專利名稱：一種利用凝膠分子篩去除豬凝血酶中內毒素的方法
技術領域：
本發明屬農副產品深加工領域，是生物技術在農副產品深加工方面的探索性應用研究。
背景技術：
凝血酶(thrombin)是機體凝血系統中的天然成份，來源于動物血漿，凝血酶在臨床上應用廣泛，常以干粉或溶液局部涂于傷口及手術處，控制毛細管血液滲出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙出血等，有時也可以口服，用于胃和十二指腸出血。凝血酶局部止血效果好，且無副作用。2008年世界血友病聯盟的全球性調查顯示，按照人均最低收入國家人均凝血因子的消費量為0. 08單位計算，我國每年至少需要1億單位的凝血因子才能滿足最低需求。而市場調查顯示，我國在2006年、2007年的年凝血因子產量僅為4000萬單位左右。因此，血液制品短缺，特別是凝血因子類制品。中東兩伊及阿富汗戰爭期間，曾大量從我國進口凝血酶。目前隨著凝血酶應用的不斷推廣，用量迅速擴大，加之世界一些地區戰亂，傷病人員增加，對高效局部止血藥的需求量更難以估計，有些國家甚至作為戰略儲備物資進行購買，使凝血酶在國際市場前景十分廣闊。目前臨床上使用的凝血酶多因純度低、含熱原、凝血酶的穩定性差等問題限制了其正常使用，而上述問題也是迫切需要解決的科學問題，另外研究和完善豬血提取高活性高穩定性高純度的凝血酶技術不但可以保護環境、變廢為寶創造效益，還可以提高豬血附加值、促進就業，拉動地方經濟的發展。

發明內容
本發明目的是提供利用凝膠分子篩去除豬凝血酶中內毒素的方法。該方法簡單， 制備的凝血酶純度和活性高。所述方法包括柱層析和分子篩分離。(1)豬血液的收集、血漿的分離及纖維蛋白原的去除以新鮮豬血液為原料，加入檸檬酸鈉抗凝，攪拌均勻，然后離心分離獲得血漿，血漿冷凍后再解凍，除去纖維蛋白原。(2)凝血酶原的制備及凝血酶的激活采用檸檬酸鋇吸附血漿中的凝血酶原，然后用CaCl2和MgCl2復合體系溶液中Ca2+ 和Mg2+激活凝血酶原，得到的粗凝血酶。(3)凝血酶的純化及其內毒素的去除 先用柱層析對凝血酶粗品進行初步純化，除去大部分雜蛋白，收集凝血酶，然后采用凝膠分子篩法，先用kphadex G-25過濾再用kpharose過濾去除凝血酶中殘存的血漿蛋白和雜蛋白，得到電泳高純高活性的凝血酶。
具體實施方式
實施例1血漿的分離檢疫合格的新鮮的豬血加入3. 0%的檸檬酸三鈉抗凝，緩慢攪拌減少血細胞的破碎。使用高速冷凍離心機分離血液，在4°C條件下4500r/min離心lOmin，收集血漿，儲存在 4°C條件下備用。2纖維蛋白原的去除將收集到的血漿置于-20°C冷凍Mh，取出在4°C環境中解凍，此時纖維蛋白原析出為絮狀沉淀，除去沉淀，收集液體。所得到的凝血酶的總活性比未冷凍的提高了 3.7%。3凝血酶的制備和激活在第二步中收集的液體中加入lmol/L的氯化鋇溶液，添加量為8 %，均攪拌 20min，抽濾收集檸檬酸鋇沉淀，將沉淀溶于pH8. 00. 2mol/L EDTA溶液中，攪拌60min，再用 0. 05mol/LpH7. 2的Tris-HCl緩沖液透析，不斷更換透析液，至體系中無Ba2+為止。然后加 Λ CaCl2和MgCl2復合溶液，使Ca2+終濃度為0. lmol/L, Mg2+終濃度為0. 05mol/L,在20°C 條件下激活池。4凝血酶的純化加入50g DEAE-纖維素(DE52)于IOOOml燒杯中，先以蒸餾水漂浮除去細顆粒，再經酸化處理，用0. 02mol/L, pH8. 0的磷酸緩沖液平衡，抽干水分，收集濕DE52纖維素。按照 5g/ml的量加入到上述溶液中，置于4°C吸附70min，收集上清液再如上處理一次，即可獲得較純的凝血酶，凝血酶比活為778U/mg。5去除凝血酶中的內毒素取IOg Sephadex G-25，用去離子水溶脹池后，煮沸lh，冷卻后裝柱，300床體積毫升/g干分子篩。再用直徑在45-165um的kpharose凝膠過濾，最大線性流速150cm/h ； 250C，HR16/10柱，5cm床高度)，過濾去除凝血酶中殘存的血漿蛋白和雜蛋白，收集濾液，即為得到電泳高純高活性的凝血酶。
權利要求
1.本發明涉及一種利用凝膠分子篩去除豬凝血酶中內毒素的方法，其特征在于所述方法包括下述步驟a以豬血為原料，先加入抗凝劑，然后離心分離出血漿，血漿中應無殘留血細胞；b血漿低溫冷凍，析出去除纖維蛋白原；c添加1 2mol/L檸檬酸鋇溶液吸附分離凝血酶原；d使用CaCl2和MgCl2復合體系激活凝血酶原；e使用DEAE-纖維素DE-52對凝血酶粗品進行初步純化，除去大部分雜蛋白，收集具有凝血酶活性的峰；f采用凝膠分子篩法過濾去除凝血酶中殘存的血漿蛋白和雜蛋白，純化凝血酶。
2.根據權利要求Ia所述的豬血液的分離，其特征在于在豬血中加入2.0% 3. 0%的檸檬酸鈉(W/V)作為抗凝劑，緩慢攪拌均勻，4000 5000r/min離心7 10分鐘，獲得血漿。
3.根據權利要求Ib所述的纖維蛋白原的去除，其特征在先低溫冷凍M 48h，然后在 4 10°C解凍，利用纖維蛋白原低溫凝結析出的原理去除纖維蛋白原。
4.根據權利要求Ic所述的凝血酶原的吸附，其特征在于利用1 2mol/L檸檬酸鋇吸附分離凝血酶原，4°C攪拌30 50min，靜置20分鐘。
5.根據權利要求Id所述的凝血酶原的激活，其特征在于使用CaCl2和MgCl2復合體系激活，激活的條件為，加入CaCl2和MgCl2溶液，使Ca2+終濃度為0. 1 0. 15mol/L, Mg2+終濃度為0. 05 0. 08mol/L，在20 25°C下激活2h。
6.根據權利要求Ie所述的凝血酶的純化其特征在于使用稱取DEAE-纖維素 (DE52)50g，置于IOOOml燒杯中，先以蒸餾水漂浮除去細顆粒，再經酸堿處理后，用0. 01 0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸鹽緩沖液(PB)平衡。將水分抽干，或用布氏濾斗(內放兩層濾紙)過濾，收集濕纖維素，以降低其離子強度。按Iml血清加濕重5g DE52，經過充分攪拌，置4°C吸附lh。上清液可再如此處理一次，即獲得較純的凝血酶。
7.根據權利要求If所述的凝血酶內毒素的去除，其特征在于所運用kphadex G-25(溶脹3小時后，還要煮沸1小時，冷卻后裝柱，100 5000床體積毫升/g干分子篩) 和kpharose (顆粒尺寸范圍45_165um ；最大線性流速150cm/h ；25°C，HR16/10柱，5cm床高度)。
全文摘要
本發明公開了一種利用凝膠分子篩去除豬凝血酶中內毒素的方法方法，屬于農副產品深加工領域。方法包括離心分離、柱層析、酶的激活和分子篩分離去除內毒素。優點是分離效果好，凝血酶的活性高，凝血酶中熱源物質和內毒素少，臨床使用安全性高。
文檔編號C12N9/74GK102492681SQ201110372328
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月22日 優先權日2011年11月22日
發明者于挺敏, 吳涵, 姚剛, 方珍, 潘風光, 王楠 申請人:吉林大學