專利名稱：使脂質糖基化的方法
技術領域：
本發明涉及酶的新用途。特別地，本發明涉及轉糖苷酶在多個新應用中的用途，特 別是在向脂質轉移葡萄糖以及具有改進乳化性質的食品中的用途。
背景技術：
轉葡糖苷酶(E. C. 3. 2. 1. 20)(也稱作D-葡糖基轉移酶或α -葡糖苷酶)可作 為TGL-500 商購自Danisco/Genencor。此酶可源自真菌源，特別是黑曲霉(Aspergillus niger, Genbank 登錄號 D45356. 1 和 SwissProt 登錄號 P56526. 1)。上述轉葡糖苷酶的主要應用是生產異麥芽低聚糖(ΙΜ0)，其為小α_1，6支 鏈低聚糖，參見'Novel α -Glucosidase from Aspergillus nidulans with Strong Transglycosylation Activity，N. (Kato et al. (2002)) 通過應用轉葡糖苷酶由麥芽 糖/麥芽糊精生產可商購的IMO產品終產品包含異麥芽糖、異麥芽三糖和潘糖的混合物。 TGL-500 在與α-D-葡萄低聚糖一起溫育時催化水解反應和轉移反應。轉移反應最常發 生在C-6位的羥基基團，從而由D-葡萄糖生產異麥芽糖，由潘糖生產麥芽糖。此前已發現由轉葡糖苷酶催化的α -烷基葡糖苷一步合成法(Busquet，Μ. _P. et al. (1998).Monsan，P. et al.)。來自Talaromyces duponti和黑曲霉的轉葡糖苷酶已被用 于催化葡糖基單元從α -1，4連接的碳水化合物供體轉移到烷基醇，例如1-丁醇，從而產生 烷基葡糖苷。糖脂和磷脂是小麥面粉內源極性脂質組分的主要成分。特別地，糖脂在面包制 造期間充當表面活性劑和/或乳化劑。糖脂對面包的體積、質地和老化具有積極影響 (Pomeranz, Y. (1971))。因此，糖脂在面包制造期間可用作乳化劑和/或表面活性劑，以改 進面包的體積、質地和老化速率。糖脂主要改進烘焙產品的乳化性質。

發明內容
第一方面，本發明包括用于使具有游離羥基(-0Η)基團的脂質糖基化的方法，所 述方法包括使所述脂質接觸本文定義的單糖部分(monosaccharide moiety)源(source) 和本文定義的轉糖苷酶。第二方面，本發明包括通過使具有游離羥基(-0H)基團的脂質接觸本文定義的單 糖部分源和本文定義的轉糖苷酶，將單糖部分轉移到所述脂質的方法。第三方面，本發明包括用于改進食品乳化性質的方法，所述方法包括使本文定義 的所述食品或食品中間品接觸如本文定義的單糖部分源、本文定義的脂質和本文定義的轉 糖苷酶。第四方面，本發明包括用于在食品中原位生產糖基化脂質的方法，所述方法包括 使本文定義的所述食品或食品中間品接觸本文定義的單糖部分源，本文定義的脂質以及本 文定義的轉糖苷酶。第五方面，本發明包括本文定義的轉糖苷酶在將單糖部分轉移到本文定義的具有游離羥基(-0H)基團的脂質中的應用。第六方面，本發明包括本文定義的轉糖苷酶在改進食品乳化性質中的應用，其中 所述食品包括本文定義的具有游離羥基(-0H)基團的脂質和本文定義的單糖部分源。其他方面，本發明包括用于改進食品的組合物和通過上述方法形成的食品。下文 將更詳細地闡述這些內容。


圖1說明了在實施例1中TGL-500在體外產生的單葡糖基甘油單酯(MGMG)和二 葡糖基甘油單酯(DGMG)的量；圖2說明了在實施例1中TGL-500在體外產生的單葡糖基甘油二酯(MGDG)的量；圖3說明了實施例2的生面團在發酵后的單半乳糖基/葡糖基甘油單酯(MGMG) 含量(％)；圖4說明了實施例2的生面團在發酵后的二半乳糖基/葡糖基甘油單酯(DGMG) 含量(％)；圖5說明了實施例2的生面團在發酵后的單半乳糖基/葡糖基甘油二酯(MGDG) 含量(％)；圖6說明了實施例2的生面團在發酵后的二半乳糖基/葡糖基甘油二酯(DGDG) 含量(％)；圖7說明了實施例2的面包屑中單半乳糖基/葡糖基甘油單酯(MGMG)含量(％)圖8說明了實施例2的面包屑中二半乳糖基/葡糖基甘油單酯(DGMG)含量(％)圖9說明了實施例2的面包屑中單半乳糖基/葡糖基甘油二酯(MGDG)含量(％)圖10說明了實施例2的面包屑中二半乳糖基/葡糖基甘油二酯(DGDG)含量 (%)；圖11說明了實施例3中通過應用麥芽糊精作為底物，由TGL-500在體外產生的 MGMG 禾口 DGMG ；禾口圖12說明了通過應用蔗糖作為底物，由TGL-500在體外產生的MGMG和DGMG。
具體實施例方式下文描述了本發明的優選實施方式。除非另有特別說明，所述優選實施方式應用 于本發明的所有方面，包括本文描述和請求保護的所有方法、應用和產品。糖基化作用/轉糖苷酶—方面，本發明包括用于使脂質糖基化的方法，所述方法包括使所述脂質接觸本 文定義的單糖部分源和本文定義的轉糖苷酶。在本申請中，術語“糖基化作用”和“糖基化”是指在單糖部分異頭位的半縮醛羥 基和脂質受體分子上游離羥基的氧之間形成糖苷鍵，并隨后脫去水分子。所形成的糖苷鍵 可以是α-或β-糖苷鍵。本發明是基于本文定義的轉糖苷酶能夠將單糖部分，特別是葡萄糖部分轉移到本 文定義的脂質的驚人發現。通過應用脂質，特別是甘油單酯和甘油二酯作為生面團體系中 葡萄糖部分的受體底物，在原位產生甘油糖脂預期此類化合物在生面團體系中發揮強乳化性質。已知小麥面粉包含非常少量的半乳糖基修飾的甘油單酯和甘油二酯，例如單半乳 糖基甘油單酯和二半乳糖基甘油單酯，這些甘油酯具有很好的乳化作用(參見Carter et al. (1956)，Carter et al. (1961)禾口 Carter et al. (1961), 1 Pomeranz, Y. (1987))。在本申請中，術語“轉糖苷酶”旨在涵蓋能夠將本文定義的單糖部分從一個分子轉 移到另一個分子的任何酶。當所述單糖部分是葡萄糖部分時，使用術語“轉葡糖苷酶”。優 選所述轉糖苷酶是轉葡糖苷酶。如上文概述，已知轉糖苷酶(特別是轉葡糖苷酶)能夠將單糖部分轉移到其他碳 水化合物但是，此前并未發現此類酶能夠將單糖部分轉移到脂質。在一個實施方式中，所述轉糖苷酶歸類于酶分類(Enzyme Classification) (Ε. C. )3. 2. 1. 20。在一個實施方式中，所述轉糖苷酶歸類于碳水化合物活性酶數據庫 (Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy) database)的糖苷水解酶家族31。此數據庫描述于 http //www, cazy. org/ 禾口 Coutinho, P. Μ· & Henrissat，B. (1999)。此分類系統基于結構 和序列特征，而非底物特異性由于序列和折疊類似性之間存在直接關系，此分類(i)與 其單獨的底物特異性相比，更好地反映了這些酶的結構特征，(ii)有助于揭示這些酶之間 的進化關系，和(iii)提供了用于推導機制信息的便捷工具。在此分類中，糖苷水解酶(EC 3. 2. 1.-)是分布廣泛的酶類，其水解兩個或更多碳水化合物之間的糖苷鍵，或者碳水化合 物和非碳水化合物部分之間的糖苷鍵。關于糖苷水解酶(糖苷酶和轉糖苷酶)分類的更多 δ ^ηΤΒΤ Henrissat B(1991)， Henrissat B, Bairoch A(1993)， Henrissat B, Bairoch A(1996), Davies G, Henrissat B(1995)and Henrissat B, Davies GJ(1997)。在另一個實施方式中，可根據其進行的反應，從功能上來描述轉糖苷酶或轉葡糖 苷酶。在本發明中，可使用在實施例1所述條件下將糖部分轉移到脂質的酶。可以通過其在體外將糖部分從適合的單糖源轉移到ClO甘油單酯的能力來確定 適合用于本發明的酶。可用于檢測本發明中使用的候選酶，以確定其是否能夠將糖部分轉移到脂質的試 驗實例包括以下步驟將候選酶與ClO甘油單酯的溶液以及適合的單糖源一起溫育；和通過液相色譜-質譜分析確定糖是否被轉移到甘油單酯。例如，可在實施例1所述條件下，以候選酶代替TGL-500進行此類試驗。在一個實施方式中，所述轉糖苷酶可得自于或得自于活的生物體。適合的轉糖苷 酶來自于細菌或真菌。優選轉糖苷酶來自于真菌。在一個實施方式中，所述轉糖苷酶來自于真菌源，或與來自于真菌源的轉葡糖苷 酶具有至少50%，優選至少55%，例如至少60%，如至少65%，至少70%，至少75%，至少 80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%序列同一性。在優選的實施方式中，所述轉糖苷酶源自曲霉菌(Aspergillus)種(species)，特 SiJ^it SH(Aspergillus awamori)(Aspergillus terreus) 曲霉(Aspergillus oryzae)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、煙曲霉(Aspergullus fumigatus)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)的曲霉菌種，或者與源自曲霉菌種的轉葡糖苷酶具有至少50 %，優選至少55 %，例如至少60 %，如至少65 %，至少70 %，至少75 %， 至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %或至少99 %序 列同一性。在特別優選的實施方式中，所述轉糖苷酶是SEQ ID No. 1編碼的黑曲霉轉葡糖 苷酶，或與其具有至少50 %，優選至少55 %，例如至少60 %，如至少65 %，至少70 %，至少 75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少 99%序列同一性。所述轉葡糖苷酶可經過翻譯后修飾，例如切除信號肽或糖基化的修飾。氨基酸序列在本發明中可使用如本文定義的能夠將單糖部分轉移到脂質的轉糖苷酶的氨基 酸序列，特別是具有下文所述SEQ ID No. 2的氨基酸序列的轉糖苷酶。本文中使用的術語“氨基酸序列”與術語“多肽”和/或術語“蛋白質”含義相同。 在一些情況下，術語“氨基酸序列，，與術語“肽”含義相同。在一些情況下，術語“氨基酸序 列”與術語“酶”含義相同。可從適當的來源制備/分離氨基酸序列，或通過合成制備氨基酸序列，或通過使 用重組DNA技術制備。本發明使用的蛋白質可與其他蛋白，特別是其他酶，例如淀粉酶、蛋白酶或脂肪酶 結合使用。因此，本發明還涵蓋了包含酶組合的組合物，其中所述組合包括用于本發明的轉 糖苷酶和其他酶，所述其他酶可以是，例如本文描述的另一種轉糖苷酶。在下文部分中討論 了這方面的內容。序列同一性/序列同源性/變體/責源物/衍生物 本發明還包括與本文限定的氨基酸序列，或具有本文定義的特定性質的多肽具有 一定序列同一性或序列同源性的多肽的應用。特別地，本發明包括與下文所述SEQ ID No. 2 或SEQ ID No. 4具有一定序列同一性的肽，或其同源物。在本文中，術語“同源物”是指與 目標氨基酸或目標核苷酸序列具有序列同一性的實體。在本文中，術語“同源性”可等同于 “序列同一性”。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列應提供和/或編碼保留了轉糖苷酶功能活性和 /或增強了轉糖苷酶活性的多肽。在本文中，所采用的同源序列包括與目標序列具有至少50 %，優選至少55 %，例 如至少60%，如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少 95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %或至少99 %同一性的氨基酸序列。同源物通常將包 含與目標氨基酸序列相同的活性位點等。盡管也可將同源性視為類似性(即具有類似化學 性質/功能的氨基酸殘基)，但在本文中，優選以術語序列同一性表示同源性。在特別優選的實施方式中，所述轉糖苷酶是具有SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所 示序列的黑曲霉轉葡糖苷酶，或與其具有至少50 %，優選至少55 %，例如至少60 %，如至少 65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少 97%，至少98%或至少99%序列同一性的序列。可通過目測進行序列同一性比對，但更常借助于易于獲得的序列比對程序進行。 這些商用計算機程序使用復雜的比較算法來比對兩條或更多的序列，所述序列最好地反映可能導致所述兩條或更多序列之間差異的進化事件。因此，這些算法利用了對同一性或類 似氨基酸的比對加分，并對間隙插入、間隙延伸和不類似氨基酸比對罰分的記分系統進行 操作。比較算法的記分系統包括i)在每次插入空位時給出罰分(空位罰分)，ii)在現存空位每延伸額外一位時給出罰分(延伸罰分)，iii)對相同氨基酸的比對給出高分，并且iv)對不相同氨基酸的比對給出不同的分數。大多數比對程序允許更改空位罰分。然而，在使用此類軟件進行序列比對時，優選 使用默認值。根據所謂替換矩陣(substitution matrix)的記分矩陣確定對不相同氨基酸的 比對給出的分數。此類替換矩陣提供的分數反映了在進化過程中一個氨基酸被另一個氨 基酸取代的可能性不同，并且依賴于待取代氨基酸的物理/化學性質的事實。例如，極性 氨基酸被另一種極性氨基酸取代的可能性大于被疏水性氨基酸取代的可能性。因此，記分 矩陣將對相同的氨基酸給出最高的分數，對不相同但近似的氨基酸給出較低的分數，而對 不相同且不近似的氨基酸給出更低的分數。最常用的記分矩陣是PAM矩陣(Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992))、BL0SUM矩陣(Henikoff and Henikoff (1992))和Gonnet 矩陣(Gonnet et al. (1992))。用于進行此類比對的適合的計算機程序包括，但不限于Vector NTI (Invitrogen Corp.)，以及 ClustalV、ClustalW 和 ClustalW2 程序(Higgins DG & Sharp PM (1988)、 (1992) ,Thompson et al. (1994),Larkin et aK2007))。可由 www, expasy. orR 的 ExPASy 蛋白質組學服務器選擇不同的比對工具。可進行序列比對的軟件的另一個實例是可得自 于美國國家生物技術信息中心主頁的BLAST (Basic Local Alignment Search iTool),目前 可在 //www. ncbi. nlm. nih. rov/ 上找到，并且首次描述于 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 ；403-410。一旦由軟件產生比對，即可計算相似性％或序列同一性％。軟件通常將其作為序 列比對的一部分進行，并產生數值結果。在一個實施例中，優選使用ClustalW軟件進行序列比對。優選使用以下配對比對 參數進行ClustalW比對
替換矩陣Gonnet 250空位開放罰分20空位延伸罰分0. 2空位結束罰分無Clustalff2可得自于，例如歐洲生物信息研究所的EMBL-EBI網頁www.ebi.ac.uk, 工具欄-序列分析-ClustalW2。目前，ClustalW2工具的具體網址是www, ebi. ac. uk/Tools/ clustalw20因此，本發明還包括如本文定義的蛋白質的任意氨基酸序列的變體、同源物和衍生物的應用，特別是如下文定義的SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4的那些或由SEQ ID No. 1 編碼的那些。所述序列，特別是SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4，也可具有氨基酸殘基的刪除、插 入或取代，從而產生沉默突變或導致功能等價物。只要保留了所述物質的次級結合活性，可 基于殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質上的類似性進行謹慎的氨 基酸取代。例如，帶負電的氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和 精氨酸；而具有類似親水性值的不帶電極性頭部基團的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨 酸、甘氨酸、丙氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。本發明還包括保守取代(本文中使用的取代和替換均表示現有氨基酸殘基與可 選殘基之間的相互交換)，其可發生在所謂同類取代(like-for-like substitution)，例如 堿性取代堿性，酸性取代酸性，極性取代極性等。也可發生非保守取代，即從一類殘基到另 一類殘基，或涉及并入非天然氨基酸，例如鳥氨酸(下文稱為Z)、二氨基丁酸鳥氨酸(下文 稱為B)、正亮氨酸鳥氨酸(下文稱為0)、吡啶基丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩基丙氨酸、萘 基丙氨酸和苯基甘氨酸。可通過，例如堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天門 冬氨酸)、脂肪族氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺、天 門冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、羥基氨基酸(絲氨 酸、蘇氨酸)、大氨基酸(苯丙氨酸和色氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)的分類之內進 行保守取代。也可通過非天然氨基酸進行替換，所述非天然氨基酸包括α*和α-二取代*氨基 酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的鹵化衍生物，例如三氟酪氨酸\p-Cl-苯丙氨酸*、 P-Br-苯丙氨酸*、P-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β -丙氨酸*、L- α -氨基丁酸*、 L-Y-氨基丁酸*、L_ α -氨基異丁酸*、L_ ε -氨基己酸#、7_氨基庚酸*、L_蛋氨酸砜*、L_正 亮氨酸*、L-正纈氨酸*、ρ-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羥脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸 (Phe)的甲基衍生物，例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe (4-氨基)#、L-TyH甲基)*、 L-Phe (4-異丙基)*、L-Tic (1,2,3,4-四氫異喹啉_3_羧酸)*、L_ 二氨基丙酸和L-Phe (4-苯 甲基廣。出于上述討論(涉及同源或非保守取代)的目的，使用符號*表示衍生物的疏水 性質，而使用#表示衍生物的親水性質，表示兩性性質。變體氨基酸序列可包括可插入到序列任意兩個氨基酸殘基之間的適合的間隔子 基團；除了氨基酸間隔子，如甘氨酸或丙氨酸殘基之外，所述間隔子基團還包括烷基基 團，例如甲基、乙基或丙基基團。本領域技術人員還可充分理解另一類變體，其涉及存在類 肽(peptoid)形式的一個或多個氨基酸殘基。為了避免爭議，所用“類肽形式”是指變體氨 基酸殘基，其中α-碳取代基位于殘基的氮原子上而不是α-碳原子上。類肽形式的肽的 制備方法在本領域是公知的，例如Simon RJ et al. (1992)、Horwell DC. (1995)。在優選的實施方式中，所述轉葡糖苷酶是由具有SEQ ID No. 1所示序列的核酸編 碼的具有SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列的黑曲霉轉葡糖苷酶，或與其具有 至少50 %，優選至少55 %，例如至少60 %，如至少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至 少85 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %或至少99 %氨基酸序列同一 性的酶。
一方面，優選本發明中使用的酶為純化的形式的。術語“純化的”是指給定的成分 以高水平存在。理想地，該成分是存在于組合物中的主要活性成分。量/濃度本發明糖基化方法中所需的轉糖苷酶的量沒有特別限制。在一個實施方式中，本發明糖基化方法中需要有效量的轉糖苷酶。特別地，在一個 實施方式中，本發明提供了用于使具有游離羥基基團的脂質糖基化的方法，所述方法包括 使所述脂質接觸單糖部分源和有效量的轉糖苷酶。在一個實施方式中，本發明的食品包含有效量的轉糖苷酶。特別地，在一個實施方 式中，本發明提供了用于改進食品的組合物，其包含如本文定義的轉糖苷酶；如本文定義 的單糖部分源；和如本文定義的脂質。在本申請中，術語“有效量”是指能夠使可測量量的單糖部分轉移到脂質受體分子 的轉糖苷酶的量。可使用液相色譜-質譜法(LC-MQ測量轉移到脂質受體分子的單糖部分的量。例如，可在反應期間的不同時間點測量反應混合物中單糖源量的減少，或糖脂量 的增加。轉糖苷酶可以以任意濃度存在，只要該濃度能夠實施將單糖部分，特別是葡萄糖 部分轉移到脂質的上述所需功能。在一個實施方式中，轉糖苷酶以每克脂質受體0. 02-200個轉葡糖苷酶活性單位 (U)的濃度存在，優選0. 08-50U,且最優選0. 2-20U。在一個實施方式中，轉糖苷酶以每摩爾脂質受體0.0001-1個轉葡糖苷酶活性單 位(U)的濃度存在，優選0. 0005-0. 2U，且最優選0. 001-0. IU0在本文中，一個轉葡糖苷酶活性單位(U)被定義為當底物為麥芽糖時，每分鐘產 生1微摩爾潘糖所需的酶量。被轉移的單糖由轉糖苷酶轉移到脂質的單糖部分的性質不是特別重要。所述單糖部分可具有 D-或L-構型。此外，所述單糖部分可以是醛糖或酮糖部分。適合地，所述單糖部分可具有3-8個碳原子，優選4-6個，且更優選5或6個碳原 子。在一個實施方式中，所述單糖部分是己糖部分(即具有6個碳原子)，其實例包括己醛 糖，例如葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔羅糖，和己酮醣，例如 果糖和山梨糖。優選地，所述己糖部分是葡萄糖部分。在另一個實施方式中，所述單糖部分是戊糖部分(即具有5個碳原子)，例如核糖、 阿拉伯糖、木糖和來蘇糖。優選地，戊糖部分是阿拉伯糖或木糖部分。單糖源本發明待轉移的單糖部分源不是特別重要，只要其包含通過在轉移過程期間被酶 水解的糖苷鍵與所述源分子其他部分相連的單糖部分。然而，優選本發明的單糖源是高級糖(即二糖、寡糖或多糖)，其包含通過糖苷鍵 連接在一起的多于一個的單糖部分，酶的作用在于水解高級糖中的一個或多個糖苷鍵，并 將單糖轉移到脂質。在這方面，形成高級糖的單糖部分可相同或不同，并可各自獨立地具有 D-或L-構型。
形成高級糖的單糖部分可各自獨立地為醛醣或酮糖部分，并可具有相同或不同數 量的碳原子。適合地，各單糖部分可具有3-8個碳原子，優選4-6個，且更優選5或6個碳 原子。在一個實施方式中，形成高級糖的單糖部分是己糖部分，其實例包括己醛糖，例如 葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖和塔羅糖，和己酮醣，例如果糖和 山梨糖。優選地，此類高級糖的己糖部分包括一個或多個葡萄糖部分。在一個特別優選的 實施方式中，此類高級糖的所有己糖部分都是葡萄糖部分。在另一個實施方式中，形成高級糖的單糖部分是戊糖部分，例如核糖、阿拉伯糖、 木糖和來蘇糖。優選地，此類高級糖的戊糖部分是阿拉伯糖部分或木糖部分。形成高級糖的單糖部分通過糖苷鍵連接在一起。當所述單糖部分是己糖部分 時，所述糖苷鍵可以是1_α，1' -α糖苷鍵、1，2' _糖苷鍵(其可以是1_ α _2 ‘或 1' "β"2'糖苷鍵)、1，3'-糖苷鍵(其可以是Ι-α-3'或1-β-3'糖苷鍵)、1，4'-糖 苷鍵(其可以是1-α-4'或1-β_4'糖苷鍵)、1，6' _糖苷鍵(其可以是1_ α _6 ‘或 1-β-6'糖苷鍵)、或其任意組合。在一個實施方式中，高級糖包括2個單糖單元(也就是二糖)。適合的二糖的實例 包括麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖(isomaltulose)、乳糖、蔗糖、纖維二糖、黑曲霉糖、曲二 糖、海藻糖(trehalose)和蔗糖異構糖(trehalulose)。在另一個實施方式中，高級糖包括鏈中的3-10個單糖單元(也就是寡糖)，所述鏈 可為直鏈或支鏈。優選所述寡糖包含3-8個單糖單元，更優選3-6個單糖單元。適合寡糖 的實例包括麥芽糊精、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、松三糖、纖維三 糖、纖維四糖、纖維五糖、纖維六糖和纖維七糖。在另一個實施方式中，高級糖是多糖，其包含通過糖苷鍵連接在一起的至少10個 單糖單元。此類多糖通常包含至少40個單糖單元，例如至少100個，如至少200個，包括至 少500個，例如至少1000個，如至少5000個，例如10000個，如至少50000個，例如100000
個單糖單元。此類多糖中的單糖單元可以連接成鏈，可以為支鏈或直鏈在本文中，此類多糖被 稱作“鏈狀多糖”。或者，單糖單元也可連接成環(其可具有，例如10-200，優選10-100，更 優選10-50，且最優選10-20個單糖單元)，其可具有一個或多個(優選1或2個)側鏈，每 個側鏈包含1-6個(優選1-4，更優選1或2個)單糖單元在本文中，此類多糖被稱作“環 狀多糖”。在一些實施方式中，所述多糖包含10-500000個單糖單元。在其他實施方式中，所 述多糖包含100-1000個單糖單元。在其他實施方式中，所述多糖包含1000-10000個單糖 單元。在其他實施方式中，所述多糖包含個單糖單元。在一些實施方式中， 所述多糖包含40-3000，優選200-2500個單糖單元。此類多糖的實例包括淀粉及其衍生物(例如陽離子或陰離子、氧化或磷酸化的淀 粉)、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、纖維素或其衍生物(例如羧甲基纖維素)、海藻酸或其鹽或 衍生物、聚葡萄糖、果膠、普魯蘭多糖(pullulan)、角叉菜膠、刺槐豆膠，以及瓜耳膠及其衍 生物(例如陽離子或陰離子瓜耳膠)。在一個實施方式中，所述多糖包括淀粉。淀粉是葡萄糖聚合物，其中吡喃葡萄糖單元通過α-連接結合。其由直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物構成。直鏈淀粉由通過1， 4' -α-糖苷鍵連接在一起的數百個葡萄糖分子的直鏈組成。與此不同，支鏈淀粉是由數 千個葡萄糖單元組成的支鏈分子，其主鏈包含1，4 ‘ -α-糖苷鍵，但每隔約25個葡萄糖單 元具有1，6' -α-糖苷分枝。在一個實施方式中，所述多糖包括糖原。糖原是在動物中發現的多糖，其由葡萄糖 殘基的支鏈構成。在一個實施方式中，所述多糖包括纖維素。纖維素是由通過1，4' 糖苷鍵結 合在一起的數千個葡萄糖單元形成的聚合物。優選的單糖部分源包括蔗糖、麥芽糖和麥芽糊精。特別優選的單糖部分源是蔗糖。下表2中列出了本領域已知轉糖苷酶，以及此類轉糖苷酶能夠水解的高級糖(因 此是用于轉移單糖部分的潛在單糖源)的實例。表2
底物酶源參考文獻麥芽糖、黑曲霉糖、曲二糖黑曲霉McCleary, B. V., and T. S. Gibson. 1989. Carbohydr. Res. 1185: 147-162麥芽糖米曲霉Pazur, J. H., and D. French. 1952. J. Bio. Chem. 251:265-271麥芽糖、麥芽五糖、麥芽糊精、可 溶淀粉Talaromyces dupontiUS 5773256麥芽糊精(鏈長2-5個葡萄糖單元)、 異麥芽糖、黑曲霉糖、曲二糖、海 藻糖構巢曲霉Kato, N·, et al 2002. Appl Environ Microbiol. 68. 1250-1256蔗糖、蔗糖異構糖、松三糖黑曲霉EP 622487B1在另一個實施方式中，所述單糖源可以是單糖磷酸酯。可通過，例如下文所述的三 磷酸腺苷(ATP)與單糖的磷酸轉移酶催化反應形成此類化合物。在一個實施方式中，單糖部分源和/或脂質優選不是小麥面粉。在一個實施方式中，單糖源與脂質的比例足以在反應混合物中提供1 1的單 糖脂質比例。各單糖可被轉移到一個脂質以形成一個糖脂。因此，作用于單糖源的每個 水解反應，可由一個脂質分子形成一個糖脂分子。在另一個實施方式中，提供相對于脂質的量為過量的單糖，從而使單糖脂質比 例大于1 1。可使用過量的單糖源驅動反應平衡向生產糖脂的方向移動。優選單糖脂質比例至少為1 1，優選至少1.5 1，至少2 1，至少2.5 1 或至少3 1。可在反應期間的不同時間點添加額外的單糖源以使得單糖過量，并使整個反應中 的反應平衡有利于糖脂的生產。在另一個實施方式中，提供相對于單糖的量為過量的脂質，從而使單糖脂質比 例小于1 1。
優選單糖脂質比例小于1 1，優選小于0.6 1，小于0.5 1，小于0.4 1 或小于0.3 1。在一個實施方式中，單糖部分源的添加量可以是面粉的10重量％ -20重量％，例 如面粉的8重量％-12重量％ (烘焙百分比)。脂質受體在本發明中，所述脂質可以是脂溶性(親脂性)的天然存在或合成分子，其具有游 離羥基(-0H)基團，并且能夠與轉移的單糖部分形成糖苷鍵。適合的脂質實例包括脂肪酸、 脂肪醇、單甘油脂和多甘油脂(特別是甘油單酯和甘油二酯)、糖脂和磷脂等。在本發明的 范圍內，所述脂質受體可包括脂質的混合物。本發明中的脂質可以不是甘油三酯，例如菜籽油或黃油。甘油三酯不是用于本發 明轉移反應的受體分子。甘油三酯可被例如脂肪酶部分水解，從而形成可用于本發明轉移 反應的受體分子(脂質)。所述“親脂性”是指可溶于非極性有機溶劑。優選所述非極性有機溶劑具有一個 或多個以下性質(a)低介電常數(例如，小于20，優選小于10的介電常數)；和/或(b)弱或零偶極矩(例如，小于1D，優選小于0.5D的偶極矩)；和/或(c)沒有或基本沒有氫鍵合基團(0-H和/或N-H)。此類非極性有機溶劑的實例包括脂肪烴，例如戊烷、己烷、庚烷，脂環烴，例如環 己烷，芳香烴，例如苯、甲苯或二甲苯，醚類，例如乙醚，和鹵代烴，例如二氯甲烷、三氯甲烷 (氯仿)和1，2-二氯乙烷。所述脂質通常包含一個或多個直鏈或支鏈，飽和或不飽和的烴基(例如烷基、烯 基或炔基)基團，優選所述烴基具有至少4個碳原子，優選6個碳原子，例如至少10個碳原 子，例如至少12，至少14，至少16，至少18，至少20或至少22個碳原子。優選所述烴基基 團是烷基基團。或者，所述烴基基團包含烯基基團，其可具有例如1-5個雙鍵，優選1、2或 3個雙鍵。在一個實施方式中，所述脂質包含一個或多個直鏈或支鏈，飽和或不飽和的烴基 (例如烷基、烯基或炔基)，優選所述烴基具有至少4-40個碳原子，優選6-40個碳原子，例 如至少10-40個碳原子，例如至少12-40，至少14-40、16-40、18-40、20-40或22-40個碳原 子，更優選10-24，特別是12-22，特別是14-18，如16-18個碳原子。優選所述烴基基團是烷 基基團。或者，所述烴基基團包含烯基基團，其可具有例如1-5個雙鍵，優選1、2或3個雙 鍵。在一個實施方式中，所述脂質包括一個或多個直鏈或支鏈，飽和或不飽和的酰基 基團，即式R-C ( = 0)-的基團，其中R是烴基基團。所述酰基基團通常具有至少4-40個碳 原子，優選6-40個碳原子，例如至少10-40個碳原子，例如至少12-40，至少14_40、16_40、 18-40、20-40或22-40個碳原子，更優選10-24，特別是12-22，特別是14-18，如16-18個碳 原子。優選所述酰基基團是烷酰基基團。或者，所述酰基基團包含烯酰基基團，其可具有例 如1-5個雙鍵，優選1、2或3個雙鍵。酰基基團的實例包括飽和酰基基團，例如丁酰基(丁酰)、己酰基(己酰)、辛酰 基(辛酰)、癸酰基(癸酰)、十二烷酰基(月桂酰)、十四烷酰基(肉豆蔻酰)、十六烷酰基(棕櫚酰)、十八烷酰基(硬脂酰)、二十烷酰基(花生四烯酰)、二十二碳酰基(山崳酰)和 二十四碳酰基(lignoceroyl)基團，和不飽和酰基基團，例如順式-十四烷_9_烯酰基(肉 豆蔻烯酰基)、順式-十六烷-9-烯酰基(棕櫚烯酰基)、順式-十八烷-9-烯酰基(油烯 基)、順，順式_9，12-十八烷二烯酰基(亞油烯基)、順，順，順式_9，12，15-十八碳三烯酰 基(亞麻烯基)和順，順，順，順式_5，8，11，14-二十碳五烯酰(花生四烯酰)基團。下文描述了適合作為本發明受體的一些典型脂質類型。在優選的實施方式中，所述脂質為單甘油脂(monoglycerolipid)或多甘油脂 (polyglycerolipid)。在本文中，術語“單甘油脂或多甘油脂”的定義為包含通過酯鍵與一 個或多個酰基基團(并且任選地與本文定義和例示的其他額外基團，例如糖部分)共價結 合的一個或多個甘油部分的化合物。酰基鏈的典型和優選長度如上文定義和例示。所述單甘油脂或多甘油脂必須具有至少一個游離羥基(-0H)基團，以使得能夠發 生單糖轉移。在本發明中，優選所述游離羥基基團存在于所述分子的甘油部分上。然而，在 側鏈(例如連接的糖部分)上具有一個或多個游離羥基基團的單甘油脂或多甘油脂也包含 在本發明的范圍之內。在優選的實施方式中，所述脂質包含通過酯鍵與一個或多個酰基基團共價結合的 一個甘油部分，所述酰基的典型和優選長度如上文的定義和例示。任選地，甘油部分也可與 本文定義和例示的其他基團，例如糖部分結合。在本文中，將此類化合物稱作“單甘油脂”， 或簡稱為“甘油脂”。甘油脂主要由單取代、二取代和三取代的甘油構成，其中最為熟知的是 甘油的脂肪酸酯(三酰甘油)，也被稱作甘油三酯。其他亞類的代表為甘油糖苷(glycosylglycerols)，其特征在于存在通過糖苷鍵 與甘油連接的一個或多個糖殘基。在這方面，所述糖殘基可以是如本文定義和例示的單糖、 二糖、寡糖或多糖。因此，在本發明的范圍內，轉糖苷酶能夠將另外的單糖部分轉移到已經 與單糖結合的甘油脂(即單糖甘油脂)，從而形成與兩個單糖結合的甘油脂(即二糖甘油 脂)。在這方面，兩個單糖可與甘油骨架上兩個單獨的OH基團結合，或相互結合以組成與甘 油部分上的一個OH基團相連的二糖部分。在可選的實施方式中，所述脂質為二甘油脂(diglycerolipid)。在本文中，術語 “二甘油脂”是指具有通過醚鍵彼此共價結合的兩個甘油部分(即雙甘油)，其中至少一個 甘油部分通過酯鍵與一個或多個酰基基團共價結合的脂質，所述酰基的典型和優選長度如 上文的定義和例示。在這方面，所述兩個甘油部分可通過任意可能基團的醚鍵結合雙甘油 單元的實例包括如下所示的α，α ‘-雙甘油、α，β-雙甘油、β，β_雙甘油和環式雙甘 油，其中優選α，α ‘-雙甘油。任選地，所述脂質還可包含可與本文定義和例示的其他基 團，例如糖部分。
權利要求
1.用于使具有游離羥基基團的脂質糖基化的方法，所述方法包括使所述脂質接觸單糖 部分源和轉糖苷酶。
2.如權利要求1所述的方法，還包括從反應混合物分離糖基化的脂質。
3.如權利要求1或權利要求2所述的方法，還包括純化糖基化的脂質。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述轉糖苷酶是轉葡糖苷酶。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述轉糖苷酶歸類為酶分類 (E. C. )3. 2. 1. 20。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述轉糖苷酶歸類為碳水化合物活性酶 數據庫的糖苷水解酶家族31。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述轉糖苷酶來自于真菌，或與來自于 真菌的轉糖苷酶具有至少50 %，優選至少55 %，例如至少60 %，至少65 %，至少70 %，至少 75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少 99%序列同一性。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述轉糖苷酶來自于曲霉菌 (Aspergillus)種，或與來自于曲霉菌種的轉糖苷酶具有至少50%，優選至少55%，例如至 少60 %，至少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少 96%，至少97%，至少98%或至少99%序列同一性。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述曲霉菌種選自黑曲霉(Aspergillusniger)、 泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)禾口棒曲霉 (Aspergillus clavatus)組成的組。
10.如前述任一項權利要求所述的方法，其中所述轉糖苷酶是黑曲霉的轉糖苷酶(SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4)，或與其具有至少50%，優選至少55%，例如至少60%，至少65%， 至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至 少98%或至少99%序列同一性的序列。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述脂質是單甘油脂和多甘油脂。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述脂質是單甘油脂。
13.如權利要求11所述的方法，其中所述脂質是二甘油脂。
14.如權利要求11所述的方法，其中所述脂質是多甘油脂。
15.如權利要求12所述的方法，其中所述脂質選自甘油單酯或甘油二酯。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述甘油單脂具有一個飽和或不飽和的具有4-40 個碳原子的酰基鏈。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述甘油單脂具有一個飽和或不飽和的具有 10-22個碳原子的酰基鏈。
18.如權利要求15所述的方法，其中所述甘油二脂具有兩個飽和或不飽和的具有4-40 個碳原子的酰基鏈。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述甘油二脂具有兩個飽和或不飽和的具有 10-22個碳原子的酰基鏈。
20.如權利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述單糖部分是葡萄糖部分。
21.如權利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述單糖部分源是二糖。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述二糖選自麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖、乳 糖、蔗糖、纖維二糖、黑曲霉糖、曲二糖、海藻糖和蔗糖異構糖。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述二糖是蔗糖。
24.如權利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述單糖部分源是寡糖。
25.如權利要求M所述的方法，其中所述寡糖選自麥芽糊精、麥芽三糖、麥芽四糖、麥 芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、松三糖、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖、纖維六糖和纖維七 糖。
26.如權利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述單糖部分源是多糖。
27.如權利要求沈所述的方法，其中所述多糖選自淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、纖 維素或其衍生物、海藻酸或其鹽或衍生物、聚葡萄糖、葡聚糖、果膠、普魯蘭多糖、角叉菜膠、 刺槐豆膠和瓜耳膠。
28.將單糖部分轉移到權利要求1或11-19中任一項限定的脂質的方法，其通過使所述 脂質接觸權利要求1和21-27中任一項限定的單糖部分源以及權利要求1和4-10中任一 項限定的轉糖苷酶來進行。
29.改進食品的組合物，其包含轉糖苷酶、單糖部分源和脂質。
30.如權利要求四所述的改進食品的組合物，其包含權利要求1和4-10中任一項限定 的轉糖苷酶、權利要求1或20-27中任一項限定的單糖部分源和權利要求1或11-19中任 一項限定的脂質。
31.如權利要求四或30所述的改進食品的組合物，其中所述食品選自生面團和由生面 團制備的烘焙產品。
32.如權利要求四-31中任一項所述的改進食品的組合物，其中所述單糖部分源是蔗糖。
33.改進食品乳化性質的方法，所述方法包括使所述食品或食品中間品接觸單糖部分 源、脂質和轉糖苷酶。
34.如權利要求33所述的改進食品乳化性質的方法，所述方法包括使所述食品或食品 中間品接觸權利要求1或20-27中任一項限定的單糖部分源、權利要求1或11-19中任一 項限定的脂質和權利要求1或4-10中任一項限定的轉糖苷酶。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述食品選自生面團和由生面團制備的烘焙產 品，所述方法還包括必要時使所得生面團在適合的條件下烘焙。
36.用于在食品中原位生產糖基化脂質的方法，所述方法包括使所述食品或食品中間 品接觸單糖部分源、脂質和轉糖苷酶。
37.如權利要求36所述的用于在食品中原位生產糖基化脂質的方法，所述方法包括使 所述食品或食品中間品接觸權利要求1或20-27中任一項限定的單糖部分源、權利要求1 或11-19中任一項限定的脂質和權利要求1或4-10中任一項限定的轉糖苷酶。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述食品是烘焙產品。
39.如權利要求33-38中任一項所述的方法，其中所述食品中間品是生面團。
40.如權利要求33-39中任一項所述的方法，其中所述單糖部分源是蔗糖。
41.如權利要求33-40中任一項所述的方法，其中所述單糖部分源的添加量不高于30重量％。
42.如權利要求41所述的方法，其中所述單糖部分源的添加量為10-20重量％，例如 8-12重量％。
43.如權利要求33-42中任一項所述的方法，其中所述脂質選自甘油單酯或甘油二酯。
44.如權利要求43所述的方法，其中所述脂質的添加量不高于10重量％，例如不高于 3重量％，不高于1.5重量％或不高于1重量％。
45.食品，其是由權利要求四-32中任一項所述的組合物形成的。
46.食品，其是由權利要求33-44中任一項所述的方法生產的。
47.轉糖苷酶的應用，其用于將單糖部分轉移到脂質。
48.如權利要求47所述的轉糖苷酶的應用，所述轉糖苷酶如權利要求1或4-10中任一 項所限定，用于將單糖部分轉移到權利要求1或11-19中任一項限定的脂質。
49.如權利要求47或48所述的應用，其中所述單糖部分向脂質的轉移在食品或食品中 間品中原位發生。
50.如權利要求47或48所述的應用，其中所述單糖部分向脂質的轉移在洗衣組合物中 原位發生。
51.權利要求1或4-10中任一項限定的轉糖苷酶用于改進食品的乳化性質的應用，所 述食品包括權利要求1或11-19中任一項限定的脂質和權利要求1或20-27中任一項限定 的單糖部分源。
全文摘要
本發明公開了用于使具有游離羥基基團的脂質糖基化的方法，所述方法包括使所述脂質接觸單糖部分源和轉糖苷酶。特別地，本發明公開了在食品中原位生產糖基化脂質的方法。
文檔編號A21D10/00GK102105592SQ200980128740
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月16日 優先權日2008年7月24日
發明者R·梅爾達爾, 勒內·米凱爾森, 卡斯滕·M·克拉夫 申請人:丹尼斯科公司