專利名稱：新的水解酶蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及可用于(1S，2S)-1-烷氧基羰基-2-こ烯基環丙烷甲酸的制備的新的水解酶蛋白及其用途。
背景技術：
(1S，2S)-1_烷氧基羰基-2-こ烯基環丙烷甲酸為對正在作為丙型肝炎治療藥開發的各種HCV NS3蛋白酶抑制劑等的制備有用的中間體。在非專利文獻I中記載有將2-こ烯基環丙烷-1，I- ニ甲酸ニ甲酯通過酶水解，制得(1S，2S)-I-甲氧基羰基-2-こ烯基環丙烷甲酸的方法，但酶的光學選擇性不足，制得的(1S，2S)-1-甲氧基羰基-2-こ烯基環丙烷甲酸的光學純度為90% e. e.，不適合作為藥品中間體的エ業制備方法。另外，枯草芽孢桿菌subtilis) ATCC23857的基因組序列眾所周知，源于該枯草芽孢桿菌ATCC23857株的對硝基芐基酯酶(以下有時稱為“PNBE23857”)的氨基酸序列登記于GenBank登錄號ZP_03593235中。先前技術文獻 非專利文獻
非專利文獻 I :c. Fliche 等，Synth. Commun. 24(20), 2873-2876 (1994)。

發明內容
發明所要解決的課題
本發明所要解決的課題在于，提供用于將2-こ烯基環丙烷-1，I-ニ甲酸ニ烷基酯通過酶水解，有效制得可用作丙型肝炎治療藥制備用中間體的(1S，2S)-I-烷氧基羰基-2-こ烯基環丙烷甲酸的新的水解酶蛋白。解決課題的手段
本發明人為解決上述課題而深入研究的結果發現源于枯草芽孢桿菌的對硝基芐基水解酶蛋白可以良好的選擇性水解2-こ烯基環丙烷-1，I-ニ甲酸ニこ酷，有效制得(IS, 2S)-1-こ氧基羰基-2-こ烯基環丙烷甲酸。另外，當根據已知的源于枯草芽孢桿菌的對硝基節基水解酶蛋白的DNA序列/[目息，克隆近未的枯草芽抱桿菌所具有的對硝基節基水解酶基因，確認該基因所編碼的對硝基芐基水解酶蛋白的活性時，成功獲得以高于已知的對硝基芐基水解酶蛋白的選擇性催化上述水解反應的新的同源物。此外，當根據對硝基節基水解酶蛋白的已知的立體結構信息，進行上述新的同源物的同源建模(homologymodeling)，進行相對于底物結合部位附近的氨基酸殘基的誘變試驗時，成功制備以更高的選擇性催化上述水解反應的水解酶蛋白。本發明基于上述見解完成。即，根據本發明，提供以下發明。[I]水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含如序列號2 5的任一項所示氨基酸序列，具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性
權利要求
1.水解酶蛋白，所述蛋白包含如序列號2飛的任一項所示氨基酸序列，具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性
2.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含在如序列號1飛的任一項所示氨基酸序列中氨基酸編號70號、106號、107號、108號、219號、270號、271號、272號、273號、274號、275號、276號和313號氨基酸中I個以上被側鏈體積小于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列，具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性
3.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含在如序列號1飛的任一項所示氨基酸序列中氨基酸編號188號、190號、193號、215號、216號、217號、314號、358號、362號和363號氛基酸中I個以上被側鏈體積大于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列，具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性
4.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含在如序列號1飛的任一項所示氨基酸序列中氨基酸編號70號、106號、107號、108號、219號、270號、271號、272號、273號、274號、275號、276號和313號氨基酸中I個以上被側鏈體積小于野生型氨基酸的氨基酸所取代，且氨基酸編號188號、190號、193號、215號、216號、217號、314號、358號、362號和363號氨基酸中I個以上被側鏈體積大于野生型氨基酸的氨基酸所取代的氨基酸序列，具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性
5.權利要求2或4的水解酶蛋白，其中，在如序列號Γ5的任一項所示氨基酸序列中，至少氨基酸編號70號、270號、273號和313號氨基酸中I個以上氨基酸被取代。
6.權利要求5的水解酶蛋白，其中，在如序列號1飛的任一項所示氨基酸序列中，至少氨基酸編號70號的亮氨酸被天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸或甘氨酸中的任ー氨基酸所取代。
7.權利要求5或6的水解酶蛋白，其中，在如序列號3或4所示氨基酸序列中，氨基酸編號270號的亮氨酸被絲氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
8.權利要求5或6的水解酶蛋白，其中，在如序列號1、2或5的任一項所示氨基酸序列中，氨基酸編號270號的異亮氨酸被絲氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任一氨基酸所取代。
9.權利要求5 8中任ー項的水解酶蛋白，其中，在如序列號f5的任一項所示氨基酸序列中，氨基酸編號273號的亮氨酸被精氨酸或組氨酸中的任一氨基酸所取代。
10.權利要求5、中任ー項的水解酶蛋白，其中,在如序列號I、的任一項所不氨基酸序列中，氨基酸編號313號的亮氨酸被甲硫氨酸、丙氨酸或脯氨酸中的任一氨基酸所取代。
11.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含在如序列號4所示氨基酸序列中氨基酸編號70號的亮氨酸被天冬氨酸所取代，270號的亮氨酸被谷氨酰胺、谷氨酸或丙氨酸中的任ー氨基酸所取代，第273號的亮氨酸被精氨酸所取代，且第313號的亮氨酸被甲硫氨酸所取代的氨基酸序列，具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性
12.水解酶蛋白，所述水解酶蛋白包含與權利要求f11的水解酶蛋白的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列，或相對于權利要求f 11的水解酶蛋白的氨基酸序列具有廣數個氨基酸的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性
13.DNA，所述DNA編碼權利要求1 12中任ー項的水解酶蛋白。
14.權利要求13的DNA，所述DNA包含以下堿基序列(a)序列號7 10中記載的堿基序列；(b)堿基序列，其為可與包含序列號7 10中記載的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的DNA，編碼以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性；或(c)堿基序列，其為在序列號7 10中記載的堿基序列中具有f數個堿基的取代、缺失和/或添加的堿基序列，編碼以下水解酶蛋白，所述水解酶蛋白具有以高于包含如序列號I所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性催化如式(I)所示反應的活性；
15.(IS, 2S)-I-烷氧基羰基-2-こ烯基環丙烷甲酸的制備方法，所述制備方法包括使權利要求廣12中任ー項的水解酶蛋白作用于2-こ烯基環丙烷-1，I-ニ甲酸ニ烷基酯制備(IS, 2S) -I-燒氧基擬基-2-こ烯基環丙燒甲酸。
全文摘要
本發明的課題在于提供用于將2-乙烯基環丙烷-1,1-二甲酸二烷基酯通過酶水解，有效制得可用作丙型肝炎治療藥合成中間體的(1S,2S)-1-烷氧基羰基-2-乙烯基環丙烷甲酸的新的水解酶。根據本發明，可提供包含如序列號2~5的任一項所示氨基酸序列，具有以高于包含如序列號1所示氨基酸序列的蛋白質的選擇性，催化由2-乙烯基環丙烷-1,1-二甲酸二乙酯向(1S,2S)-1-乙氧基羰基-2-乙烯基環丙烷甲酸的反應的活性的水解酶蛋白。
文檔編號C12P41/00GK102834515SQ201180009868
公開日2012年12月19日 申請日期2011年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者川端潤, 三宅良磨, 朝田久仁子, 加藤良平 申請人:株式會社Api