至少90%、更優選至少91%、更優選至少92%、更優選至少93%、更優選至少94%、更優選至少95%、更優選至少96%、更優選至少97%、更優選至少98%、更優選至少99%可作為TAG存在。非極性脂質可(例如)通過用強堿水解以釋放游離脂肪酸或通過分餾、蒸餾等方法進一步純化或處理。本發明的非極性脂質如果通過種子獲得則可形成“種子油”的一部分。非極性脂質可存在于或得自其他植物部分(包括葉子或果實)，得自重組細胞或非人生物，在此情況下，脂質不是如本文所定義的種子油。提取脂質中的游離和酯化甾醇(例如，谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇、D5-燕麥留醇(D5_avenasterol)、谷留燒醇(sitostanol)、菜油留燒醇(campestanol)和膽固醇)濃度可如Phillips等,2002中所述。如本文所用，術語“種子油”是指從包含至少60%(w/w)脂質的植物的種子/糧食獲得的或者在種子油仍存在于種子/糧食中時可從種子/糧食獲得的組合物。也就是說，本發明的種子油包括存在于種子/糧食或其部分中的種子油，以及已從種子/糧食中提取出來的種子油。種子油優選為提取的種子油。種子油在室溫下通常為液體。優選地，種子油中的總脂肪酸(TFA)含 量主要(>50%)包含長度為至少16個碳的脂肪酸。更優選地，種子油中的總脂肪酸的至少50%為C18脂肪酸，例如油酸。脂肪酸通常為酯化形式，諸如TAG、DAG、酰基輔酶A或磷脂。脂肪酸可以為游離脂肪酸和/或為酯化形式。在一個實施方案中，本發明的種子油中脂肪酸的至少50%、更優選至少70%、更優選至少80%、更優選至少90%、更優選至少91%、更優選至少92%、更優選至少93%、更優選至少94%、更優選至少95%、更優選至少96%、更優選至少97%、更優選至少98%、更優選至少99%可作為TAG存在。在一個實施方案中，本發明的種子油為已從在種子中或粗提取物中與其相關的一種或多種其他脂質、核酸、多肽或其他污染分子分離的“基本上純化的”或“純化的”油。優選的是，基本上純化的種子油至少60%、更優選至少75%、更優選至少90%不含在種子或提取物中與其相關的其他組分。本發明的種子油可進一步包含非脂肪酸分子，諸如但不限于甾醇。在一個實施方案中，種子油為油菜油(甘藍型油菜(Brassica napus)、白菜型油菜(Brassica rapa ssp.))、芥子油(芥菜(Brassica juncea))、其他蕓苔屬植物油(如蕪青甘藍(Brassica napobrassica)、Brassica camelina)、向日葵油(向日葵(Helianthusannus))、亞麻桿油(亞麻(Linum usitatissimum))、大豆油(大豆(Glycine max))、紅花油(紅花(Carthamus tinctorius))、玉米油(玉米(Zea mays))、煙草油(煙草(Nicotianatabacum))、花生油(花生(Arachis hypogaea))、掠櫚油(油棕(Elaeis guineensis))、棉花種子油(陸地棉(Gossypium hirsutum))、椰子油(椰子(Cocos nucifera))、鱷梨油(鱷梨(Persea americana))、橄欖油(橄欖(Olea europaea))、腰果油(腰果(Anacardiumoccidentale))、夏威夷果油(澳洲堅果(Macadamia intergrifolia))、杏仁油(杏仁(Prunus amygdalus))、燕麥種子油(燕麥(Avena sativa))、米油(亞洲栽培稻或光稃稻)或擬南芥種子油(擬南芥(Arabidopsis thaliana))。種子油可通過本領域已知的任何方法從種子/糧食中提取。這通常涉及使用通常與種子的第一次破碎相關的非極性溶劑諸如乙醚、石油醚、氯仿/甲醇或丁醇混合物進行提取。糧食中與淀粉相關的脂質可使用水飽和的丁醇提取。種子油可以通過本領域已知的方法“脫膠”以除去多糖，或以其他方式處理以除去污染物或改善純度、穩定 性或色澤。種子油中的TAG和其他酯可以水解以釋放游離脂肪酸，或者如本領域所已知將種子油氫化、化學處理或酶法處理。如本文所用，術語“脂肪酸”是指飽和或未飽和的具有長度為至少8個碳原子的長脂族尾部的羧酸。通常，脂肪酸具有長度為至少12個碳的碳-碳鍵合鏈。最多的天然存在的脂肪酸具有偶數個碳原子，因為它們的生物合成涉及具有兩個碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以為游離狀態(非酯化)或酯化形式，諸如TAG、DAG、MAG、酰基輔酶A (硫代酯)鍵合或其他共價鍵合形式的一部分。當以酯化形式共價鍵合時，脂肪酸在本文稱為“酰基”基團。脂肪酸可以酯化為磷脂，諸如磷脂酰膽堿(PC)、磷酸酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或雙磷脂酰甘油。飽和脂肪酸沿著鏈不含任何雙鍵或其他官能團。術語“飽和的”是指氫，因為所有的碳(除了羧酸[-C00H]基團)都包含盡可能多的氫。換句話講，Omega(O)端含3個氫(CH3-)，鏈內的每個碳含2個氫(-CH2-)。不飽和脂肪酸具有與飽和脂肪酸相似的形式，不同的是一個或多個烯烴官能團沿著鏈存在，而每個烯烴用雙鍵的"-CH=CH-"部分(即，以雙鍵鍵合到另一個碳的碳)取代鏈的單鍵"-CH2-CH2-"部分。結合到雙鍵任一側的鏈中的兩個緊鄰碳原子可以按順式或反式構型存在。如本文所用，術語“多不飽和脂肪酸”或"PUFA"是指包含其碳鏈中的至少12個碳原子以及至少兩個烯烴基團(碳-碳雙鍵)的脂肪酸。“單酰基甘油酯”或"MG"是其中甘油被一個脂肪酸酯化的甘油酯。如本文所用，MAG包含位于sn-1/3 (本文也稱為sn_l MAG或1-MAG或1/3-MAG)或sn_2位(本文也稱為2-MAG)的羥基，因此MAG不包括磷酰化分子，諸如PA或PC。MAG因此為細胞中的中性脂質的組分。“二酰基甘油酯”或"DAG"是其中甘油被兩個脂肪酸酯化的甘油酯。如本文所用，DAG包含位于sn-1，3或sn_l，2/2，3位的羥基，因此DAG不包括磷酰化分子，諸如PA或PC。DAG因此為細胞中的中性脂質的組分。在DAG合成的Kennedy途徑中(圖1)，前體sn-甘油-3-磷酸(G-3-P)在sn-Ι位通過甘油_3_磷酸酰基轉移酶(GPAT)催化的第一反應中酯化到兩個酰基(每一個來自脂肪酸輔酶A酯)形成LysoPA，然后在通過溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAAT)催化的sn-2位的第二酰化形成磷脂酸(PA)。該中間體然后去磷酰化形成DAG。在備選合成代謝途徑中(圖1)，DAG可通過MGAT催化的sn-1 MAG或優選sn_2 MAG的酰化形成。DAG也可通過脂肪酶移除酰基由TAG形成，或通過CPTjDCT或PLC任一種酶移除膽堿頭基而基本上由PC形成(圖1)。“三酰基甘油酯”或"TAG"是其中甘油被三個脂肪酸酯化的甘油酯。在TAG合成的Kennedy途徑中，DAG如上所述形成，然后通過DGAT的活性將第三酰基酯化到甘油主鏈。形成TAG的備選途徑包括酶PDAT催化的途徑和本文所述的MGAT途徑。如本文所用，術語“酰基轉移酶”是指能夠將酰基從酰基輔酶A轉移到底物上的蛋白并包括MGAT、GPAT和DGAT。如本文所用，術語“單酰基甘油酰基轉移酶”或"MGAT"是指將脂肪酰基從酰基輔酶A轉移到MAG底物產生DAG的蛋白。因此，術語“單酰基甘油酰基轉移酶活性”至少是指將酰基從酰基輔酶A轉移到MAG產生DAG。MGAT因其在哺乳動物腸道的脂肪吸收中的作用而最為知名，其中通過膳食脂肪消化生成的脂肪酸和sn-2 MAG在腸細胞中重新合成為TAG，用于乳糜微粒的合成和分泌。MGAT催化此過程的第一步，其中來自脂肪酰基輔酶A的由脂肪酸和CoA形成的酰基與sn-2 MAG共價接合。如本文所用的術語"MGAT"包括作用于sn-1/3 MAG和/或sn-2 MAG底物以分別形成sn_l, 3 DAG和/或sn_l, 2/2，3-DAG的酶。在一個優選的實施方案中，MGAT比sn-1 MAG更偏好sn_2 MAG，或基本上只使用sn_2 MAG作為底物，實例包括以下文獻中所述的MGAT =Cao等，2003 (小鼠MGATl對sn2_18:1-MAG的特異性 >snl/3-18:1-MAG (圖 5)) ；Yen 和 Farese, 2003 (小鼠 MGATl 和人 MGAT2 的一般活性對2-MAG高于1-MAG酰基受體底物(圖5));以及Cheng等，2003 (人MGAT3對2-MAG的活性遠高于對1/3-MAG底物的活性(圖2D))。如本文所用，MGAT不包括將酰基優先地轉移到LysoPA而非MAG的酶，此類酶稱為LPAAT0也就是說，MGAT優先地使用非磷酰化單酰基底物，即使它們可能對LysoPA的催化活性較低。優選的MGAT不具有可檢測的酰化LysoPA的活性。如本文所示，MGAT( S卩，小家鼠MGAT2)還可具有DGAT功能，但主要用作MGAT，也就是說，當將酶活性以nmol產物/min/mg蛋白為單位表示時，它作為MGAT的催化活性高于作為DGAT的催化活性(另見Yen等，2002)。有三類已知的MGAT，分別稱為MGAT1、MGAT2和MGAT3。人MGATl基因(AF384163)的同源物至少存在(即， 序列是已知的)于黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、斑馬魚、秀麗隱桿線蟲、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母、棉假囊酵母菌(Eremothecium gossypii)、稻痕病菌和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中。人MGAT2基因(AY157608)的同源物至少存在于黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚、果蠅和蚊子中。人MGAT3基因(AY229854)的同源物至少存在于黑猩猩、狗、牛和斑馬魚中。然而，其他生物的同源物可容易地通過本領域鑒定同源序列的已知方法加以鑒定。MGATl多肽的實例包括通過得自智人(AF384163)、小家鼠(AF384162)、黑猩猩(XM_001166055、ΧΜ_0526044.2)、家犬(ΧΜ_545667.2)、家牛(ΝΜ_001001153.2)、褐家鼠(ΝΜ_001108803.1)、斑馬魚 MGATl (ΝΜ_001122623.1)、秀麗隱桿線蟲(ΝΜ_073012.4、ΝΜ_182380.5,ΝΜ_065258.3,ΝΜ_075068.3,ΝΜ_072248.3)、乳酸克魯維酵母(ΧΜ_455588.I)、棉阿舒囊霉(ΝΜ_208895.1)、稻瘟病菌(ΧΜ_368741.1)、玻璃海鞘預測(ΧΜ_002120843.1)的MGATl基因編碼的蛋白。MGAT2多肽的實例包括通過得自智人(ΑΥ157608)、小家鼠(ΑΥ157609)、黑猩猩(ΧΜ_522112.2)、家犬(ΧΜ_542304.I)、家牛(ΝΜ_001099136.I)、褐家鼠、紅原雞(ΧΜ_424082.2)、斑馬魚(ΝΜ_001006083.1)、黑腹果蠅(ΝΜ_136474.2、ΝΜ_136473.2、ΝΜ_136475.2)、岡比亞按蚊(ΧΜ_001688709.1、ΧΜ_315985)、赤擬谷盜(XM_970053.1)的MGAT2基因編碼的蛋白。MGAT3多肽的實例包括通過得自智人(AY229854)、黑猩猩(XMJ)Ol 154107.1、XM_001154171.1、ΧΜ_527842.2)、家犬(ΧΜ_845212.1)、家牛(ΧΜ_870406.4)、斑馬魚(ΧΜ_688413.4)的 MGAT3 基因編碼的蛋白。如本文所用，“MGAT途徑”是指形成TAG的不同于Kennedy途徑的合成代謝途徑，其中DAG通過MGAT催化的sn-1 MAG或優選sn_2 MAG的酰化而形成。DAG可隨后用于形成TAG或其他脂質。MGAT途徑在圖1中示例性示出。如本文所用，術語“二酰基甘油酰基轉移酶”(DGAT)是指將脂肪酰基從酰基輔酶A轉移到DAG底物產生TAG的蛋白。因此，術語“二酰基甘油酰基轉移酶活性”是指將酰基從酰基輔酶A轉移到DAG產生TAG。DGAT還可具有MGAT功能，但主要用作DGAT，也就是說，當將酶活性以nmol產物/min/mg蛋白為單位表示時，它作為DGAT的催化活性高于作為MGAT的催化活性(參見例如Yen等，2005)。有三種已知類型的DGAT，分別稱為DGAT1、DGAT2和DGAT3。DGATI多肽通常具有10個跨膜結構域，DGAT2多肽通常具有2個跨膜結構域，而DGAT3多肽通常不含跨膜結構域并被認為可溶于細胞質，而不整合進細胞膜。DGATl多肽的實例包括通過得自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)(登錄號 XP_755172)、擬南芥(CAB44774)、蓖麻(AAR11479)、油桐(ABC94472)、斑鳩菊(Vernonia galamensis) (ABV21945、ABV21946)、衛矛(Euonymusalatus) (AAV31083)、秀麗隱桿線蟲(AAF82410)、褐家鼠(NP_445889)、智人(NP_036211)的DGATl基因及其變體和/或突變體編碼的蛋白。DGAT2多肽的實例包括通過得自擬南芥(NP_566952.1 ；SEQ ID N0:212)、蓖麻(AAY16324.1 ；SEQ ID N0:213)、油桐(ABC94474.1 ；SEQ ID NO:214),拉曼被孢霉(AAK84179.1 ；SEQ ID N0:215)、智人(Q96PD7.2 ；SEQID NO:216) (Q58HT5.1 ；SEQ ID N0:217)、家牛(Q70VZ8.1 ;SEQ ID N0:218)、小家鼠(AAK84175.1 ；SEQ ID N0:219)的DGAT2基因及其變體和/或突變體編碼的蛋白。DGAT3多肽的實例包括通過得自花生(Arachis hypogaea, Saha等，2006)的DGAT3基因及其變體和/或突變體編碼的蛋白。DGAT幾乎沒有可檢測的MGAT活性，例如低于300pmol/min/mg蛋白，優選低于200pmol/min/mg蛋白，更優選低于100pmol/min/mg蛋白。DGAT2但非DGATl與MGAT酶共有高序列同源性，從而表明DGAT2和MGAT基因可能共有共同的遺傳起源。雖然多種同種型在TAG合成中涉及到催化相同的步驟，但是它們可能發揮著不同的功能作用，如通過酶DGAT/MGAT家族的不同組織分布和亞細胞定位而表明。在哺乳動物中，MGATl主要在胃、腎、脂肪組織中表達，而MGAT2和MGAT3則在小腸中表現出最高的表達。在哺乳動物中，DGATl在許多組織中泛表達，在小腸中的表達最高，而DGAT2則在肝臟中的豐度最高。生物信息學分析表明，MGAT3只存在于高等哺乳動物和人類中而不存在于嚙齒動物中。MGAT3比MGATl和MGAT3與DGAT2共有更高的序列同源性。當將MAG或DAG用作底物時MGAT3比MGATl和MGAT2酶表現出明顯更高的DGAT活性(MGAT3>MGAT1>MGAT2)，從而表明MGAT3用作推定的TAG合酶。MGATl和MGAT2均屬于同一類作為DGAT2的酰基轉移酶。已表明在某些DGAT2中對DGAT2催化活性具有重要意義的某些基序在MGAT酰基轉移酶中也是保守的。特別感興趣的是具有共有序列FLXLXXXN (SEQ ID NO: 224)(其中每個X獨立地為非脯氨酸的任何氨基酸，N為任何非極性氨基酸，該序列位于N端跨膜結構域內)的推定中性脂質結合結構域，接著為推定甘油/磷脂酰基轉移酶結構域。FLXLXXXN基序存在于小鼠DGAT2 (第81-88位氨基酸)和MGAT1/2中但不存在于酵母或植物DGAT2中。它對小鼠DGAT2的活性具有重要意義。其他DGAT2和/或MGAT1/2序列基序包括:1.存在于大多數DGAT2多肽中也存在于MGATl和MGAT2中的高度保守的YFP三肽(SEQ ID NO: 220)，例如作為小鼠DGAT2中的第139-141位氨基酸而存在。通過非保守取代使酵母DGAT2內的該基序發生突變將使酶喪失功能。2.在MGAT中以及在動物和真菌的DGAT2序列中高度保守的HPHG四肽(SEQ IDN0:221)，例如作為小鼠DGAT2中的第161-164位氨基酸而存在，并至少在酵母和小鼠DGAT2中對催化活性具有重要意義。植物DGAT2酰基轉移酶相反具有EPHS (SEQ ID NO: 222)保守序列，因此可以接受對第一和第四氨基酸的保守變化。3.作為推定甘油磷脂結構域一部分的較長保守基序。該基序的實例為RXGFX(K/R) XAXXXGXXX (L/V) VPXXXFG (E/Q) (SEQ ID NO: 223)，其作為小鼠 DGAT2 中的第 304-327 位氨基酸而存在。該基序在氨基酸序列中不如其他的保守，如可以通過其長度所預料，但是通過基序查找可以識別同源物。在更保守的氨基酸之間，間距可以變化，也就是說，與上面的序列相比，在基序內可以存在附加的X氨基酸或者更少的X氨基酸。如本文所用，術語“甘油-3-磷酸酰基轉移酶”或"GPAT"是指使甘油_3_磷酸(G-3-P)酰化形成LysoPA和/或MAG的蛋白質，如果GPAT也具有對LysoPA的磷酸酶活性則形成后一產物。轉移的酰基基團通常來自酰基輔酶A。因此，術語“甘油-3-磷酸酰基轉移酶活性”是指G-3-P酰化形成LysoPA和/或MAG。術語"GPAT "涵蓋使G-3-P酰化形成sn-1 LPA和/或sn-2 LPA優選sn_2 LPA的酶。在一個優選的實施方案中，GPAT具有磷酸酶活性。在最優選的實施方案中，GPAT為具有產生sn-2 MAG的磷酸酶活性的sn_2 GPAT。

如本文所用，術 語“sn-1甘油-3-磷酸酰基轉移酶”(sn_l GPAT)是指使sn_甘油-3-磷酸(G-3-P)酰化優先地形成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn_l LPA)的蛋白質。因此，術語“sn-Ι甘油-3-磷酸酰基轉移酶活性”是指使sn-甘油_3_磷酸酰化形成1-酰基-sn_ 甘油-3-憐酸(sn_l LPA)。如本文所用，術語“sn-2甘油_3_磷酸酰基轉移酶”(sn_2 GPAT)是指使sn_甘油-3-磷酸(G-3-P)酰化優先地形成2-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn_2 LPA)的蛋白質。因此，術語“sn-2甘油-3-磷酸酰基轉移酶活性”是指使sn-甘油-3-磷酸酰化形成2-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-2 LPA)。GPAT家族是一個龐大的家族，所有已知的成員均包含兩個保守結構域:plsC酰基轉移酶結構域(PF01553 ；SEQ ID NO:225)和 HAD 樣水解酶(PF12710 ；SEQ ID NO:226)超家族結構域。除此之外，在擬南芥中，GPAT4-8均包含與磷酸絲氨酸磷酸酶結構域(PR)0702 ；SEQ ID NO:227)同源的N端區域。GPAT4和GPAT6均包含已知對磷酸酶活性至關重要的保守殘基，具體地講，位于N端的基序I(DXDX[T/V] [L/V] ；SEQ ID NO:229)和基序III(K_[G/S] [D/S]XXX[D/N] ；SEQ ID NO:330)中的保守氨基酸(Yang 等，2010)。優選地，GPAT 具有sn-2偏好和磷酸酶活性以通過甘油-3-磷酸(G-3-P)產生sn-2 MAG(也稱為"2-MAG")(圖1)，例如，得自擬南芥屬的GPAT4(NP_171667.1)和GPAT6 (NP_181346.1)。更優選地，GPAT使用酰基輔酶A作為脂肪酸底物。GPAT4 (NP_171667)和 GPAT6 (NP_181346)的同源物包括 AAF02784、AAL32544、AAP03413、ABK25381、ACN34546、BAF00762、BAH00933、EAY84189、EAY98245、EAZ21484、EEC71826、EEC76137、EEE59882、EFJ08963、EFJ08964、EFJl 1200、EFJ15664、EFJ24086、EFJ29816、EFJ29817、NP_001044839、NP_001045668、NP_001147442、NP_001149307、NP_001168351、NP_181346、NP_191950、XP_001765001、XP_001769671、XP_001769724、XP_001771186、XP_001780533、XP_0022685 13、XP_002275348、XP_002276032、XP_002279091、 XP_002309124、 XP_002309276、 XP_002322752、 XP_002323563、XP_002439887、XP_002458786、XP_002463916、XP_002464630、XP_002511873、XP_002517438、XP_002520171、XP_002872955、XP_002881564、ACT32032、ACT32032、NP_001051189、NP_171667、XP_002320138、XP_002451377、XP_002451377、XP_002531350、XP_002872955 和 XP_002889361。保守基序和/或殘基可用作基于序列的診斷法，以鑒定雙官能的GPAT/磷酸酶。可選擇地，可以采用更嚴格的基于功能的測定法。這樣的測定法涉及(例如)向細胞或微粒體供給加標記的甘油-3-磷酸，然后通過薄層層析或類似技術定量標記產物的水平。GPAT活性導致產生標記的LPA，而GPAT/磷酸酶活性則導致產生標記的MAG。如本文所用，術語“野生型”或其變型形式是指未經過遺傳修飾的細胞或非人生物或其部分。術語“相應的”是指與本發明的細胞或非人生物或其部分具有相同或相似遺傳背景但未如本文所述進行修飾的細胞或非人生物或其部分(例如，不含編碼MGAT或外源MGAT的外源多核苷酸的細胞或非人生物或其部分)。相應的細胞或非人生物或其部分可用作對照，以與如本文所述進行修飾的細胞或非人生物或其部分比較核酸或蛋白表達水平，或性狀修飾的程度和性質，例如非極性脂質的產生和/或含量。如本文所用，“與...比較”是指將表達一種或多種外源多核苷酸或外源多肽的轉基因非人生物或其部分的非極性脂質水平或總非極性脂質含量與不含所述一種或多種外源多核苷酸或多肽的轉基因非人生物或其部分進行比較。如本文所用，“ 增強的產生非極性脂質的能力”是一個相對意義上的術語，是指通過本發明的細胞或非人生物或其部分產生的非極性脂質的總量相對于相應的細胞或非人生物或其部分是升高的。在一個實施方案中，非極性脂質的TAG和/或多不飽和脂肪酸含量是升高的。如本文所用，術語“下調內源酶的產生和/活性的分離或重組多核苷酸”或其變型形式是指所編碼的RNA分子下調內源酶的產生和/或活性(例如，編碼siRNA)或其本身即可下調內源酶的產生和/或活性(例如，為可直接遞送到例如細胞中的siRNA)的多核苷酸，所述內源酶例如為DGAT、sn-Ι甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基轉移酶(LPAAT)、酰基輔酶A:溶血卵磷脂酰基轉移酶(LPCAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或它們中兩種或更多種的組合。如本文所用，術語“按重量計”是指物質(例如，TAG、DAG、脂肪酸)的重量作為包含該物質的組合物(例如，種子、葉子)的重量的百分比。例如，如果轉基因種子每120 yg種子重量具有25 μ g總脂肪酸，則總脂肪酸的百分比按重量計為20.8%。如本文所用，術語“在相對的基礎上”是指物質在包含該物質的組合物中的量與相應組合物按百分比計算的比較。如本文所用，術語“相對非脂質含量”是指細胞、生物或其部分或從其得到的提取脂質的非極性脂質含量與相應細胞、生物或其部分或從相應細胞、生物或其部分提取的脂質按百分比計算的比較的表達。例如，如果轉基因種子具有25 yg總脂肪酸，而相應的種子具有20 μ g總脂肪酸，則在相對的基礎上非極性脂質含量的升高等于25%。
_3] 二酰基甘油和三酰基甘油的產生在一個實施方案中，本發明的轉基因非人生物或其部分與相應的非人生物或其部分相比產生更高水平的非極性脂質，諸如DAG或TAG，優選是這兩者。在一個實例中，本發明的轉基因植物產生的種子和/或葉子當與相應的種子和/或葉子相比時具有升高的非極性脂質含量，諸如DAG或TAG，優選是這兩者。非極性生物或其部分的非極性脂質含量當與相應的非人生物或其部分相比時按重量計高0.5%。在另一個實施方案中，轉基因非人生物或其部分(優選植物或種子)產生富集一種或多種特定脂肪酸的DAG和/或TAG。多種多樣的脂肪酸可結合到DAG和/或TAG中，包括飽和與不飽和脂肪酸以及短鏈與長鏈脂肪酸。可結合到DAG和/或TAG中的脂肪酸的某些非限制實例包括:羊蠟酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蘧酸(14:0)、棕櫚酸(16:0)、棕櫚油酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、異油酸(18:1)、亞油酸(18:2)、桐油酸(18:3)、Y-亞麻酸(18:3)、α-亞麻酸(18:3ω3)、十八碳四烯酸(18:4ω3)、花生酸(20:0)、二十碳二烯酸(20:2)、二高-Y-亞油酸(20:3)、二十碳三烯酸(20:3)、花生四烯酸(20:4)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5ω3)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳五烯酸(22:5 ω)、二十二碳六烯酸(22:6ω3)、二十四烷酸(24:0)、神經酸(24:1)、蠟酸(26:0)和褐煤酸(28:0)脂肪酸。在本發明的一個實施方案中，轉基因生物或其部分富集包含多不飽和脂肪酸的DAG和/或TAG。在本發明的一個實施方案中，將轉基因非人生物或其部分(優選植物或種子)用編碼如本文所定義的可以或可以不具有DGAT活性的MGAT的嵌合DNA轉化。MGAT的表達優選導致所述轉基因非人生物或其部分中更高水平的非極性脂質諸如DAG或TAG和/或升高的非極性脂質產率。在一個優選的實施方案中，轉基因非人生物為植物。

在進一步的實施方案中，將轉基因非人生物或其部分用編碼GPAT或DGAT的嵌合DNA轉化。優選地，將生物優選地用共價連接在一個DNA分子諸如單個T-DNA分子上的兩種嵌合DNA轉化。Yang等人(2010)描述了得自具有能夠由甘油_3_磷酸(G-3-P)產生sn_2 MAG的sn-2偏好和磷酸酶活性的擬南芥屬的甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT4和GPAT6)(圖1)。這些酶被認為是角質合成途徑的一部分。擬南芥屬GPAT4和GPAT6已證實使用酰基輔酶A作為脂肪酸底物(Zheng等，2003)。將雙官能GPAT/磷酸酶與MGAT結合產生一種新的DAG合成途徑，它使用G_3_P作為一種底物，以及衍生自酰基輔酶A的兩個酰基基團作為另外的底物。相似地，將這樣的雙官能GPAT/磷酸酶與具有DGAT活性的MGAT結合產生一種新的TAG合成途徑，它使用甘油-3-磷酸作為一種底物，以及衍生自酰基輔酶A的三個酰基基團作為另外的底物。因此，在本發明的一個實施方案中，將轉基因非人生物或其部分用雙官能GPAT/磷酸酶以及用不具有DGAT活性的MGAT共轉化。這將導致通過雙官能GPAT/磷酸酶產生MAG,繼而將通過MGAT轉化成DAG，然后通過天然DGAT或其他活性轉化成TAG。新DAG產生過程可通過例如在包含致死SLC1+SLC4敲除的酵母菌株中進行這樣的共轉化而加以確認和選擇，例如Benghezal等人(2007 ;圖2)所述。Benghezal等人(2007)的圖2顯示了敲除兩個酵母LPATS(SLC1&SLC4)是致死性的。SLC1+SLC4雙酵母突變體只能因提供反式的sic基因之一(對它們而言為SLC1)的互補質粒而得以維持。通過向培養基添加FOA的負選擇導致此互補質粒喪失(Ura選擇標記的反選擇)并使細胞不能存活。在本發明的另一個實施方案中，將轉基因非人生物或其部分(優選植物或種子)用編碼雙官能GPAT/磷酸酶以及具有DGAT活性的MGAT的嵌合DNA共轉化。這將導致通過雙官能GPAT/磷酸酶產生MAG，繼而將通過MGAT轉化成DAG然后轉化成TAG。在進一步的實施方案中，使不具有可檢測的磷酸酶活性的一種或多種內源GPAT沉默，例如使編碼在Kennedy途徑中酰化甘油_3_磷酸形成LPA的GPAT (例如，擬南芥屬GPATI)的一種或多種基因沉默。可通過(例如)向表達MGAT變體的轉基因H1246酵母菌株提供一定濃度的防止與野生型MGAT基因互補的特定游離脂肪酸(例如，DHA)而將底物偏好工程化到新型DAG和TAG合成途徑中。只有能夠使用所提供的游離脂肪酸的變體才能生長。多輪MGAT工程化將導致產生更偏好特定氨基酸的MGAT。上文所述的各種Kennedy途徑互補和補充因為初始底物甘油_3_磷酸的普遍存在性而可在任何細胞類型中進行。在一個實施方案中，轉基因的使用導致油產率升高。多核苷酸術語“多核苷酸”和“核酸”可互換使用。它們是指任何長度的聚合物形式的核苷酸，即脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。本發明的多核苷酸可以具有基因組、cDNA、半合成或合成起源，可為雙鏈或單鏈的，并且歸因于其起源或操縱:(I)與其在自然界中相關的多核苷酸的全部或一部分相關，(2)連接到其在自然界中所連接的之外的多核苷酸，或(3)不存在于自然界中。以下是多核苷酸的非限制性實例:基因或基因片段的編碼或非編碼區、通過連接分析定義的基因座、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、核糖酶、cDNA、重組多核苷酸、支化多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、任何序列的嵌合DNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包括修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。核苷酸結構的修飾當存在時可在聚合物組裝前或組裝后賦予。核苷酸序列可通過非核苷酸組分而中斷。多核苷酸可在聚合反應后進一步修飾,諸如通過與標記組分綴合。所謂“分離的多核苷酸”是指已總體上從其天然狀態下與之相關或連接的多核苷酸序列中分離的多核苷酸。優選地，分離的多核苷酸至少60%、更優選至少75%、更優選至少90%不含與之天然相關或連接的多核苷酸序列。如本文所用，術語“基因”將采取其最廣泛的含義，并包括以下脫氧核糖核苷酸序列，它含有結構基因的轉錄區以及發生翻譯時的蛋白編碼區并包括位于5'和3'兩個末端上的編碼區附近的序列，它們在任一末端上距離末端的距離為至少約2kb并涉及到基因的表達。就這一點而言，基因包含與給定基因天然相關的控制信號，諸如啟動子、增強子、終止和/或多聚腺苷酸化信號，或包含異源控制信號，在此情況下，基因稱為“嵌合基因”。位于蛋白編碼區5'并存在于 mRNA上的序列稱為5'非翻譯序列。位于蛋白編碼區3'或下游并存在于mRNA上的序列稱為3'非翻譯序列。術語“基因”涵蓋基因的cDNA和基因組兩種形式。基因的基因組形式或克隆包含可通過稱為“內含子”、“間插區”或“間插序列”的非編碼序列中斷的編碼區。內含子是轉錄成核RNA(nRNA)的基因片段。內含子可包含調控元件，諸如增強子。內含子從核或初級轉錄物中移除或“剪除”；因此內含子不存在于mRNA轉錄物中。mRNA在翻譯過程中起到指定新生多肽中的氨基酸序列或順序的作用。術語“基因”包括編碼本文所述的本發明蛋白質全部或一部分的合成或融合分子以及與上文任何一種序列互補的核苷酸序列。如本文所用，“嵌合DNA”是指不是天然存在于自然界中的任何DNA分子；本文也稱為“DNA構建體”。通常，嵌合DNA包含不是一起天然存在于自然界中的調控和轉錄或蛋白編碼序列。因此，嵌合DNA可包含衍生自不同來源的調控序列和編碼序列，或衍生自相同來源的調控序列和編碼序列但以不同于自然界中所存在的方式排列。開放閱讀框可以或可以不連接到其天然上游和下游調控元件。開放閱讀框可以整合到(例如)植物基因組中、處于非天然位置或處于復制子或載體中，在其中它在天然狀態下不存在，諸如細菌質粒或病毒載體。術語“嵌合DNA”不限于能在宿主中復制的DNA分子，而是包括能夠通過(例如)特定的銜接子序列連接到復制子中的DNA。“轉基因”是已通過轉化程序引入基因組中的基因。術語“遺傳修飾的”、“轉基因的”及其變型形式包括通過轉化或轉導將基因引入細胞，使細胞中的基因突變以及從遺傳學上改變或調節細胞中的基因調控，或如上所述進行修飾的任何細胞的子代。如本文所用的“基因組區域”是指基因組內的位置，在該位置處已將轉基因或轉基因群組(本文也成為基因簇)插入細胞或其前體細胞。此類區域只含已通過人工干預諸如通過本文所述的方法整合的核苷酸。本發明的“重組多核苷酸”是指已通過人工重組方法構建或修飾的核酸分子。重組多核苷酸與其天然狀態相比可以改變的量存在于細胞中或以改變的速率表達(例如，就mRNA而言)。在一個實施方案中，將多核苷酸引入天然不含該多核苷酸的細胞。通常，將外源DNA用作mRNA轉錄的模板，然后在轉化的細胞內翻譯成編碼本發明的多肽的氨基酸殘基的連續序列。在另一個實施方案中，多核苷酸是細胞的內源多核苷酸，并且其表達通過重組手段改變，例如，將外源控制序列引入所關注的內源基因的上游，以使得轉化的細胞能表達由所述基因編碼的多肽。本發明的重組多核苷酸包括還未與其所存在的基于細胞或無細胞的表達系統的其他組分分離的多核苷酸，以及在所述基于細胞或無細胞系統中產生、隨后從至少某些其他組分中純化的多核苷酸。多核苷酸可以是存在于自然界中的核苷酸的鄰接延伸(contiguous stretch),或者包含不同來源(天然存在的和/或合成的)的接合形成單個多核苷酸的核苷酸的兩個或更多個鄰接延伸。通常，此類嵌合多核苷酸包含至少一個編碼本發明多肽的開放閱讀框，它可操作地連接至適合促使該開放閱讀框在所關注的細胞中轉錄的啟動子。至于所定義的多核苷酸，應當理解，高于上文所提供的那些值的百分比同一性數值將涵蓋優選的實施方案。因此，適用時，按照最低百分比同一性數值，優選的是，多核苷酸所含的多核苷酸序列與相關的命名SEQ ID NO至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、更優選至少91%、更優選至少92%、更優選至少93%、更優選至少94%、更優選至少95%、更優選至少96%、更優選至少97%、更優選至少98%、更優選至少99 %、更優選至少99.1%、更優選至少99.2%、更優選至少99.3%、更優選至少99.4%、更優選至少99.5%、更優選至少99.6%、更優選至少99.7%、更優選至少99.8%甚至更優選至少99.9%相同。本發明的多核苷酸或可用于本發明的多核苷酸可在嚴格條件下選擇性雜交到本文所定義的多核苷酸。如本文所用，嚴格條件為以下這些:(I)在42°C下在雜交期間采用諸如甲酰胺的變性劑，例如50%(v/v)甲酰胺與0.l%(w/v)牛血清白蛋白、0.l%Ficoll、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、含750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.5);或(2)在42°C下在 0.2x SSC和 0.1%SDS 中采用 50% 甲酰胺、5x SSC (0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5x Denhardt溶液、超聲處理的鮭精DNA(50g/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖；和/或(3)在50°C下采用低離子強度和高溫進行洗滌，例如0.015M NaCl/0.0015M 檸檬酸鈉 /0.1%SDS。本發明的多核苷酸當與天然存在的分子相比時可具有一個或多個突變，它們為核苷酸殘基的缺失、插入或取代。相對于參考序列具有突變的多核苷酸可以是天然存在的(也就是說，從天然來源中分離)或合成的(例如，通過對如上所述的核酸進行定點誘變或DNA改組)。重鉬載體本發明的一個實施方案包括重組載體，其包含本文所定義的至少一種多核苷酸并能夠將該多核苷酸遞送進宿主細胞。重組載體包括表達載體。重組載體包含異源多核苷酸序列，也就是說，天然不與本文所定義的多核苷酸相鄰的多核苷酸序列，優選地，衍生自不同的種。載體可以是RNA或DNA ，原核或真核的，并通常為衍生自病毒的病毒載體或質粒。質粒載體通常包含附加的核酸序列，以便于原核細胞中表達盒的選擇、擴增和轉化，例如，PSK源載體、pGEM源載體、pSP源載體、pBS源載體或包含一個或多個T-DNA區域的二元載體。附加的核酸序列包含復制起點，以便以下物質的自主復制:載體，優選編碼抗生素或除草劑抗性的選擇標記基因，提供多個位點以插入在核酸構建體中編碼的核酸序列或基因的獨特的多個克隆位點，以及增強原核和真核(特別是植物)細胞轉化的序列。如本文所用的“可操作地連接”是指兩個或更多個核酸(如DNA)片段之間的功能關系。通常，是指轉錄序列的轉錄調控元件(啟動子)的功能關系。例如，將啟動子可操作地連接到本文所定義的多核苷酸的編碼序列，如果它在合適的細胞中刺激或調節該編碼序列的轉錄。通常，可操作地連接到轉錄序列的啟動子轉錄調控元件與轉錄序列在物理上連續，即，它們為順式作用的。然而，某些轉錄調控元件諸如增強子不需要與它們增強轉錄的編碼序列在物理上連續或在位置上緊鄰。當存在多個啟動子時，每個啟動子可以獨立地為相同的或不同的。重組載體還可以包含:(a) —個或多個分泌信號，其編碼信號肽序列以使得本文所定義的表達多肽能從產生該多肽的細胞中分泌，或其使表達的多肽定位，例如將多肽保持在細胞內質網(ER)中，或轉移到質粒中；和/或(b)包含融合序列，其導致核酸分子作為融合蛋白而表達。合適的信號片段的實例包括能夠指導本文所定義的多肽分泌或定位的任何信號片段。優選的信號片段包括但不限于Nicotiana nectarin信號肽(US5，939，288)、煙草伸展蛋白信號或大豆油體蛋白油體結合蛋白信號。重組載體還可以包含本文所定義的多核苷酸的核酸序列周圍和/或內部的間插和/或非翻譯序列。為了有利于鑒定轉化體，重組載體有利地包含作為本文所定義的多核苷酸的核酸序列或除了本文所定義的多核苷酸的核酸序列外的選擇或篩選標記基因。所謂“標記基因”是指使表達該標記基因的細胞具有不同的表型并因此允許將此類轉化細胞與不具有該標記的細胞進行區分的基因。選擇標記基因賦予一種性狀，可以根據對選擇劑(如，除草劑、抗生素、輻射、熱或對非轉化細胞的其他處理傷害)的抗性對其加以選擇。篩選標記基因(或報告基因)賦予可通過觀察或測試，也就是說通過“篩選”進行鑒定的性狀(如，不存在于非轉化細胞中的葡糖醛酸酶、熒光素酶、GFP或其他酶活性)。標記基因和所關注的核苷酸序列不必連接，因為如(例如)US 4，399，216中所述的非連接基因的共轉化也是(例如)植物轉化中的有效過程。標記的實際選擇不是決定性的，只要與所選的細胞諸如植物細胞組合時為雙官能的(即，選擇性的)即可。細菌選擇標記的實例為賦予抗生素抗性的標記，諸如氨芐青霉素、紅霉素、氯四環素或四環素抗性，優選卡那霉素抗性。選擇植物轉化體的示例性選擇標記包括但不限于:編碼潮霉素B抗性的hyg基因；賦予卡那霉素、巴龍霉素、G418抗性的新霉素磷酸轉移酶(nptll)基因；賦予谷胱甘肽源除草劑抗性的得自大鼠肝臟的谷胱甘肽-S-轉移酶基因，如(例如)EP256223中所述；過表達時賦予谷氨酰胺合成酶抑制劑(諸如草胺膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因，如(例如)W0 87/05327中所述；賦予選擇劑草胺膦抗性的得自綠色產色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酸基轉移酶基因，如(例如)EP 275957中所述；編碼賦予草雙甘膦耐性的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因，如(例如)Hinchee等人(1988)所述；賦予雙丙氨磷抗性的bar基因，如(例如)W091/02071中所述；賦予溴苯腈抗性的得自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的腈水解酶基因，諸如bxn(Stalker等，1988);賦予甲氨蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(Thillet等，1988);賦予咪唑啉酮類、磺酰脲類或其他ALS抑制性化學劑的突變乙酰乳酸合酶基因(ALS) (EP 154，204);賦予5-甲基色氨酸抗性的突變鄰氨基苯甲酸合成酶基因；或賦予除草劑抗性的茅草枯脫鹵素酶基因。優選的篩選標記包括但不限于:編碼已知其各種生色底物的葡糖醛酸酶(GUS)的UidA基因；編碼已知其生色底物的酶的葡糖醛酸酶基因；可用于鈣敏感生物發光檢測的水母發光蛋白基 因(Prasher等，1985);綠熒光蛋白基因(Niedz等，1995)或其衍生物；或允許生物發光檢測的熒光素酶(Iuc)基因(Ow等，1986)。所謂“報告基因”是指這樣一種分子，通過其化學性質，提供有利于通過參考蛋白產物測定啟動子活性的能通過分析而鑒定的信號。優選地，重組載體穩定地整合到細胞諸如植物細胞的基因組中。因此，重組載體可包含允許載體整合到細胞基因組或染色體組中的合適元件。表汰載體如本文所用，“表達載體”是能夠轉化宿主細胞并實現一種或多種指定多核苷酸表達的DNA或RNA載體。優選地，表達載體能夠在宿主細胞內復制。表達載體可以為原核或真核的，通常為病毒或質粒。本發明的表達載體包括在本發明的宿主細胞中發揮作用(即，指導基因表達)的任何載體，包括在細菌、真菌、體內寄生蟲、節肢動物、動物、藻類和植物細胞中。本發明的尤其優選的表達載體可以指導酵母、藻類和/或植物細胞中的基因表達。本發明的表達載體包含調控序列，諸如轉錄控制序列、翻譯控制序列、復制起點以及與宿主細胞相容并控制本發明多核苷酸表達的其他調控序列。具體地講,本發明的表達載體包括轉錄控制序列。轉錄控制序列是控制轉錄的起始、伸長和終止的序列。尤其重要的轉錄控制序列是控制轉錄起始的那些，諸如啟動子、增強子、操縱子和阻遏序列。合適的轉錄控制序列包括能在本發明的重組細胞的至少一者中發揮作用的任何轉錄控制序列。所用調控序列的選擇取決于所關注的目標生物諸如植物和/或目標器官或組織。此類調控序列可得自任何真核生物諸如植物或植物病毒，或者可以化學合成。多種此類轉錄控制序列是本領域技術人員已知的。尤其優選的轉錄控制序列為在植物中具有轉錄指導活性的啟動子，或為組成型的或為階段和/或組織特異性的，具體取決于植物或其部分的使用。許多適合植物細胞穩定轉染或適合建立轉基因植物的載體已在(例如)Pouwels 等，Cloning Vectors:A Laboratory Manual, 1985,副刊 1987 ；ffeissbach 和ffeissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989 ;和Gelvin等，Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990 中有所描述。通常，植物表達載體包含(例如)受5,和3,調控序列的轉錄控制的一個或多個克隆植物基因以及顯性選擇標記。此類植物表達載體還可以包含啟動子調控區域(如，控制誘導或組成型、受環境或發育調控的、或細胞或組織特異性表達的調控區域)、轉錄起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或多聚腺苷酸化信號。許多在植物細胞中具有活性的組成型啟動子已得到了描述。在植物中組成型表達的合適啟動子包括但不限于:花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、玄參花葉病毒(FMV) 35S啟動子、甘蔗桿狀病毒啟動子、鴨跖草黃斑駁病毒啟動子、得自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基的光誘導型啟動子、水稻細胞溶質丙糖磷酸異構酶啟動子、擬南芥腺嘌呤磷酸核糖轉移酶啟動子、水稻肌動蛋白I基因啟動子、甘露氨酸合酶及章魚堿合酶啟動子、Adh啟動子、蔗糖合酶啟動子、R基因復合啟動子和葉綠素α/β結合蛋白基因啟動子。這些啟動子已用于構建已在植物中表達的DNA載體，參見例如W084/02913。所有這些啟動子已用于構建各種類型的植物表達性重組DNA載體。為了在植物的源組織諸如葉子、根部或莖干中表達，優選的是，用于本發明的啟動子在這些特定組織中具有相對高的表達。為此，可以針對具有組織或細胞特異性表達或增強表達的基因選擇多 種啟動子。在文獻中報導的此類啟動子的實例包括:得自豌豆的葉綠體谷氨酰胺合成酶GS2啟動子、得自小麥的葉綠體果糖-1，6-二磷酸酶啟動子、得自馬鈴薯的核光合作用ST-LSl啟動子、得自擬南芥的絲氨酸/蘇氨酸激酶啟動子和葡萄糖淀粉酶(CHS)啟動子。還報導在光合有效組織中具有活性的為得自北美落葉松(Larix Iaricina)的核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶啟動子，得自松樹的Cab基因Cab6的啟動子，得自小麥的Cab-1基因的啟動子，得自菠菜的Cab-1基因的啟動子，得自水稻的Cab IR基因的啟動子，得自玉米的丙酮酸磷酸雙激酶(PTOK)啟動子，煙草Lhcbl*2基因的啟動子；擬南芥Suc2蔗糖-H3tl同向轉運啟動子，以及得自菠菜的類囊體膜蛋白基因的啟動子(PsaD、PsaF, PsaE,PC、FNR、AtpC、AtpD、Cab、RbcS)。葉綠素α / β -結合蛋白的其他啟動子也可用于本發明，諸如得自白芥(Sinapis alba)的LhcB基因和PsbP基因的啟動子。響應環境、激素、化學和/或發育信號而調控的多種植物基因啟動子也可用于在植物細胞中表達RNA結合蛋白基因，包括受以下因素調控的啟動子:(I)熱；(2)光(如豌豆RbcS-3A啟動子、玉米RbcS啟動子)；(3)激素，諸如脫落酸；(4)創傷(如WunI);或(5)化學劑，諸如茉莉酸甲酯、水楊酸、留類激素、醇、安全劑(W097/06269)，或者也可有利地采用(6)器官特異性啟動子。如本文所用，術語“植物貯藏器官特異性啟動子”是指當與其他植物組織相比時優先地指導植物貯藏器官中的基因轉錄的啟動子。優選地，該啟動子只指導貯藏器官中所關注基因的表達，和/或植物其他部分諸如葉子中所關注基因的表達不能通過Northern印跡分析和/或RT-PCR檢測。通常，啟動子在貯藏器官的生長和發育期間促使基因表達，尤其是貯藏器官中貯藏化合物的合成和積聚階段。此類啟動子可促使整個植物貯藏器官或僅其部分諸如雙子葉植物種子的種皮、胚芽或子葉或單子葉植物種子的胚乳或糊粉層中的基因表達。為了在植物的庫組織中表達，諸如馬鈴薯植物的塊莖、番茄的果實或大豆、油菜、棉花、玉米、小麥、水稻和大麥的種子，優選的是，用于本發明的啟動子在這些特定組織中具有相對高的表達。具有塊莖特異性表達或增強表達的基因的多種啟動子是已知的，包括I類馬鈴薯塊莖特異蛋白(patatin)啟動子、馬鈴薯塊莖ADPGPP基因(大小亞基)的啟動子、蔗糖合酶啟動子、主要塊莖蛋白(包括22kD蛋白復合物和蛋白酶抑制劑)的啟動子、顆粒結合型淀粉合成酶(GBSS)的啟動子以及其他I和II類patatin啟動子。其他啟動子也可用于在特定組織諸如種子或果實中表達蛋白。可以使用β_伴球蛋白的啟動子或其他種子特異性啟動子，諸如油菜籽蛋白(napin)、玉米蛋白、核絲(Iinin)和菜豆蛋白啟動子。也可使用根特異性啟動子。這樣的啟動子的實例為酸性幾丁質酶基因的啟動子。根組織中的表達也可通過利用已得到鑒定的CaMV 35S啟動子的根特異性亞結構域而實現。

在尤其優選的實施方案中，啟動子指導發生脂質生物合成的組織和器官中的表達。此類啟動子在合適的時間作用于種子發育以改變種子中的脂質組成。在進一步尤其優選的實施方案中，啟動子為植物貯藏器官特異性啟動子。在一個實施方案中，植物貯藏器官特異性啟動子為種子特異性啟動子。在更優選的實施方案中，啟動子相對于種子胚芽中的表達或相對于植物其他器官諸如葉子中的表達優先地指導雙子葉植物子葉中或單子葉植物胚乳中的表達。種子特異性表達的優選啟動子包括:1)編碼種子中脂質生物合成和積聚涉及到的酶(諸如去飽和酶和延長酶)的基因的啟動子；2)編碼種子貯藏蛋白的基因的啟動子；和3)編碼種子中碳水化合物生物合成和積聚涉及到的酶的基因的啟動子。合適的種子特異性啟動子為:油料種子油菜napin基因啟動子(US5, 608，152)、蠶豆(Vicia faba)USP啟動子(Baumlein等，1991)、擬南芥油體蛋白啟動子(W0 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)蛋白啟動子(US 5，504，200)、蕓苔 Bce4 啟動子(W0 91/13980)或豆球蛋白B4啟動子(Baumlein等，1992)以及導致單子葉植物諸如玉米、大麥、小麥、裸麥、水稻等種子特異性表達的啟動子。值得注意的合適啟動子為大麥lpt2或Iptl基因啟動子(W0 95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890中所述的啟動子(大麥醇溶蛋白基因、水稻谷蛋白基因、水稻素(oryzin)基因、水稻醇溶蛋白基因、小麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高粱醇溶蛋白基因、黑麥醇溶蛋白基因的啟動子)。其他啟動子包括Broun等(1998)、Potenza等(2004)、US20070192902和US 20030159173所述的那些。在一個實施方案中，種子特異性啟動子優先地在種子的限定部分諸如子葉或胚乳中表達。子葉特異性啟動子的實例包括但不限于:FP1啟動子(Ellerstrom等，1996)、豌豆豆球蛋白啟動子(Perrin等,2000)和菜豆植物凝集素啟動子(Perrin等，2000)。胚乳特異性啟動子的實例包括但不限于:玉米醇溶蛋白_1啟動子(Chikwamba等，2003)、水稻谷蛋白-1啟動子(Yang等，2003)、D大麥醇溶蛋白啟動子(Horvath等，2000)和小麥HMW谷蛋白啟動子(Alvarez等，2000)。在進一步的實施方案中，種子特異性啟動子在胚芽中和/或種子發芽后不表達或僅以低水平表達。在另一個實施方案中，植物貯藏器官特異性啟動子為塊莖特異性啟動子。實例包括但不限于馬鈴薯塊莖特異蛋白(patatin)B33、PAT21和GBSS啟動子以及甘薯貯藏蛋白啟動子(有關綜述，參見Potenza等,2004)。在優選的實施方案中，該啟動子指導相對于塊莖的外層(皮)或胚芽優先在塊莖髓部中的表達。在另一個實施方案中，植物貯藏器官特異性啟動子為果實特異性啟動子。實例包括但不限于番茄聚半乳糖醛酸酶ES和Pds啟動子以及蘋果ACC氧化酶啟動子(有關綜述，參見Potenza等,2004)。在優選的實施方案中，啟動子相對于果皮或果實內的種子優先地指導果實可食用部分(例如果髓)中的表達。5'非翻譯前導序列可衍生自所選的啟動子以表達本發明多核苷酸的異源基因序列，或可相對于待產生的酶的編碼區為異源的，并可根據需要進行特定修飾以便增強mRNA的翻譯。有關優化轉基因表達的綜述，參見Koziel等(1996)。5'非翻譯區也可得自植物病毒RNA(煙草花葉病毒、煙草蝕紋病毒、玉米矮小花葉病毒、苜蓿花葉病毒等等)，得自合適的真核基因、植物基因(小麥和玉米葉綠素a/b結合蛋白基因前導序列)或得自合成的基因序列。本發明不限于其中非翻譯區衍生自伴隨啟動子序列的5'非翻譯區的構建體。前導序列也可衍生自非相關啟動子或編碼序列。可用于本發明背景的前導序列包括玉米Hsp70 前導序列(US 5，362，865 和 US 5, 859, 347)以及 TMVco 元件。 轉錄的終止通過在表達載體中可操作地連接到所關注多核苷酸的3'非翻譯DNA序列而完成。重組DNA分子的3'非翻譯區包含在植物中作用于使腺苷酸核苷酸加成到RNA的3'端的多聚腺苷酸化信號。3'非翻譯區可得自在植物細胞中表達的多種基因。胭脂堿合酶3'非翻譯區、豌豆小亞基Rubisco基因的3'非翻譯區、大豆7S種子貯藏蛋白基因的3'非翻譯區常用于此能力。包含農桿菌屬(Agrobacterium)腫瘤誘導(Ti)質粒基因的多聚腺苷酸化信號的3'轉錄非翻譯區也是合適的。重組DNA技術可用于通過操縱(例如)宿主細胞內多核苷酸的拷貝數、這些多核苷酸的轉錄效率、所得轉錄物的翻譯效率以及轉錄后修飾的效率而改善轉化的多核苷酸的表達。可用于增加本文所定義的多核苷酸的表達的重組技術包括但不限于:將多核苷酸可操作地連接到高拷貝數質粒、將多核苷酸分子整合到一個或多個宿主細胞染色體、將載體穩定性序列添加到質粒、對轉錄控制信號(如啟動子、操縱子、增強子)的取代或修飾、對翻譯控制信號(如核糖體結合位點、Shine-Dalgarno序列)的取代或修飾、對多核苷酸的修飾以對應于宿主細胞的密碼子使用以及導致轉錄物不穩定的序列缺失。轉移核酸轉移核酸可用于將外源多核苷酸遞送到細胞，并包含一個、優選兩個邊界序列和所關注的多核苷酸。轉移核酸可以或可以不編碼選擇標記。優選地，轉移核酸在細菌中形成二元載體的一部分，其中該二元載體進一步包含這樣的元件，它們允許載體在細菌中復制、選擇或維持包含該二元載體的細菌細胞。轉移到真核細胞后，二元載體的轉移核酸成分能夠整合到真核細胞的基因組中。如本文所用，術語“染色體外轉移核酸”是指能夠從細菌諸如農桿菌屬轉移到真核細胞諸如植物葉子細胞的核酸分子。染色體外轉移核酸是一種遺傳元件，它作為能夠轉移隨后將其邊界內所含的核苷酸序列整合到受體細胞基因組中的元件而廣為人知。在這方面，轉移核酸的側翼通常為兩個“邊界”序列，但在某些情況下，可以使用一個末端的單個邊界，而轉移核酸的第二末端則在轉移過程中隨機生成。所關注的多核苷酸通常位于轉移核酸的左邊界樣序列與右邊界樣序列之間。轉移核酸內所含的多核苷酸可以可操作地連接到多種不同的有利于其表達(即，多核苷酸的轉錄和/或翻譯)的啟動子和終止子調控元件。農桿菌屬諸如根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的轉移DNA(T-DNA)及其人造變體/突變體可能是轉移核酸中研究最為透徹的實例。另一個實例是得自植物的包含T-DNA邊界樣序列的P-DNA ( “植物DNA” )。
如本文所用，"T-DNA"是指(例如)根癌農桿菌Ti質粒或發根農桿菌Ri質粒的T-DNA，或其作為T-DNA發揮作用的人造變體。T-DNA可以包括同時包含左右邊界序列的整個T-DNA，但只需要包含轉移所需的順式最小序列，即右側T-DNA邊界序列。本發明的T-DNA已插入它們之間，位于左右側邊界序列(如果存在)之間的任何位置，所關注的多核苷酸的側翼為位點特異性重組酶的靶點。編碼將T-DNA轉移到植物細胞所需的因子的反式序列諸如vir基因可以插入T-DNA，或者可以存在于與T-DNA相同的復制子上，或優選地以反式存在于農桿菌屬宿主的相容復制子上。此類“二元載體系統”在本領域是熟知的。如本文所用，"P-DNA"是指從植物基因組分離的轉移核酸或其人造變體/突變體，并在每個末端或只在一個末端包含T-DNA邊界樣序列。邊界樣序列優選與得自農桿菌屬諸如根癌農桿菌或發根農桿菌的T-DNA邊界序列共有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%但低于100%的序列同一性。因此，P-DNA可用于替代T-DNA從(例如)農桿菌屬將P-DNA內所含的核苷酸序列轉移到另一細胞。P-DNA在插入待轉移的外源多核苷酸之前可以進行修飾以有利于克隆并且應當優選不編碼任何蛋白質。P-DNA的特征在于至少包含右側邊界序列并優選地也包含左側邊界序列。如本文所用，轉移核酸的“邊界”序列可從所選的生物諸如植物或細菌中分離，或者可以為其人造變體/突變體。邊界序列促進并有利于其所連接的多核苷酸的轉移，并可有利于其在受體細胞基因組中的整合。在一個實施方案中，邊界序列的長度介于5-100個堿基對(bp)之間、10-80bp 之間、15-75bp 之間、15-60bp 之間、15-50bp 之間、15-40bp 之間、15-30bp 之間、16-30bp 之間、20_30bp 之間、2 l_30bp 之間、22_30bp 之間、23_30bp 之間、24-30bp之間、25-30bp之間或26_30bp之間。農桿菌屬T-DNA的邊界序列在本領域中是熟知的，并包括 Lacroix 等(2008)、Tzfira 和 Citovsky (2006)和 Glevin (2003)所述的那些。雖然在傳統上僅使用農桿菌屬將基因轉移到植物細胞，但是現今已鑒定/開發了大量的系統可按類似于農桿菌屬的方式發揮作用。最近已對多種非農桿菌屬物種遺傳修飾，從而能夠用于基因轉移(Chung等,2006 ;Broothaerts等,2005)。它們包括根瘤菌屬(Rhizobium sp.)NGR234、苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和百脈根中慢生根瘤菌(Mezorhizobium loti)。通過向細菌提供轉化過程所需的機制使細菌能夠用于基因轉移，該機制即一組通過農桿菌屬Ti質粒編碼的毒力基因以及位于單獨的小二元質粒上的T-DNA區段。以此方式工程化的細菌能夠轉化不同的植物組織(葉盤、愈傷組織和橢圓形組織)、單子葉植物或雙子葉植物，以及各種不同的植物物種(如煙草、水稻)。在幾十年前，通過哺乳動物細胞與攜帶質粒的大腸桿菌(Escherichiacoli)的原生質體的融合，首次實現了真核表達質粒從細菌到真核宿主的直接轉移(Schaffner, 1980)。從那時起，能夠將基因遞送進哺乳動物細胞的細菌數量穩定增長(Weiss, 2003),由四個小組獨立地發現(Sizemore 等 1995 ;Courvalin 等，1995 ;Powell 等,1996 ；Darji 等，1997)。已通過弗氏志賀菌(Shigella flexneri)的毒力質粒(pWRlOO)使得具有侵襲性的減活弗氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或大腸桿菌已表明能夠在侵入宿主細胞后轉移表達質粒并因代謝衰減而在細胞內死亡。經鼻或經口腔粘膜施用此類重組志賀氏桿菌或沙門氏菌引起了針對表達質粒所編碼的抗原的免疫反應。同時，已證實能在體內外將表達質粒轉移到哺乳動物宿主細胞的細菌名單已翻了一倍以上，并針對傷寒沙門菌(S.typhi)、豬霍亂沙門菌(S.choleraesuis)、單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、假結核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和小腸結腸炎耶爾森氏茵(Y.enterocolitica)進行了記述(Fennelly 等，1999 ;Shiau 等,2001 ;Dietrich 等，1998 ；Hense 等，2001 ；A1-Mariri 等，2002)。一般來講，可以假定，所有能夠進入宿主細胞(如弗氏志賀菌或單核細胞增多性李斯特菌)胞質溶膠并在此細胞區室內裂解的細菌都應當能夠轉移DNA。這稱為“頓挫”或“自殺”侵入，因為細菌必須裂解才能使DNA發生轉移(Grillot-Courvalin等，1999)。此夕卜，甚至許多留在吞噬液泡中的細菌(如鼠傷寒沙門氏菌)也有此能力。因此，已工程化為侵襲性但不能逃離吞噬體的重組大腸桿菌實驗室菌株卻能將它們的質粒負荷遞送到感染哺乳動物細胞的細胞核(GriIlot-Courvalin等，1998)。此外，最近也已表明根癌農桿菌能將轉基因引入哺乳動物細胞(Kunik等，2001)。如本文所用，術語“轉染”、“轉化”及其變型形式通常可互換使用。“轉染的”或“轉化的”細胞可經過操縱引入所關注的多核苷酸，或者可以為從其衍生的后代細胞。重組細胞本發明還提供重組細胞，例如，重組植物細胞，其為通過本文所定義的一種或多種多核苷酸或載體或它們的組合轉化的宿主細胞。術語“重組細胞”與術語“轉基因細胞”在本文可互換使用。本發明的合適細胞包括可通過編碼(例如)本文所述的多肽或酶的本發明多核苷酸或重組載體轉化的任何細胞。該細胞優選為因此能夠用于生產脂質的細胞。重組細胞可以是培養中的細胞、體外或生物(諸如植物)中或器官(諸如種子或葉子)中的細胞。優選地，細胞在植物中，更優選在植物的種子中。向其中引入多核苷酸的宿主細胞可以是非轉化細胞或已通過至少一種核酸轉化的細胞。此類核酸可以與脂質合成相關或不相關。本發明的宿主細胞可以內源性地(即，天然地)能夠產生本文所定義的多肽，在此情況下，從其衍生的重組細胞具有增強的產生所述多肽的能力，或者僅在用本發明的至少一種多核苷酸轉化后才能產生所述多肽。在一個實施方案中，本發明的重組細胞具有增強的產生非極性脂質的能力。本發明的宿主細胞可以是能夠產生至少一種本文所述的蛋白質的任何細胞，并包括細菌、真菌(包括酵母)、寄生蟲、節肢動物、動物、藻類和植物細胞。細胞可以是原核或真核的。優選的宿主細胞為酵母、藻類和植物細胞。在一個優選的實施方案中，植物細胞為種子細胞，具體地講，為種子子葉或胚乳中的細胞。在一個實施方案中，細胞為動物細胞。動物細胞可以為任何類型的動物細胞，諸如非人動物細胞、 非人脊椎動物細胞、非人哺乳動物細胞或水生動物細胞，諸如魚或甲殼綱動物、無脊椎動物、昆蟲等。節肢動物的非限制性實例包括昆蟲細胞，諸如秋粘蟲(Spodoptera frugiperda) (Sf)細胞,例如Sf9、Sf21 ;粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞和果蠅S2細胞。可用作本發明宿主細胞的細菌細胞的實例為聚球藻屬(Synechococcus spp.)(也稱為集胞藻屬(Synechocystis spp.)),例如細長聚球藻(Synechococcus elongatus)。可用作本發明宿主細胞的藻類細胞的實例包括(例如)衣藻屬(Chlamydomonas sp.)(例如萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))、杜氏藻屬(Dunaliella sp.)、紅球藻屬(Haematococcus sp.)、小球藻屬(Chlorella sp.)、破囊壺菌屬(Thraustochytrium sp.)、裂殖壺菌屬(Schizochytrium sp.)和團藻屬(Volvox sp.)。用于表達本發明核酸的宿主細胞可以包括在寬范圍的溫度和pH值下在多種原料(包括簡單或復雜碳水化合物、有機酸和醇和/或烴)上生長的微生物宿主。優選的微生物宿主為能夠天然合成非極性脂質的油脂性生物。宿主細胞可以是適合發酵方法的生物，諸如解脂耶氏酵母(YairowiaIipolytica)或其他酵母。轉某閔棺物本發明還提供包含本發明的外源多核苷酸或多肽、本發明的細胞、本發明的載體或它們的組合的植物。術語“植物”是指整個植株，而術語“其部分”是指植物器官(如葉子、莖干、根部、花朵、果實)、單個細胞(如花粉)、種子、種子部分(諸如胚芽、胚乳、盾片或種皮)、植物組織(諸如脈管組織)、植物細胞及其子代。如本文所用，植物部分包括植物細胞。如本文所用，術語“植物”以其最廣泛的含義使用。這包括但不限于草、觀賞或裝飾性植物、農作物或谷類(如油料種子、玉米、大豆)、秣料或草料、水果或蔬菜植物、草藥植物、木本植物、花卉植物或樹的任何物種。這不表示將植物限制到任何特定的結構。它還指單細胞植物(如微藻)。關于植物的術語“其部分”是指植物細胞及其子代，大量分化成集落的多個植物細胞(如團藻屬)、在植物發育的任何階段存在的結構、或植物組織。此類結構包括但不限于葉子、莖 干、花朵、果實、堅果、根部、種子、種皮、胚芽。術語“植物組織”包括植物的分化和未分化組織，包括存在于葉子、莖干、花朵、果實、堅果、根部、種子中的那些，例如胚芽組織、胚乳、皮組織(如表皮、周皮)、脈管組織(如木質部、韌皮部)或基本組織(包括薄壁組織、厚角組織和/或厚壁組織細胞)以及培養中的細胞(如單細胞、原生質體、愈傷組織、胚芽等)。植物組織可以在原位，在器官培養、組織培養或細胞培養中。“轉基因植物”、“遺傳修飾的植物”或其變型形式是指包含不存在于相同物種、品種或品系的野生型植物中的轉基因的植物。在本發明背景下定義的轉基因植物包括使用重組技術進行遺傳修飾以導致在所需的植物或其部分中產生本文所定義的至少一種多核苷酸的植物及其子代。轉基因植物部分具有相應的含義。術語“種子”和“糧食”可互換使用。“糧食”是指成熟的糧食，諸如收獲的糧食或仍在植物上但已準備收獲的糧食，但根據上下文也可以指吸脹或發芽后的糧食。成熟的糧食通常具有低于約18-20%的含水量。如本文所用的“發育種子”是指成熟前的種子，通常存在于受精或開花后的植物生殖結構中，但也可以指從植物中分離的成熟前的此類種子。如本文所用，術語“植物貯藏器官”是指特化的以貯藏(例如)蛋白質、碳水化合物、脂質形式的能量的植物部分。植物貯藏器官的實例為種子、果實、塊狀根和塊莖。本發明的優選植物貯藏器官為種子。如本文所用，術語“表型正常的”是指遺傳修飾的植物或其部分，尤其是貯藏器官，諸如本發明的種子、塊莖或果實，它們與未修飾的植物或其部分相比時生長和繁殖能力無明顯降低。在一個實施方案中，表型正常的遺傳修飾植物或其部分包含編碼可操作地連接到植物貯藏器官特異性啟動子的沉默抑制子的重組多核苷酸，并具有基本上與不含所述多核苷酸的相應植物或其部分相同的生長或繁殖能力。優選地，所產生的活力種子的生物質、生長速率、發芽速率、貯藏器官大小、種子大小和/或數量當與不含所述重組多核苷酸的植物在相同的條件下生長時不低于該不含所述重組多核苷酸的植物的相應指標的90%。這個術語不涵蓋可以不同于野生型植物但不影響將植物用于商業用途的植物特征，諸如幼苗葉片的ballerina表型。本發明提供的或設想用于實踐本發明的植物既包括單子葉植物也包括雙子葉植物。在優選的實施方案中，本發明的植物為農作物(例如谷類和豆類、玉米、小麥、馬鈴薯、木薯、水稻、高粱、小米、大麥或豌豆)或其他豆科植物。植物可以生長產生可食用的根部、塊莖、葉子、莖干、花朵或果實。植物可以是蔬菜或觀賞植物。本發明的植物可以為:玉米(Zea mays)、油菜(甘藍型油菜、白菜型油菜)、其他蕓苔屬植物，諸如蕪菁甘藍(Brassica napobrassica)或 Brassica camelina、舌甘菜(Beta vulgaris)、三葉草(Trifolium sp.)、亞麻(Linum usitatissimum)、苜猜(Medicago sativa)、7jC 稻(Oryzasativa)、裸麥(Secale cerale)、高粱(兩色高梁、高粱)、向日葵(Helianthus annus)、小麥(Tritium aestivum)、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甘薯(Lopmoeabatatus)、木薯(Man i hot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠蘿(Anana comosus)、柑橘樹(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasenensi s)、香蕉(Musa spp.)、鱷梨(Persea americana)、無花果(Ficus casica)、番石植(Psidium guajava)、芒果(Mangifer indica)、撤攬(Olea europaea)、番木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardium occidentale)、夏威夷果(Macadamia intergrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus) 、甜菜(Beta vulgaris)、燕麥或大麥。其他優選的植物包括C4草類植物，諸如大須芒草(Andropogon gerardi)、垂穗草(Bouteloua curtipendula)、細格蘭馬草(B.gracilis)、野牛草(Buchloe dactyloides)、柳枝稷(Panicum virgatum)、裂稃草(Schizachyrium scoparium)、芒草屬例如異源三倍體芒草奇崗和中國芒、印度草(Sorghastrum nutans)、曲折鼠尾粟(Sporoboluscryptandrus)、柳枝稷(Panicum virgatum) ;C3草類植物，諸如加拿大披堿草(Elymuscanadensis)、豆科植物頭狀胡枝子(Lespedeza capitata)和 Petalostemum villosum、非禾本草本植物Aster azureus ；以及木本植物，諸如Quercus ellipsoidalis和大果櫟(Q.macrocarpa)。在一個優選的實施方案中，植物為被子植物。在一個實施方案中，植物為油料種子植物，優選為油料種子農作物。如本文所用，“油料種子植物”是用于從植物種子商業生產脂質的植物物種。油料種子植物可以是油菜籽(諸如芥花)、玉米、向日葵、紅花、大豆、高粱屬、亞麻(亞麻籽)或甜菜。此外，油料種子植物可以是其他蕓苔屬植物、棉花、花生、罌粟、蕪菁甘藍、芥菜、蓖麻、芝麻、紅花或產堅果植物。植物可以在其果實中產生高水平的脂質，諸如橄欖、油棕或椰子。本發明適用的園藝植物為萵苣、菊苣或蔬菜類蕓苔屬植物，包括卷心菜、西蘭花或菜花。本發明可應用于煙草屬植物、葫蘆科植物、胡蘿卜、草莓、番茄或胡椒。在一個優選的實施方案中，轉基因植物對于已引入的每一個基因(轉基因)為純合的，使得其子代不發生所需表型的分離。轉基因植物也可對于引入的轉基因為雜合的，優選對于轉基因為均勻雜合的，諸如在通過雜交種子生長成的Fl子代中。此類植物可提供本領域熟知的多種優點，諸如雜種優勢。相關時，轉基因植物還可以包含附加的編碼產生非極性脂質時涉及到的酶的轉基因，諸如但不限于LPAAT、LPCAT, PAP或磷脂:二酰基甘油酰基轉移酶(PDAT1、PDAT2或PDAT3，參見例如Ghosal等，2007)或它們中兩種或更多種的組合。本發明的轉基因植物還可以通過外源多核苷酸表達油體蛋白。植物的轉化轉基因植物可使用本領域已知的技術而產生，諸如通常在Slater等，Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants, Oxford UniversityPress (2003)，以及Christou和Klee，Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley andSons (2004)中所述的那些技術。如本文所用，術語“穩定轉化”、“穩定轉化的”及其變型形式是指多核苷酸整合到細胞基因組中使得它們在細胞分裂過程中轉移到后代細胞而無需對它們的存在進行陽性選擇。穩定的轉化體或其子代可通過本領域已知的任何方法進行選擇，諸如對染色體DNA的Southern印跡或基因組DNA的原位雜交。農桿菌屬介導的轉移是將基因引入植物細胞的廣泛使用的系統，因為可以將DNA引入整個植物組織、植物器官或植物培養中的外植體中的細胞，從而瞬時表達或將DNA穩定整合到植物細胞基因組中。使用農桿菌屬介導的植物整合載體將DNA引入植物細胞在本領域是熟知的(參見例如 US 5177010、US 5104310、US 5004863 或 US 5159135)。待轉移的DNA區域通過邊界序列限定，并且通常將間插DNA(T-DNA)插入植物基因組中。進一步地，T-DNA的整合是相對精確的過程，很少導致重排。在其中農桿菌屬介導的轉化是有效的那些植物品種中，這是首選的方法，原因在于基因轉移的容易性和確定性。優選的農桿菌轉化載體能夠在大腸桿菌以及農桿菌屬中復制，從而允許方便地操縱，如文獻所述(Klee 等，In:Plant DNA Infectious Agents, Hohn 和 Schell 編輯，Springer-Verlag, NewYork, pp.179-203(1985))。
可用的加速方法包括(例如)微彈轟擊法(microprojectile bombardment)等。將轉化核酸分子遞送進植物細胞的方法的一個實例為微彈轟擊法。該方法在 Yang 等，Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,OxfordPress, Oxford, England(1994)中進行了綜述。非生物性粒子(微彈)可用核酸包被并通過推進力遞送進細胞。示例性粒子包括由鎢、金、鉬等構成的那些。微彈轟擊法的特定優點除了是可再生轉化單子葉植物的有效手段外還在于既不需要分離原生質體也不需要農桿菌屬感染的易感性。用于通過加速將DNA遞送進玉米細胞的方法的示例性實施方案為生物彈道α粒子遞送系統，其可用于通過絲網諸如不銹鋼或Nytex絲網將包被有DNA的粒子推進到覆蓋有懸浮培養的玉米細胞的過濾器表面上。適于與本發明一起使用的粒子遞送系統為可得自Bio-Rad Laboratories的気氣加速F*DS-1000/He基因槍。對于轟擊，可將懸浮細胞濃縮在過濾器上。將含待轟擊的細胞的過濾器設置在微彈阻檔板下方的合適距離處。如果需要，還將一個或多個絲網設置在基因槍與待轟擊的細胞之間。可選擇地，將未成熟的胚或其他靶細胞布置在固體培養基上。將待轟擊的細胞設置在微彈阻檔板下方的合適距離處。如果需要，還將一個或多個絲網設置在加速裝置與待轟擊的細胞之間。通過使用本文所述的技術，可以獲得瞬時表達標記基因的細胞的多達1000個或更多個病灶。轟擊后48小時一個病灶中表達基因產物的細胞的數量通常在一個到十個的范圍內，平均一個到三個。在轟擊轉化中，可以優化轟擊前的培養條件和轟擊參數，以得到最大數量的穩定轉化體。在該技術中，轟擊的物理和生物參數均具有重要意義。物理因素是涉及操縱DNA/微彈沉淀(microprojectile precipitate)的那些因素或影響大子彈或微彈飛行和速度的那些因素。生物因素包括在轟擊前以及緊接轟擊后操縱細胞時涉及到的所有步驟，有助于緩解轟擊相關創傷的靶細胞滲透調節，以及轉化DNA的性質諸如線性化DNA或完整的超螺旋質粒。據信，轟擊前操縱對于成功轉化未成熟的胚特別重要。在另一個備選實施方案中，質粒可以穩定轉化。針對在高等植物中進行質粒轉化所公開的方法包括含有選擇標記并通過同源重組將DNA靶向質粒基因組的DNA的粒子槍遞送(US 5，451，513、US 5，545，818、US 5，877，402、US 5，932479 和 WO 99/05265)。因此，預期人們可能希望在小規模研究中調整轟擊參數的各個方面以全面優化轟擊條件。可能尤其希望調整物理參數諸如間隙距離、飛行距離、組織距離和氦氣壓力。還可能通過修改影響受體細胞生理狀態并因此可影響轉化和整合效率的條件而最小化創傷減少因素。例如，可以調節滲透狀態、組織水合和傳代培養階段或受體細胞的細胞周期以實現最優轉化。按照本公開，執行其他常規調節將是本領域技術人員已知的。植物原生質體的轉化可使用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合的方法而實現。將這些系統應用于不同的植物品種取決于從原生質體再生該特定植物菌株的能力。從原生質體再生谷物的示例性方法已有所描述(Fujimura等，1985 ;Toriyama 等，1986 ；Abdullah 等，1986)。其他細胞轉化方法也可使用，并且包括但不限于通過將DNA直接轉移進花粉、通過將DNA直接注射進植物的生殖器官或通過將DNA直接注射進未成熟胚的細胞然后通過干燥胚的再水合而將DNA引入植物。通過單個植物原生質體轉化株或通過各種轉化的外植體實現植物的再生、發育和培養在本領域是熟知的(Weissbach等，見于Methods for Plant MolecularBiology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)) 該再生和生長過程通常包括選擇轉化細胞、通過胚發育的通常階段培養那些個體化細胞、通過生根苗階段的步驟。使轉基因胚和種子相似地再生。之后，將所得的轉基因生根芽植入合適的生長培養基中，諸如土壤。
包含異體外源基因的植物的發育或再生在本領域是熟知的。優選地，使再生的植物自花受粉以提供純合的轉基因植物。或者，將得自再生植物的花粉異花授粉到在農學上重要譜系的由種子長成的植物。反之，將得自這些重要譜系的植物的花粉用于對再生植物授粉。將本發明的包含所需多核苷酸的轉基因植物用本領域技術人員熟知的方法進行培養。轉化雙子葉植物(主要通過使用根癌農桿菌)并獲得轉基因植物的方法已有公布，如棉花(US 5，004，863，US 5，159，135，US 5，518，908)、大豆(US 5，569，834，US5，416，011)、蕓苔屬植物(US 5，463，174)、花生(Cheng 等，1996)和豌豆(Grant 等，1995)。轉化谷類植物諸如小麥和大麥以通過引入外源核酸而將遺傳變異引入植物以及通過原生質體或未成熟植物胚再生植物的方法在本領域是熟知的，參見(例如)CA2，092，588、AU 61781/94、AU 667939、US 6，100，447、PCT/US97/10621、US 5，589，617、US6，541，257，以及其他方法在WO 99/14314中有所闡述。優選地，轉基因小麥或大麥植株通過根癌農桿菌介導的轉化過程而產生。攜帶所需多核苷酸的載體可引入可再生的小麥組織培養植株或外植體的細胞，或合適的植物系統諸如原生質體。可再生的小麥細胞優選得自未成熟胚的盾片、成熟胚、由它們衍生的愈傷組織、或分生組織。為了確認轉基因在轉基因細胞和植物中的存在性，可使用本領域技術人員已知的方法進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增或Southern印跡分析。可根據產物性質按多種方式的任何一種檢測轉基因的表達產物，并包括Western印跡和酶測定法。定量測定不同植物組織中的蛋白表達并檢測復制的一種尤其有用的方式是使用報告基因，諸如GUS。一旦得到轉基因植物后，可讓它們生長以產生具有所需表型的植物組織或部分。可以收獲植物組織或植物部分，和/或收集種子。種子可用作長成其組織或部分具有所需特性的另外植物的來源。使用農桿菌屬或其他轉化方法形成的轉基因植物通常在一條染色體上包含單個遺傳基因座。此類轉基因植物對于添加的基因可稱為半合子的。更優選的是對于添加的基因為純合的轉基因植物，即包含兩個添加的基因的轉基因植物，一個基因位于染色體對每條染色體上的相同基因座。純合的轉基因植物可通過使半合子轉基因植物自株傳粉、使產生的其中一些種子發芽以及分析所得植物的所關注基因而獲得。

還應當了解，包含兩個獨立分離外源基因或基因座的兩種不同的轉基因植物也可異花授粉(配育)以產生包含兩組基因或基因座的后代。合適的Fl子代的自花受精可產生對于兩種外源基因或轉座子為純合的植物。還可以想到親本植株的回交以及與非轉基因植物的異交，如營養繁殖。常用于不同性狀和農作物的其他育種方法的描述可見于Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J.編輯,American Societyof Agronomy, Madison ffis.(1987)。TILLING在一個實施方案中，TILLING(定向誘導基因組局部突變技術)可用于產生其中內源基因被敲除的植物，例如，編碼以下酶的基因:DGAT、sn-1甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基轉移酶(LPAAT)、酰基輔酶A:溶血卵磷脂酰基轉移酶(LPCAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或它們中兩種或更多種的組合。在第一步驟中，通過以下方法在一組植物中誘導引入的突變，諸如新的單一堿基對變化:用化學誘變劑處理種子(或花粉)，然后使植物生長到突變將穩定遺傳的世代。提取DNA，并從種群的所有成員保存種子，以形成可隨時間反復獲取的資源。對于TILLING分析，設計PCR引物以特異性擴增所關注的單個基因靶標。如果靶標是基因家族的成員或多倍體基因組的部分，則特異性特別重要。接下來，可用染料標記的引物從多個個體的混合DNA擴增PCR產物。使這些PCR產物變性和再次退火以允許形成錯配的堿基對。錯配或異源雙鏈代表了均天然存在的單核苷酸多態性(SNP)(即，種群的多個植株可能攜帶相同的多態性)和誘導SNP(即，只有極少的單獨植株可能顯示突變)。形成異源雙鏈后，使用識別和裂解錯配DNA的內切酶諸如CelI是發現TILLING種群內的新型SNP的關鍵。使用該方法，可以篩選數千種植物以鑒定在基因組的任何基因或特定區域中具有單堿基變化以及小插入或缺失(l_30bp)的任何個體。進行分析的基因組片段的大小可以為0.3至1.6kb之間的任何值。每次分析達8倍共用(pooling)、1.4kb片段(略去片段的末端，在末端中SNP檢測會因噪音而存在問題)和96道，這一組合允許單次分析可篩選基因組DNA的高達一百萬個堿基對，從而使得TILLING成為一種高通量技術。TILLING 進一步見述于 Slade 和 Knauf (2005)以及 Henikoff 等(2004)。除了實現突變的高效檢測外，高通量TILLING技術是檢測自然多態性的理想選擇。因此，通過與已知序列構建異源雙鏈來探查未知的同源DNA可揭露多態位點的數量和位置。核苷酸變化以及小插入和缺失均進行鑒定，包括至少一些重復數多態性。這稱為Ecotilling (Comai 等，2004)。每個SNP由其在一些核苷酸內的大致位置而記錄。因此，各單倍型可基于其遷移率而歸檔。序列數據可通過用于錯配裂解測定的相同擴增DNA的等分試樣以相對小的增量努力獲得。用于單一反應的左端或右端測序引物通過其與多態性的接近度而選擇。Sequencher軟件執行多重比對并發現堿基變化，這在每種情況下確認了凝膠帶。Ecotilling的執行可比完整測序(當前用于大多數SNP發現的方法)更加便宜。可對包含生態型DNA陣列的平板進行篩選，而不是得自經誘變處理的植物的DNA池。由于檢測在近乎堿基對分辨率 的凝膠上進行，并且背景圖案是均勻交叉的泳道，具有相同大小的條帶可以匹配，從而在單個步驟中發現SNP并進行基因分型。以此方式，SNP的終極測序簡單而高效，基于用于篩選的相同PCR產物的等分試樣也可用來進行DNA測序這一事實而尤其如此。提高外源RNA水平和穩定化表汰轉錄后基因沉默(PTGS)是一種既可靶向細胞也可靶向病毒mRNA以發生降解的核苷酸序列特異性防御機制。PTGS發生在通過重組多核苷酸穩定或瞬時轉化的植物或真菌中，并導致與引入的多核苷酸具有序列相似性的RNA分子的積聚減少。可通過在植物或其部分的貯藏器官中限制沉默抑制子的表達而使RNA分子水平升高，和/或使RNA分子水平穩定數代。如本文所用，“沉默抑制子”是可以在植物細胞中表達的任何多核苷酸或多肽，其提高植物細胞中不同轉基因的表達產物的水平，尤其是從最初轉化的植物起經歷數代。在一個實施方案中，沉默抑制子是病毒沉默抑制子或其突變體。大量的病毒沉默抑制子在本領域是已知的，并包括但不限于P19、V2、P38、Pe-Po和RPV-P0。合適的病毒沉默抑制子的實例包括在WO 2010/057246中所述的那些。沉默抑制子可在本發明的植物或其部分中穩定表達。如本文所用，術語“穩定表達”或其變型形式是指當與不含編碼沉默抑制子的外源多核苷酸的相應植物相比時經歷數代(例如至少三代、至少五代或至少十代)后在子代植物中基本上相同或更高的RNA分子水平。然而，該術語不排除經歷數代后與前一代相比時存在一定程度的RNA分子水平損失的可能性，例如，每代不低于10%的損失。抑制子可選自任何來源，例如植物、病毒、哺乳動物等。抑制子可以為(例如):獸棚病毒B2，黃金葛潛伏病毒P14，黃金葛潛伏病毒AC2,非洲木薯花葉病毒AC4，秋葵黃脈花葉病C2，秋葵黃脈花葉病C4，秋葵黃脈花葉病β Cl，番茄褪綠病毒ρ22，番茄褪綠病毒CP，番茄褪綠病毒CPm，番爺金色花葉病毒AL2,番爺曲葉Java病毒β Cl,番爺黃化曲葉病毒V2,中國番茄黃化曲葉病毒C2，中國番爺黃化曲葉病毒YlO分尚株β Cl,番爺黃化曲葉病毒以色列分尚株V2,綠豆黃色花葉病毒!!豆AC2,木槿褪綠環斑病毒CP，蕪菁皺縮病毒Ρ38，蕪菁皺縮病毒CP，花椰菜花葉病毒Ρ6，甜菜黃化病毒ρ21，柑橘衰退病毒ρ20，柑橘衰退病毒ρ23，柑橘衰退病毒CP，βΧ 花葉病毒 SCP,甘薯褪綠矮化病毒ρ22，黃瓜花葉病毒2b,番爺不孕病毒HC-Pro,甜菜曲頂病毒L2，土壤傳播小麥花葉病毒19K,大麥條紋花葉病毒Ga_ab,早熟禾半潛病毒Gammab,花生簇生病毒P15，

稻矮小病毒Pns 10，南瓜姆傳黃化病毒PO,
甜菜西黃病毒PO,馬鈴薯病毒XP25，黃瓜脈黃化病毒Plb,李痘病毒HC-Pro,甘鹿花葉病毒HC-Pro,馬鈴薯病毒Y株HC-Pro，煙草蝕紋病毒Pl/HC-Pro，完善花葉病毒Pl/HC-Pro,鴨茅斑駁病毒Pl，鴨茅斑駁病毒挪威分離株Pl，水稻黃斑駁病毒Pl，水稻黃斑駁病毒尼日利亞分尚株P1，水稻白葉病毒NS3，

水稻條紋病毒NS3，十字花科感染煙草花葉病毒126K，十字花科感染煙草花葉病毒pl22，煙草花葉病毒pl22,煙草花葉病毒126,煙草花葉病毒130K，煙草脆裂病毒16K，番爺叢矮病毒P19,番茄斑萎病毒NSs，蘋果褪綠葉斑病毒P50，葡萄病毒A plO,BYV p21的葡萄卷葉相關病毒_2同源物，以及它們的變體/突變體。以上列表提供了可從其獲得抑制子的病毒，以及各特定病毒的抑制子的蛋白質(如B2、P14等)或編碼區命名。可以使用一種抑制子的多個拷貝。可以一起使用不同的抑制子(例如，一前一后地)。期望在植物貯藏器官中表達的基本上任何RNA分子均可與沉默抑制子共表達。RNA分子可影響農學性狀、抗昆蟲性、抗病性、抗除草劑性、不育性、糧食特性等。編碼的多肽可涉及在脂質、淀粉、碳水化合物、營養物等的代謝中，或可負責蛋白質、肽、脂質、蠟、淀粉、糖、碳水化合物、香氣、氣味、毒素、類胡蘿卜素、激素、聚合物、類黃酮、貯藏蛋白、酚醛酸、生物堿、木質素、纖維素、糖蛋白、糖脂等的合成。在一個特定實例中，植物產生升高水平的酶，以在植物如蕓苔屬植物，例如油料種子油菜或向日葵、紅花、亞麻、棉花、大豆或玉米中產生脂質。非極性脂質的產生在本領域經常用于實踐的技術可用于提取、加工、純化和分析本發明細胞、生物或其部分產生的非極性脂質。此類技術在諸如以下文獻資源中有所描述和解釋=FereidoonShahidi, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley&Sons, Inc.(2001)D1.1.1-Dl.1.11 以及 Perez-Vich 等(1998)。種子油的產生通常，將植物種子煮熟、壓榨和/或提取以產生粗制種子油，然后脫膠、精煉、脫色和除臭。一般來講，破碎種子的技術是本領域已知的。例如，可通過向油料種子噴水以將含水量提高到(例如)8.5%而使油料種子緩和，然后使用間隙設為0.23至0.27mm的平滑輥壓成薄片。取決于種子的類型，在破碎前可不加水。施熱使酶失活、有利于進一步破碎細胞、合并脂質、產生液滴以及聚集蛋白顆粒，所有這些都有利于提取過程。大部分種子油在通過螺旋榨油機后釋放出來。螺旋榨油機排出的油餅然后使用伴熱柱通過溶劑提取，例如通過己烷提取。可選擇地，可使通過壓榨作業產生的粗制種子油通過具有槽線排放蓋的沉降槽，以除去在壓榨作業期間與種子油榨出的固體。可使澄清的種子油通過板框壓濾機以除去任何剩余的細固體顆粒。如果需要，可將通過提取過程回收的種子油與澄清的種子油合并以產生混合的粗制種子油。將溶劑從粗制種子油除去后，使壓榨和提取的部分合并，然后接受正常的脂質加工工序(即，脫膠、堿煉、脫色和除臭)。脫膠可通過以下方法進行:將濃磷酸加入粗制種子油以將不可水化的磷脂轉化成可水化的形式以及螯合存在的微量金屬。通過離心將膠從種子油中分離。種子油可通過加入足量的氫氧化鈉溶液以滴定所有脂肪酸并除去因此形成的皂而精煉。除臭可通過在真空下將種子油加熱到260°C并以大約0.1ml/分鐘/IOOml種子油的速率將蒸汽緩慢引入種子油而進行。鼓泡約30分鐘后，使種子油在真空下冷卻。通常將種子油轉移到玻璃容器中，用氬氣吹掃，然后冷藏。如果種子油的量有限，可將種子油放在真空下，例如在Parr反應器中，然后加熱到260°C持續與除臭會采用的相同時長。該處理改善種子油的色澤，并除去大部分揮發性物質。用于產生脂質的植物生物質光合作用中涉及到的植物部分(例如，高等植物和水生植物諸如藻類的莖干和葉子)也可用于產生脂質。與植物的類型無關，有多種方法可從綠色生物質中提取脂質。一種方式是物理提取，其通常不使用溶劑提取。這是一種使用多種不同類型的機械提取的“傳統”方式。榨油機壓榨提取是常見的類型，如螺旋榨油機和沖壓機提取方法。使用這些方法提取的脂質的量差異很大，具體取決于所用的植物材料和機械過程。機械提取的效率通常不如下文所述的溶劑提取高。在溶劑提取中，將有機溶劑(如，己烷)至少與遺傳修飾的植物綠色生物質混合，優選在使綠色生物質干燥和研磨后。當然，除了綠色生物質外的其他植物部分(例如，含脂質的種子)也可進行研磨和混合。溶劑使生物質等部分中的脂質溶解，形成的溶液然后通過機械作用(例如，通過上文的壓榨過程)而與生物質分離。該分離步驟也可通過過濾(如，使用壓濾機或類似裝置)或離心等方法進行。然后，可使有機溶劑與非極性脂質分離(如，通過蒸餾)。該第二分離步驟從植物產生非極性脂質，并且在采用常規蒸氣回收時可得到能重復利用的溶劑。藻類燃料的產生藻產業是一種涉及種植 藻類物種(包括微藻類，也稱為浮游植物、微植物或浮游藻類，以及大型藻類，通常稱為海藻)的水產養殖形式。可用于本發明的藻類物種包括(例如)衣藻屬(例如萊茵衣藻)、杜氏藻屬、紅球藻屬、小球藻屬、破囊壺菌屬、裂殖壺菌屬和團藻屬。商業和工業藻類養殖具有許多用途，包括生產食品配料、食品和藻類燃料。單一或混合藻類培養可在開放池塘(諸如水溝類池塘和湖泊)或光生物反應器中進行。藻類可使用微孔篩網、通過離心、通過絮凝(使用例如脫乙酰殼多糖、礬和氯化鐵)以及通過泡沫浮選而收獲。中斷二氧化碳供應可使藻類自身絮凝，這稱為“自絮凝”。在泡沫浮選中，養殖機向水通氣形成泡沫，然后從水面撇去藻類。超聲和其他收獲方法當前正在開發中。脂質可通過機械破碎從藻類分離。當干燥藻類時，藻類保持其脂質含量，然后可通過榨油機“榨出”。由于不同的藻株在其物理特性方面差異巨大，對于特定類型的藻類，多種榨油機構造(螺旋、擠壓、活塞等)更有效。滲透壓休克有時用于從藻類釋放細胞成分，諸如脂質。滲透壓休克是滲透壓的急劇降低，并可導致溶液中的細胞發生破裂。超聲提取可加速提取過程，尤其是用于從藻類提取脂質的酶法提取過程。超聲波用于在溶劑材料中產生空化氣泡。當這些氣泡在細胞壁附近破滅時，所產生的沖擊波和液體射流導致這些細胞壁破碎并將 它們的內含物釋放進溶劑。化學溶劑(例如，己烷、苯、石油醚)常用于從藻類中提取脂質。索氏提取可用于在特殊玻璃器皿中在回流下用有機溶劑反復洗滌或滲漉而從藻類中提取脂質。酶法提取可用于從藻類中提取脂質。酶法提取以水作為溶劑使用酶降解細胞壁。酶法提取可通過超聲波處理加以支持。超臨界CO2也可用作溶劑。在該方法中，CO2在壓力下液化，并加熱到變為超臨界狀態(同時具有液體和氣體的性質)從而允許其作為溶劑的點。用于脂質生產的發酵方法如本文所用，術語“發酵方法”是指任何發酵方法或包括發酵步驟的任何工藝。發酵方法包括但不限于:用于生產醇(如乙醇、甲醇、丁醇)、有機酸(如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)、酮(如丙酮)、氨基酸(如谷氨酸)、氣體(如H2和CO2)、抗生素(如青霉素和四環素)、酶、維生素(如核黃素、β-胡蘿卜素)和激素的發酵方法。發酵方法還包括用于消耗品酒業(如啤酒和葡萄酒)、乳品業(如發酵奶制品)、皮革業和煙草業。優選的發酵方法包括本領域熟知的酒精發酵方法。優選的發酵方法為本領域熟知的厭氧發酵方法。合適的發酵細胞通常為能夠發酵的微生物，也就是說，將諸如葡萄糖或麥芽糖的糖類直接或間接轉化成所需的發酵產物。發酵微生物的實例包括真菌生物，諸如酵母，優選為含油生物。如本文所用，“含油生物”是積聚的干重的至少25%為三甘油酯的生物。如本文所用，“酵母”包括酵母屬、釀酒酵母、卡爾酵母(Saccharomyces carlbergensis)、假絲酵母屬(Candida spp.)、克魯維酵母屬(Kluveromyces spp.)、畢赤酵母屬(Pichia spp.)、漢遜酵母屬(Hansenula spp.)、木霉屬(Trichoderma spp.)、斯達氏油脂酵母(Lipomycesstarkey)和解脂耶氏酵母。優選的酵母包括解脂耶氏酵母或其他含油酵母和酵母屬菌株，尤其是釀酒酵母。
轉基因微生物優選在使脂肪酸生物合成基因和酰基轉移酶基因活性最佳的條件下生長。這導致最多、最經濟地產生脂質。一般來講，可以優化的培養基條件包括碳源的類型和量、氮源的類型和量、碳氮比、氧氣水平、生長溫度、pH、生物質生產期的長度、脂質積聚期的長度和細胞收獲時間。發酵培養基必須包含合適的碳源。合適的碳源可包括但不限于:單糖(如葡萄糖、果糖)、二糖(如乳糖、蔗糖)、寡糖、多糖(如淀粉、纖維素或其混合物)、糖醇(如甘油)或得自可再生原料(如干酪乳清滲透物、玉米浸泡液、糖用甜菜糖蜜、大麥麥芽)的混合物。另外，碳源可包括烷烴、脂肪酸、脂肪酸酯、單甘油酯、二甘油脂、三甘油酯、磷脂和各種脂肪酸商業來源，包括植物油(如大豆油)和動物脂肪。另外，碳底物可包括一碳底物(如二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸鹽、含碳的胺)，已證實了它們代謝轉化成關鍵的生物化學中間體。因此，預期用于本發明的碳源可涵蓋多種含碳底物，并且將只受宿主微生物的選擇的限制。雖然所有上述碳底物及其混合物源預計均適用于本發明，但優選的碳底物為糖和/或脂肪酸。最優選的是葡萄糖和/或含10-22個碳的脂肪酸。氮可由無機(如(NH4)2SO4)或有機源(如尿素、谷氨酸鹽)供應。除了合適的碳源和氮源外，發酵培養基還可以包含合適的礦物質、鹽、輔因子、緩沖劑、微生素和本領域技術人員已知適于微生物生長并促進脂質生產所必需的酶途徑的其他組分。合適的發酵pH范圍通常在約pH 4.0至pH 8.0之間，其中pH 5.5至pH 7.0是初始生長條件的優選范圍。發酵可在有氧或無氧條件下進行，其中微氧條件是優選的。通常，含油微生物細胞中高水平脂質的積聚需要兩個階段的過程，因為代謝狀態必需在生長與脂肪合成/貯藏之間得到“平衡”。因此，最優選地，兩階段發酵過程是在微生物中生產脂質所必需的。在該方法中，發酵的第一階段是為了生成和積聚細胞群，并且特征在于快速的細胞生長和細胞分裂。在發酵的第二階段，優選的是確立培養中的缺氮條件，以促進高水平的脂質積聚。該缺氮的作用是為了降低細胞中的AMP有效濃度，從而降低線粒體的NAD依賴性異檸檬酸脫氫酶的活性。當這種情況發生時，檸檬酸將會積聚，從而在細胞質中形成豐富的乙酰輔酶A庫，并引發脂肪酸合成。因此，這一階段的特征在于細胞分裂終止，然后是脂肪酸的合成和TAG的積聚。雖然細胞通常在大約30°C生長，但一些研究已表明在較低的溫度下不飽和脂肪酸的合成增加。基于工藝的經濟性，在兩階段發酵的第一階段后，當出現大量微生物生長時，該溫度漂移應該可能發生。預期，可以采用多種發酵方法設計，其中使用本發明的核酸進行脂質商業生產是所需的。例如，由重組微生物宿主商業化生產脂質可通過分批發酵、分批補料發酵或連續發酵方法而進行。分批發酵方法是一個封閉的系統，其中培養基組成在工藝開始時設定并且在工藝過程中除了維持PH和氧氣水平所需的那些外不進一步添加物料。因此，在培養過程開始時，將培養基用所需的生物接種，不用向培養基添加另外的底物(即，碳源和氮源)即允許生長或代謝活性發生。在分批工藝中，系統的代謝物和生物質組成不斷變化，直到停止培養時。在典型的分批工藝中，細胞溫和通過靜態停滯期到快速生長對數期，最后到靜止期，其中生長速率降低或停止。如果不進行處理，靜止期的細胞將最終死亡。標準分批工藝的變型形式為分批補料工藝，其中在發酵方法過程中將底物連續加入發酵罐。分批補料發酵也適用于本發明。分批補料工藝可用在分解代謝產物阻抑傾向于抑制細胞代謝時或者其中希望在任何一個時間培養基中具有有限量的底物的情況。分批補料系統中底物濃度的測量是困難的，因此可以基于可測因素諸如pH、溶解氧和廢氣(如，CO2)分壓的變化而進行估計。分批和分批補料培養方法是普通的方法，在本領域中是熟知的，實例可見于Brock, Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版，Sinauer Associates, Sunderland, Mass., (1989);或 Deshpande 和 Mukund (1992)。使用本發明的細胞商業生產脂質也可通過連續發酵方法而實現，其中將限定培養基連續加到生物反應器中，同時將等量體積的培養基移除以回收產物。連續培養通常以恒定的細胞密度將細胞維持在生長的對數期。連續或半連續培養方法允許調節影響細胞生長或終產物濃度的一個因素或任何多個因素。例如，一種方法可限制碳源并允許所有其他參數減弱代謝。在其他系統中，影響生長的多個因素可連續改變，而通過培養基濁度衡量的細胞濃度則保持不變。連續系統力求維持穩態生長，因此由于從培養中吸走培養基，細胞生長速率必須與細胞損失保持平衡。調節連續培養工藝的營養物和生長因子的方法以及使產物形成速率最大化的技術在工業微生物學領域是熟知的，上文的Brock對多種方法進行了詳細介紹。包括PUFA的脂肪酸可以游離脂肪酸或酯化形式諸如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂存在于宿主微生物中，并可通過本領域熟知的多種手段從宿主細胞中提取。一般來講，用于純化包括PUFA的脂肪酸的手段可包括有機溶劑提取、超聲處理、超臨界提取(如，使用二氧化碳)、皂化以及諸如壓榨的物理手段，或它們的組合。尤其關注的是在存在水的情況下用甲 醇和氯仿提取(Bligh和Dyer，1959)。需要時，可將含水層酸化以使帶負電的部分質子化，并因此提高所需產物向有機層中的分配。提取后，可在氮氣流下通過蒸發除去有機溶劑。當以共軛形式分離時，可使產物通過酶法或化學方法裂解以釋放出所關注的游離脂肪酸或不太復雜的共軛物，然后可接受進一步的操縱以產生所需的終產物。有利地，脂肪酸的共軛形式可用氫氧化鉀裂解。如果需要進一步的純化，可采用標準方法。此類方法可包括提取、尿素處理、分離結晶、HPLC、分餾、硅膠層析、高速離心或蒸餾或這些技術的組合。反應性基團諸如酸或鏈烯基的保護可通過已知的技術(如，烷化、碘化)在任何步驟進行。所用的方法包括將脂肪酸甲基化產生甲酯。相似地，可在任何步驟除去保護基團。有利地，包含GLA、STA、ARA、DHA和EPA的餾分的純化可通過尿素處理和/或分餾而實現。脂質的用途通過所述方法產生的脂質具有多種用途。在一些實施方案中，將脂質用作食用油。在其他實施方案中，將脂質精煉并用作潤滑劑或用于其他工業用途，諸如塑料合成。在一些優選的實施方案中，將脂質精煉以生產生物柴油。生物柴油生物柴油或烷基酯的生產是熟知的。有三種通過脂質產生酯的基本路線:1)通過醇進行脂質的堿催化酯交換反應；2)通過甲醇進行脂質的直接酸催化酯化反應；以及3)將脂質轉化成脂肪酸，然后通過酸催化形成烷基酯。在一些優選的實施方案中，使脂質發生酯交換反應以產生甲酯和甘油。在一些優選的實施方案中，使脂質與醇(諸如甲醇或乙醇)在存在催化劑(氫氧化鉀或氫氧化鈉)的情況下反應以產生烷基酯。烷基酯可用于生物柴油或與基于石油的燃料共混。飼料本發明包括可用作飼料的組合物。出于本發明的目的，“飼料”包括供人或動物消耗(包括供腸道和/或非腸道消耗)的任何食物或制劑，當進入體內時其:(I)起到滋養或增長組織或供能的作用，和/或(2)維持、恢復或支持足夠的營養狀況或代謝功能。本發明的飼料包括針對嬰兒和/或幼兒的營養組合物。本發明的飼料包括(例如)本發明的細胞、本發明的植物、本發明的植物部分、本發明的種子、本發明的提取物、本發明方法的產物、本發明發酵方法的產物、或與合適載體一起的組合物。術語“載體”以其最廣泛的含義使用以涵蓋可以或可以不具有營養價值的任何組分。如本領域技術人員將會知道，載體必須適用于(或以足夠低的濃度用于)飼料，使得其對消耗飼料的生物不產生有害作用。本發明的飼料包含通過使用本文所公開的方法、細胞或生物直接或間接產生的脂質。組合物可以為固體或液體形式。另外，組合物可以包含特定用途所需量的可食用大量營養素、維生素和/或礦物質。這些成分的量將隨組合物是旨在用于正常個體還是用于具有特殊需求的個體諸如患有代謝疾病等的個體而變化。無營養價值的合適載體的實例包括但不限于諸如食用脂肪、碳水化合物和蛋白質的大量營養素。此類食用脂肪的實例包括但不限于椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑醋栗油、大豆油以及單-和二 -甘油酯。此類碳水化合物的實例包括但不限于葡萄糖、食用乳糖和水解淀粉。另外，可用于本發明的營養組合物的蛋白質的實例包括但不限于大豆蛋白、電滲析乳清、電滲析脫脂乳、乳清或這些蛋白質的水解產物。關于維生素和礦物質，可將以下成分添加到本發明的飼料組合物中:鈣、磷、鉀、鈉、氯化物、鎂、錳 、鐵、銅、鋅、硒、碘和微生素A、E、D、C和B族。也可以添加其他此類維生素和礦物質。用于本發明的飼料組合物的組分可以具有半純化或純化起源。所謂半純化或純化是指通過天然材料的純化或通過從頭合成制備的材料。本發明的飼料組合物還可以添加到食物中，甚至在不需要膳食補充時。例如，可將該組合物添加到任何類型的食物中，包括但不限于人造黃油、改性黃油、奶酪、牛奶、酸奶、巧克力、糖果、小吃、色拉油、烹調用油、烹調用脂肪、肉類、魚肉和飲料。酵母屬用于釀造啤酒和葡萄酒，以及作為烘培尤其是面包中的配料。酵母是蔬菜提取物的主要成分。酵母還用作動物飼料中的添加劑。將顯而易見的是，可提供適于合成本文所述的脂質的遺傳修飾酵母菌株。這些酵母菌株然后可用于食物和葡萄酒及啤酒釀造以提供具有提聞的脂質含量的廣品。另外，根據本發明產生的脂質或經轉化以包含和表達主題基因的宿主細胞也可用作動物食物補充劑以改變動物組織或牛奶脂肪酸組成以更適合人或動物消耗。此類動物的實例包括羊、牛、馬等。此外，本發明的飼料可用于水產養殖以提高魚中的脂肪酸水平供人或動物消耗。本發明的優選飼料為可直接用作人或其他動物的食物或飼料的植物、種子和其他植物部分諸如葉子、果實和莖干。例如，動物可直接吃在田野中生長的此類植物或以控制攝食的方式喂養更加定量的量。本發明包括將此類植物和植物部分用作飼料，以提高人和其他動物中的多不飽和脂肪酸水平。鉬合物本發明還涵蓋包含使用本發明的方法產生的一種或多種脂質的組合物，尤其是藥物組合物。藥物組合物可包含與標準、熟知、無毒藥學上可接受的載體、佐劑或媒介物諸如磷酸鹽緩沖鹽水、水、乙醇、多元醇、蔬菜油、潤濕劑或乳劑諸如水/油乳劑相結合的一種或多種脂質。組合物可以為液體或固體形式。例如，組合物可以為片劑、膠囊、可攝取液體、粉末、外用膏劑或霜劑的形式。適當的流動性可(例如)通過就分散劑而言維持所需的粒度以及通過使用表面活性劑而維持。還可能可取的是包含等滲劑，例如糖、氯化鈉等。除了此類惰性稀釋劑外，組合物還可包含佐劑，諸如潤濕劑、乳化及助懸劑、甜味劑、矯味劑和芳香劑。混懸劑除了活性化合物外還可包含助懸劑，諸如乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、氫氧化鋁氧化物、膨潤土、瓊脂和黃蓍膠或這些物質的混合物。固體劑型諸如片劑和膠囊劑可使用本領域熟知的技術制備。例如，根據本發明產生的脂質可和與粘合劑諸如阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠，崩解劑諸如馬鈴薯淀粉或藻酸以及潤滑劑諸如硬脂酸或硬脂酸鎂相結合的常規片劑基料諸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉一起壓片。膠囊可通過將這些賦形劑與抗氧化劑和相關脂質一起裝入明膠膠囊中而制備。對于靜脈內施用，根據本發明產生的脂質或其衍生物可摻入商業制劑中。特定脂肪酸的典型劑量為0.1mg至20g,每天使用一至五次(每天最多IOOg),并優選在每天約IOmg至約1、2、5或IOg的范圍內(以一個或多個劑量使用)。如本領域所已知，最低約300mg/天的脂肪酸，特別是多不飽和脂肪酸是可取的。然而，應當理解任何量的脂肪酸將有益于受試者。

本發明的藥物組合物的可能施用途徑包括(例如)腸道和非腸道。例如，可經口施用液體制劑。另外，均勻混合物可完全分散于水中，在無菌條件下與生理上可接受的稀釋齊IJ、防腐劑、緩沖劑或推進劑混合以形成噴霧劑或吸入劑。待施用給受試者的組合物的劑型可由本領域的普通技術人員決定，并取決于多種因素，諸如受試者的體重、年齡、總體健康狀況、既往史、免疫狀態等。另外，本發明的組合物可用于美容目的。該組合物可加到現有美容組合物中使得形成混合物，或者可將根據本發明產生的脂肪酸用作美容組合物中唯一的“活性”成分。Ui術語“多肽”和“蛋白質”通常可互換使用。—種多肽或一類多肽可通過其氨基酸序列與參考氨基酸序列的同一性程度(百分比同一性)或通過與一個參考氨基酸序列比與另一個參考氨基酸序列具有更高的百分比同一性而限定。多肽與參考氨基酸序列的百分比同一性通常通過GAP分析(Needleman和Wunsch, 1970 ；GCG程序)以空位形成罰分=5和空位延伸罰分=0.3的參數而確定。查詢序列的長度為至少100個氨基酸，GAP分析在至少100個氨基酸的區域上比對兩個序列。甚至更優選地，查詢序列的長度為至少250個氨基酸，GAP分析在至少250個氨基酸的區域上比對兩個序列。甚至更優選地，GAP分析在整個長度上比對兩個序列。所述一種多肽或一類多肽可具有與參考多肽相同的酶活性、或不同的活性或無活性。優選多肽的酶活性為參考多肽的活性的至少10%。
如本文所用，“生物活性片段”是本發明的多肽的一部分，其保持了全長參考多肽的限定活性，例如MGAT活性。如本文所用的生物活性片段不包括全長多肽。生物活性片段可以為任何大小的部分，只要它們保持限定的活性即可。優選地，生物活性片段保持全長多肽活性的至少10%。至于限定的多肽或酶，應當理解高于本文所提供的那些數值的百分比同一性數值將涵蓋優選的實施方案。因此，適用時，按照最低百分比同一性數值，優選的是，多肽/酶所含的氨基酸序列與相關的命名SEQ ID NO至少60%、更優選至少65%、更優選至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、更優選至少90%、更優選至少91%、更優選至少92%、更優選至少93%、更優選至少94%、更優選至少95%、更優選至少96%、更優選至少97%、更優選至少98%、更優選至少99%、更優選至少99.1%、更優選至少99.2%、更優選至少99.3%、更優選至少99.4%、更優選至少99.5%、更優選至少99.6%、更優選至少99.7%、更優選至少99.8%甚至更優選至少99.9%相同。本文所限定的多肽的氨基酸序列突變體可通過將合適的核苷酸變化引入本文所限定的核酸或通過體外合成所需的多肽而制備。此類突變體包括(例如)氨基酸序列內殘基的缺失、插入或置換。可使缺失、插入和置換的組合出現在最終構建體中，前提條件是最終多肽產物具有所需的特性。突變(改變)的多肽可使用本領域已知的任何技術例如使用定向進化或合理設計策略(見下文)而制備。衍生自突變/改變的DNA的產物可使用本文所述的技術容易地篩選，以確定它們是否具有酰基轉移酶活性，例如MGAT、DGAT或GPAT/磷酸酶活性。在設計氨基酸序列突變體時，突變位點的位置和突變的性質將取決于待修飾的特性。突變位點可例如通過以下方式單獨地或連續地進行修飾:(I)根據實現的結果首先通過保守氨基酸選擇然后通過更激進的選擇進行取代，(2)使目標殘基缺失，或(3)鄰近定位的位點插入其他殘基。氨基酸序列缺失通常在約I至15個殘基、更優選約I至10個殘基，通常約I至5個鄰接殘基的范圍內。置換突變體具有至少一個在多肽中移除的氨基酸殘基以及在其位置插入的不同殘基。置換誘變最受關注的位點包括鑒定為活性位點的位點。所關注的其他位點為其中得自各品系或物種的特定殘基為相同的那些位點。這些位置可以對生物活性具有重要意義。這些位點，特別是落在至少三個其他相同保守位點的序列內的那些位點，優選以相對保守的方式置換。此類保守置換在表I中以“示例性置換”的標題示出。在一個優選的實施方案中，突變體/變體多肽與天然存在的多肽相比時只具有或不超過一個或兩個或三個或四個保守氨基酸變化。保守氨基酸變化的詳細信息在表I中提供。技術人員將會意識到，此類微小的變化可合理地預測為當在重組細胞中表達時不改變多肽的活性。表1.示例性置換
權利要求
1.一種產生提取的脂質的方法，所述方法包括以下步驟: i)獲得包含一種或多種外源多核苷酸的轉基因非人生物或其部分，其中所述轉基因非人生物或其部分當與不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應生物或其部分進行比較時具有升高水平的一種或多種非極性脂質，以及 ii)從所述轉基因非人生物或其部分提取所述脂質， 從而產生所述提取的脂質。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述轉基因非人生物或其部分的一種或多種非極性脂質的水平按重量計比相應的非人生物或其部分高至少0.5%(w/w)。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述轉基因非人生物或其部分的一種或多種非極性脂質的水平在相對的基礎上比相應的非人生物或其部分高至少l%(w/w)。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述轉基因非人生物或其部分的總非極性脂質含量當與相應的生物或其部分相比時是升高的。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述轉基因非人生物或其部分的總非極性脂質含量按重量計比相應的非人生物或其部分高至少0.5%(w/w)。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其中所述轉基因非人生物或其部分的總非極性脂質含量在相對的基礎上比相應的非人生物或其部分高至少l%(w/w)。
7.根據權利 要求1至6中任一項所述的方法，其中所述轉基因非人生物為植物、藻類或適合發酵的生物如酵母或真菌。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述植物為蕓苔(Brassicasp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、亞麻(Linum usitatissimum)、向日葵(Helianthus sp.)、紅花(Carthamus tinctorius)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、兩色高梁(Sorghum bicolor)、高梁(Sorghum vulgare)、燕麥(Avena sativa)、三葉草(Trifolium sp.)、亞麻莽(Camelina sativa)、異源三倍體芒草奇崗(Miscanthus xgiganteus)或中國芒(Miscanthus sinensis)。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述部分為植物的種子、果實或營養部分。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述部分為植物種子并且所述提取的脂質為種子油。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述種子的總油含量或總脂肪酸含量按重量計比不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應種子高至少0.5%(w/w)至25%(w/w)。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其中所述種子來自: i)油菜植物， ii)玉米植物， iii)大豆植物， iv)羽扇豆植物， V)花生植物， vi)向日葵植物， vii)棉花植物， viii)紅花植物，或ix)亞麻植物。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述油菜種子包含以下一種或多種: i)按重量計至少45%的種子油， ii)比相應種子高至少5%(w/w)的相對種子油含量， iii)比相應種子高至少10%(w/w)的相對DAG含量，以及 iv)比相應種子高至少5%(w/w)的相對TAG含量。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述玉米種子包含以下一種或多種: i)按重量計至少5%的種子油， ii)比相應種子高至少5%(w/w)的相對種子油含量， iii)比相應種子高至少10%(w/w)的相對DAG含量，以及 iv)比相應種子高至少5%(w/w)的相對TAG含量。
15.根據權利要求12所述的方法，其中所述大豆種子包含以下一種或多種: i)按重量計至少20%的種子油， ii)比相應種子高至少5%(w/w)的相對種子油含量， iii)比相應種子高至少10%(w/w)的相對DAG含量，以及` iv)比相應種子高至少5%(w/w)的相對TAG含量。
16.根據權利要求12所述的方法，其中所述羽扇豆種子包含以下一種或多種: i)按重量計至少10%的種子油， ii)比相應種子高至少5%(w/w)的相對種子油含量， iii)比相應種子高至少10%(w/w)的相對DAG含量，以及 iv)比相應種子高至少5%(w/w)的相對TAG含量。
17.根據權利要求12所述的方法，其中所述花生種子包含以下一種或多種: i)按重量計至少50%的種子油， ii)比相應種子高至少5%(w/w)的相對種子油含量， iii)比相應種子高至少10%(w/w)的相對DAG含量，以及 iv)比相應種子高至少5%(w/w)的相對TAG含量。
18.根據權利要求9所述的方法，其中所述植物的營養部分為地上植物部分或綠色部分如葉子或莖干。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述營養植物部分的TAG、DAG、TAG和DAG或MAG含量在相對的基礎上比不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應營養植物部分的TAG、DAG、TAG 和 DAG 或 MAG 高至少 10% (w/w)。
20.根據權利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述提取的脂質的脂肪酸含量的至少60%(mo 1%)為油酸。
21.根據權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述提取的脂質的多不飽和脂肪酸含量與從相應生物或其部分提取的脂質相比時是升高的。
22.根據權利要求1至21中任一項所述的方法，其中所述提取的脂質中多不飽和脂肪酸的水平當與從相應生物或其部分提取的脂質相比時是升高的，其中所述多不飽和脂肪酸為二十碳二烯酸、花生四烯酸(ARA)、α -亞麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)或它們中兩種或更多種的組合。
23.根據權利要求1至22中任一項所述的方法，其中所述一種或多種脂質的水平和/或所述總非極性脂質含量可通過使用得自所述提取的脂質的脂肪酸甲酯的氣相色譜法進行分析而測定。
24.根據權利要求10至17中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括從所述轉基因植物收獲所述種子，從所述種子壓榨所述種子油，和/或純化所述種子油。
25.根據權利要求1至24中任一項所述的方法，其中所述一種或多種外源多核苷酸編碼: i)單酰基甘油酰基轉移酶(MGAT)， ii)二酰基甘油酰基轉移酶2 (DGAT2)， iii)MGAT和甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)， iV)MGAT 和 DGAT，或V) MGAT、GPAT 和 DGAT。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述GPAT還具有磷酸酶活性以產生MAG，如擬南芥 GPAT4 或 GPAT6。
27.根據權利要求25或26所述的方法，其中所述DGAT為DGAT2。
28.根據權利要求25至27中任一項所述的方法，其中編碼MGAT的外源多核苷酸包含以下一種或多種: i)選自SEQID NO:1至44任一的核苷酸序列， ii)編碼包含具有SEQID NO:45至82任一提供的序列的氨基酸的多肽或其生物學活性片段的核苷酸序列， iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及 iv)在嚴格條件下與i)至iii)任一雜交的核苷酸序列。
29.根據權利要求25至28中任一項所述的方法，其中編碼GPAT的外源多核苷酸包含以下一種或多種: i)選自SEQID N0:84至141任一的核苷酸序列， ii)編碼包含具有SEQID NO: 144至201任一提供的序列的氨基酸的多肽或其生物學活性片段的核苷酸序列， iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及 iv)在嚴格條件下與i)至iii)任一雜交的核苷酸序列。
30.根據權利要求25至29中任一項所述的方法，其中編碼DGAT2的外源多核苷酸包含以下一種或多種: i)SEQID N0:204的核苷酸序列， ii)編碼包含具有SEQID NO:212提供的序列的氨基酸的多肽或其生物學活性片段的核苷酸序列， iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及 iv)在嚴格條件下與i)至iii)任一雜交的核苷酸序列。
31.根據權利要求25至30中任一項所述的方法，其中所述轉基因生物或其部分的一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量比不含所述一種或多種外源多核苷酸但包含編碼擬南芥DGATl的外源多核苷酸的相應生物或其部分按重量計高至少0.5% (w/w)和/或在相對的基礎上高至少l%(w/w)。
32.根據權利要求1至31中任一項所述的方法，其中所述轉基因非人生物或其部分進一步包含一個或多個引入的突變，和/或包含下調所述非人轉基因生物或其部分的內源酶的產生和/或活性的外源多核苷酸，所述內源酶選自DGAT、sn-Ι甘油_3_磷酸酰基轉移酶(sn-lGPAT)、1-酰基-甘油-3-磷酸酰基轉移酶(LPAAT)、酰基輔酶A:溶血卵磷脂酰基轉移酶(LPCAT)、磷脂酸磷酸酶(PAP)或它們中的兩種或更多種的組合。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述外源多核苷酸選自:反義多核苷酸、有義多核苷酸、催化多核苷酸、微RNA、編碼結合所述內源酶的多肽的多核苷酸以及雙鏈RNA。
34.根據權利要求1至33中任一項所述的方法，其中所述非極性脂質為TAG、DAG、TAG和DAG、MG、總PUFA，或者為二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、α -亞麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)的具體PUFA，或者它們中兩種或更多種的組口 ο
35.一種包含一種或多種外源多核苷酸的轉基因非人生物或其部分,其中所述轉基因非人生物或其部分當與不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應生物或其部分相比時具有升高水平的一種或多種非極性脂質。
36.根據權利要求35所述的轉基因非人生物或其部分，其中所述轉基因非人生物或其部分的一種或多種非極性脂質的水平比相應的生物或其部分按重量計高至少0.5%(w/w)和/或在相對的基礎上高至少l%(w/w)。
37.根據權利要求35或36所述的轉基因非人生物或其部分，其中所述轉基因非人生物或其部分的總非極性脂質含量當與相應的生物或其部分相比時是升高的。`
38.根據權利要求37所述的轉基因非人生物或其部分，其中所述轉基因非人生物或其部分的總非極性脂質含量比相應的生物或其部分按重量計高至少0.5%(w/w)和/或在相對的基礎上高至少1%。
39.根據權利要求35至38中任一項所述的轉基因非人生物或其部分，其中所述轉基因非人生物或其部分的提取的脂質中的多不飽和脂肪酸含量當與相應生物或其部分的提取的脂質相比時是升高的。
40.根據權利要求35至39中任一項所述的轉基因非人生物或其部分，其中所述提取的脂質中多不飽和脂肪酸的含量當與從相應生物或其部分提取的脂質相比時是升高的，其中所述多不飽和脂肪酸包括二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、α-亞麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)或它們中兩種或更多種的組合。
41.根據權利要求35至40中任一項所述的轉基因非人生物或其部分，其中所述一種或多種外源多核苷酸編碼:i)MGAT,ii)DGAT2,iii)MGAT和 GPAT，iV)MGAT 和 DGAT，或V)MGAT、GPAT 和 DGAT。
42.根據權利要求41所述的轉基因非人生物，其中所述GPAT還具有磷酸酶活性以產生MAG,如擬南芥GPAT4或GPAT6。
43.根據權利要求41或42所述的轉基因非人生物，其中所述DGAT為DGAT2。
44.根據權利要求41至43中任一項所述的轉基因非人生物或其部分，其中編碼MGAT的外源多核苷酸包含以下一種或多種: i)選自SEQID NO:1至44任一的核苷酸序列， ii)編碼包含具有SEQID N0:45至82任一提供的序列的氨基酸的多肽或其生物學活性片段的核苷酸序列， iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及 iv)在嚴格條件下與i)至iii)任一雜交的核苷酸序列。
45.根據權利要求41至44中任一項所述的轉基因非人生物或其部分，其中編碼GPAT的外源多核苷酸包含以下一種或多種: i)選自SEQID N0:84至141任一的核苷酸序列， ii)編碼包含具有SEQID NO: 144至201任一提供的序列的氨基酸的多肽或其生物學活性片段的核苷酸序列， iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及 iv)在嚴格條件下與i)至iii)任一雜交的核苷酸序列。
46.根據權利要求41至45中任一項所述的轉基因非人生物或其部分，其中編碼DGAT2的外源多核苷酸包含以下一種或多種: i)SEQID N0:204的核苷酸序列， ii)編碼包含具有SEQID NO:212提供的序列的氨基酸的多肽或其生物學活性片段的核苷酸序列， iii)與i)或ii)至少50%相同的核苷酸序列，以及 iv)在嚴格條件下與i)至iii)任一雜交的核苷酸序列。
47.根據權利要求44至46中任一項所述的轉基因非人生物或其部分，其中所述轉基因生物或其部分的一種或多種非極性脂質水平和/或總脂質含量比不含所述一種或多種外源多核苷酸但包含編碼擬南芥DGATl的外源多核苷酸的相應生物或其部分按重量計高至少0.5%(w/w)和/或在相對的基礎上高至少l%(w/w)。
48.根據權利要求35至47中任一項所述的轉基因非人生物，其中所述轉基因非人生物為植物、藻類或適合發酵的生物如酵母或真菌。
49.一種轉基因非人生物,其包含一種或多種外源多核苷酸,所述外源多核苷酸編碼:i)MGAT,ii)DGAT2,iii)MGAT和 GPAT，iV)MGAT 和 DGAT，或V) MGAT、GPAT 和 DGAT。
50.根據權利要求49所述的轉基因非人生物或其部分，其進一步特征在于權利要求35至48中任一項所述的一項或多項特征。
51.一種獲得具有增強的產生一種或多種非極性脂質的能力的細胞的方法，所述方法包括: i)向細胞引入一種或多種外源多核苷酸，所述外源多核苷酸編碼a)MGAT，b)DGAT2c)MGAT和 GPAT d)MGAT和 DGAT，或e)MGAT、GPAT 和 DGAT ； 其中所述一種或多種外源多核苷酸可操作地連接至一種或多種能夠指導所述一種或多種外源多核苷酸在所述細胞中表達的啟動子， ii)在所述細胞中表達所述一種或多種外源多核苷酸， iii)分析所述細胞的脂質含量，以及 iv)選擇當與不含所述外源多核苷酸的相應細胞相比時具有升高水平的一種或多種非極性脂質的細胞。
52.根據權利要求51所述的方法，其中選擇的細胞具有如權利要求36至48任一項所定義的生物或其部分的 特征中的一種或多種。
53.根據權利要求51或52所述的方法，其中第一和第二外源多核苷酸穩定整合到所述細胞的基因組中。
54.根據權利要求53所述的方法，進一步包括從步驟i)的細胞再生轉基因植物的步驟。
55.—種使用權利要求51至54中任一項所述的方法獲得的轉基因細胞或植物，或由其獲得的轉基因植物部分。
56.—種或多種外源多核苷酸用于產生當與不含所述一種或多種外源多核苷酸的相應生物或其部分相比時具有增強的產生一種或多種非極性脂質的能力的轉基因非人生物或其部分的用途，所述外源多核苷酸編碼:i)MGAT,ii)DGAT2,iii)MGAT和 GPATiV)MGAT 和 DGAT，或V) MGAT、GPAT 和 DGAT。
57.一種植物的轉基因種子，所述種子包含一種或多種外源多核苷酸并與不含所述外源多核苷酸的相應種子相比具有升高水平的一種或多種非極性脂質。
58.根據權利要求57所述的轉基因種子，所述轉基因種子包含權利要求36至48所定義的特征中的一種或多種。
59.一種轉基因植物，其產生權利要求57或58所述的種子。
60.根據權利要求59所述的轉基因植物,其中所述植物為蕓苔(Brassicasp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、亞麻(Linum usitatissimum)、向日葵(Helianthus sp.)、紅花(Carthamus tinctorius)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、兩色高梁(Sorghum bicolor)、高梁(Sorghum vulgare)、燕麥(Avena sativa)、三葉草(Trifolium sp.)、亞麻莽(Camelina sativa)、異源三倍體芒草奇崗(Miscanthus xgiganteus)或中國芒(Miscanthus sinensis)。
61.—種產生種子的方法，所述方法包括: i)使權利要求59或60所述的轉基因植物生長，以及 ii)收獲所述種子。
62.一種發酵方法，包括以下步驟: i)提供含有液體組合物的容器以及發酵和脂肪酸生物合成所需的成分，所述液體組合物包含適合發酵的權利要求48所述的轉基因非人生物，以及 ii)提供有利于所述容器中所含的液體組合物發酵的條件。
63.可通過權利要求1至34中任一項所述的方法獲得的，或者可通過權利要求35至50中任一項所述的轉基因非人生物或其部分、權利要求55所述的轉基因細胞或植物、權利要求57或58所述的轉基因種子、或權利要求59或60所述的轉基因植物獲得的提取的脂質。
64.一種可從轉基因非人生物或其部分獲得的提取的脂質，其包含按所述提取的脂質的重量計至少1% (w/w)的DAG含量。
65.權利要求35至50中任一項所述的轉基因非人生物或其部分、權利要求55所述的轉基因細胞或植物、權利要求57或58所述的轉基因種子、權利要求59或60所述的轉基因植物、或者權利要求63或64所述的提取的脂質用于制造工業產品的用途。
66.根據權利要求65所述的用`途，其中所述工業產品為燃料。
67.—種產生燃料的方法，所述方法包括: i)任選地在存在催化劑的情況下將權利要求63或64所述的脂質與醇反應以產生烷基酯，以及 ii)任選地將所述烷基酯與基于石油的燃料共混。
68.根據權利要求67所述的方法，其中所述烷基酯為甲酯。
69.一種產生飼料的方法，所述方法包括將權利要求35至50中任一項所述的轉基因非人生物或其部分、權利要求55所述的轉基因細胞或植物、權利要求57或58所述的轉基因種子、權利要求59或60所述的轉基因植物、或者權利要求63或64所述的提取的脂質、或其提取物或部分與至少一種其他食品成分混合。
70.飼料、化妝品或化學品，其包含權利要求35至50中任一項所述的轉基因非人生物或其部分、權利要求55所述的轉基因細胞或植物、權利要求57或58所述的轉基因種子、權利要求59或60所述的轉基因植物、或者權利要求63或64所述的提取的脂質、或其提取物或部分。
71.一種用于鑒定編碼在細胞中產生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基轉移酶的核酸分子的方法，所述方法包括: i)獲得包含可操作地連接到在細胞中具有活性的啟動子的核酸分子的細胞，其中所述核酸分子包含如權利要求27、28或29中任一項或多項所定義的核苷酸序列和/或編碼具有SEQ ID NO: 220、221、222、223、224、225、226和227所提供的一種或多種氨基酸序列或與其至少50%、優選至少60%、更優選至少65%相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列， ii)確定所述細胞中產生的MAG、DAG和/或TAG的水平當與不含所述核酸的相應細胞相比時是否是升高的，以及 iii)鑒定編碼在所述細胞中產生MAG、DAG和/或TAG的能力升高的酰基轉移酶的核酸分子。
72.根據權利要求71所述的方法，其中所述酰基轉移酶催化MGAT途徑中的酶反應。
73.根據權利要求71或72所述的方法，其中所述酰基轉移酶為MGAT、GPAT和/或DGAT。
74.根據權利要求73所述的方法，其中所述GPAT還具有磷酸酶活性以產生MAG，如擬南芥 GPAT4 或 GPAT6。
75.根據權利要求73或74所述的方法，其中所述DGAT為DGAT2。
76.根據權利要求71至75中任一項所述的方法，進一步包括在步驟i)前向細胞中引入所述核酸分子。
77.根據權利要求71至76中任一項所述的方法，其中所述細胞為植物細胞。
78.根據權利要求 71至77中任一項所述的方法，其中所述酰基轉移酶比擬南芥DGATl更多地提高所述細胞中TAG的產生。
79.一種分離和/或重組的多核苷酸，其包含: i)選自SEQID N0:1至6任一的核苷酸序列，或 ii)與i)至少80%相同的核苷酸序列。
80.—種載體,其包含權利要求79所述的多核苷酸。
81.—種轉基因細胞，其包含權利要求79所述的多核苷酸或權利要求80所述的載體。
82.—種轉基因非人生物或其部分，其包含權利要求79所述的多核苷酸、權利要求80所述的載體或權利要求81所述的轉基因細胞。
全文摘要
本發明涉及產生脂質的方法。具體地，本發明涉及提高轉基因生物或其部分中的一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量的方法。在一個特定的實施方案中，本發明涉及使用例如單酰基甘油酰基轉移酶(MGAT)的酰基轉移酶提高植物、植物種子和/或葉子、藻類和真菌中的一種或多種非極性脂質水平和/或總非極性脂質含量。
文檔編號C12N9/10GK103201379SQ201180041568
公開日2013年7月10日 申請日期2011年6月28日 優先權日2010年6月28日
發明者J·皮特里, T·瓦赫克, P·什雷斯塔, 柳青, S·P·辛格, 周雪榮 申請人:聯邦科學技術研究組織