專利名稱：一種用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于工業微生物技術領域，具體涉及一種用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑及其應用。
背景技術：
丙烯酰胺是一種用途廣泛的有機化工原料，以它為單體合成的產品不下百種，其中以聚丙烯酰胺用途最廣。聚丙烯酰胺的主要用途是用于油田調整吸水剖面和“三次采油” 中，近年來，為適應我國原油“三次采油”對超高分子量聚丙烯酰胺(相對分子質量> 2000 萬)的需求，丙烯酰胺的生產將有較大的發展。丙烯酰胺是以丙烯腈為原料水合而成，從20世紀50年代至今，生產工藝先后經歷了硫酸水合、銅系催化的化學水合及微生物腈水合酶生物轉化3個發展階段。1973年， 法國研究者felzy及其研究組發現了一種能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物 BrevkiCteriumR312，從而開始了用微生物成產丙烯酰胺的研究。1985年，日本日東公司建成了世界上第一個微生物法生產丙烯酰胺的工業性裝置。上海農藥所也在1986年從泰山的土壤中找到了一株產腈水合酶的菌株，并開始了微生物法生產丙烯酰胺的研究。與銅系催化法相比，微生物法有許多優點酶催化反應在常溫、常壓下進行，提高了生產安全性； 丙烯腈的轉化率接近100%，不需回收未反應原料；由于省去了銅分離工段，產品中不含銅離子，產品純度高，特別適合生產超高分子量的聚丙烯酰胺；工藝過程簡單，設備投資少，生產經濟效益高。微生物法催化生產丙烯酰胺是石油化工骨干產品利用酶催化技術成功的第一范例，具有劃時代的意義。腈水合酶是一種可以把腈化合物的腈基進行水合后轉變為酰胺基，制造對應的酰胺化合物的微生物的酶，腈水合酶作為催化劑催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的方法正成為主流。

發明內容
本發明的目的在于提供一種用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑及其應用，本發明的光敏性腈水合酶惡臭假單胞菌菌種，經傳統發酵、水合催化合成丙烯酰胺，利用本發明菌株合成的丙烯酰胺水合產物濃度高，減少了濃縮的負擔，且副產物少， 產品純度高，適合工業化生產丙烯酰胺。本發明所采用的技術方案是該用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑菌體發酵培養將惡臭假單胞菌(I^eudomonas putida)菌體接種于固體培養基， 活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，搖床轉速100 200r · mirf1，溫度為25 40°C，每6小時用^iol -L"1的NaOH溶液調節pH值，使之維持在6. 5 7. 5之間，培養50 IOOh后得到具有腈水合酶活力的發酵液，且發酵液的總酶活達800 1200萬單位/毫升發酵液；
催化劑懸浮液將發酵液在分離因素> 4000離心分離，去上清液，將細胞懸浮于去離子水或20mM、pH為7. 0 8. 0的磷酸鉀緩沖溶液中，配成細胞濃度為5% (wt)的催化劑懸浮液。上述方案中所用的固體培養基配方為甘油0. 2 2%、酵母浸膏0. 5 1. 5%、瓊脂 0. 2 2%、尿素 0. 1 1%、K2HPO4 0. 1 0. 5%, KH2PO4O. 1 0. 5%, NaCl 0. 1
及MgSO4 0. 005 0. 02%，脫鹽水10 15%，余量為淀粉；發酵培養基配方為甘油0. 2 2%，酵母浸膏 0. 5 1. 5%，谷氨酸 0. 2 2%，尿素 0. 2 2%，K2HP04 0. 1 0. 5%,KH2PO4 0. 1 0. 5%, MgSO4 0. 005 0. 02%, Fe3+ 0. 001 0. 01 %，pH 值 6. 5 7. 5，余量為脫鹽水；上述百分比為質量百分比。含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑的應用包括如下步驟向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，在光照、常壓，溫度為25°C，200r ^irT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應， 丙烯腈的添加量占反應體系的20% (wt)，經過IOh的反應，獲得丙烯酰胺溶液；催化劑懸浮液與丙烯腈反應液質量比為1 100 1 200之間。上述發酵過程中添加的!^3+為i^eCl3、Fe2 (SO4) 3、Fe (NO)3中的任意一種；丙烯腈反應液丙烯腈和水。上述所述光照條件為日光燈照射發酵罐。本發明所具有的有益效果是是通過在傳統發酵過程中培養基中加入狗3+生產含有腈水合酶的惡臭假單胞菌菌株或其誘變菌株細胞，并將該細胞從培養液中分離制成催化劑懸浮液，催化丙烯腈水合成丙烯酰胺水溶液，在傳統工藝條件下采用光照發酵罐，丙烯腈的轉化率可達99. 99%，所獲得的丙烯酰胺水溶液經過納濾、離子交換等工序，即可獲得高純度的丙烯酰胺水溶液。本發明通過在發酵過程中加入狗3+，顯著提高了腈水合酶的酶活性，將酶活性提高50%以上的同時使發酵的培養周期大大縮短了 ；此外，本發明還在丙烯腈水合階段增加了光照條件，從而使丙烯腈水合酶的酶活性大大提高了，并且將腈水合酶半衰期延長了 1.5倍。利用本發明菌株合成的丙烯酰胺水合產物濃度高，減少了濃縮的負擔，且副產物少，產品純度高，適合工業化生產丙烯酰胺。本發明中菌株、！^3+、光照條件互相協調作用才能高效催化丙烯腈水合成丙烯酰胺。本發明使用的惡臭假單胞菌菌株及其誘變菌株產生的腈水合酶可將丙烯腈高效轉化成丙烯酰胺，其操作過程簡單、反應條件溫和、對環境污染小、分離提純簡單、丙烯腈轉化率高、產品純度高。本發明與現有技術相比具有以下特點現有技術用于催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的菌株主要有紅球菌屬、棒桿菌的細菌及其經誘變的菌種。本發明的菌種屬于假單胞菌屬。該菌株在發酵過程中加入狗3+，水合階段有光照的條件時，該菌種產酶能力大幅度提高，最高達50毫克/毫升發酵液，而且其單位體積發酵液的總酶活達1200萬單位/毫升發酵液。
具體實施例方式實施例1 (1)、催化劑懸浮液的制取菌體發酵培養將惡臭假單胞菌菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，搖床轉速IOOr .mirT1,溫度為30°C，每6小時用4mol -L"1的NaOH溶液調節PH值，使之維持在7. 5，培養7 后得到具有腈水合酶活力的發酵液。通過稱量法測定菌株產酶能力。取IOmL發酵液，在分離因素為5000，離心分離，去上清液，用蒸餾水洗滌三次后，將獲得的細胞置于紅外干燥箱內，85°C干燥至恒重，約4h，取出放入干燥器內，冷卻后稱量。由上述方法測得的產酶能力為40. 3毫克/毫升發酵液。將上述發酵液在分離因素為5000，離心分離，去上清液，將細胞懸浮于20mM、pH為 7. 5的磷酸鉀緩沖溶液中，配成細胞濃度為5% (wt)的催化劑懸浮液。O)、利用催化劑懸浮液合成丙烯酰胺向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，在日光照射發酵液、常壓，溫度為25°C，200r · mirT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應，丙烯腈的添加量占反應體系的20% (wt)，經過IOh的反應，獲得濃度為26. 74%的丙烯酰胺溶液， 丙烯腈轉化率99. 81%，溶液中丙烯酸、丙烯醛濃度0. 00005%。發酵液與丙烯腈反應液的質量比為1 120。采用高壓液相色譜法(HPLC)分析丙烯腈及轉化產物丙烯酰胺，配制兩者的混合溶液做標準曲線，通過外標法定量，測定反應液中腈水合酶活力.由上述方法測得的腈水合酶活力為800u/mL。固體培養基甘油0.5%，酵母浸膏1%，瓊脂1%，尿素0.3%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3 %, NaClO. 5%, MgSO4O. 01 %，脫鹽水10 15%，余量為淀粉；發酵培養基甘油 1. 5%，酵母浸膏 1%，谷氨酸 1%，尿素 1. 2%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%, MgSO4O. 01%, Fe3+O. 003 %，pH值7，余量為脫鹽水。實施例2 (1)、催化劑懸浮液的制取菌體發酵培養將惡臭假單胞菌菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，搖床轉速IOOr · mirT1，溫度為30°C，每6小時用4mol · L—1的NaOH 溶液調節PH值，使之維持在7. 5，培養7 后得到具有腈水合酶活力的發酵液。由上述方法測得的產酶能力為45. 6毫克/毫升發酵液。將上述發酵液在分離因素為5000，離心分離，去上清液，將細胞懸浮于20mM、pH為 7. 5的磷酸鉀緩沖溶液中，配成細胞濃度為5% (wt)的催化劑懸浮液。O)、利用催化劑懸浮液合成丙烯酰胺向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，在日光照射發酵液、常壓，溫度為25°C下，200r · mirT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應，丙烯腈的添加量占反應體系的20% (wt)，經過15h的反應，獲得濃度為29. 45%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉化率99. 93 %，溶液中丙烯酸、丙烯醛濃度0. 00002 %。發酵液與丙烯腈反應液的質量比為1 100。由上述方法測得的腈水合酶活力為llOOu/mL。固體培養基甘油0.5%，酵母浸膏1%，瓊脂1%，尿素0.3%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%, NaClO. 5%, MgSO4O. 01%，脫鹽水 10 15%，余量為淀粉；發酵培養基甘油^^，酵母浸膏！^，谷氨酸！^，尿素1.2%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 01%, Fe3+O. 005%，pH 值 7，余量為脫鹽水。實施例3 (1)、催化劑懸浮液的制取菌體發酵培養將惡臭假單胞菌菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，搖床轉速IOOr .mirT1,溫度為35°C，每6小時用4mol -L"1的NaOH溶液調節PH值，使之維持在7. 5，培養60h后得到具有腈水合酶活力的發酵液。由上述方法測得的產酶能力為48. 1毫克/毫升發酵液。將上述發酵液在分離因素為5000，離心分離，去上清液，將細胞懸浮于20mM、pH為 7. 5的磷酸鉀緩沖溶液中，配成細胞濃度為5% (wt)的催化劑懸浮液。O)、利用催化劑懸浮液合成丙烯酰胺向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，在日光照射發酵液、常壓，溫度為25°C下，200r ^irT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應丙烯腈的添加量占反應體系的20% (wt)，經過IOh的反應，獲得濃度為26. 72%的丙烯酰胺溶液， 丙烯腈轉化率99. 75%，溶液中丙烯酸、丙烯醛濃度0. 00006%。發酵液與丙烯腈反應液的質量比為1 150。由上述方法測得的腈水合酶活力為lOOOu/mL。固體培養基甘油0.5%，酵母浸膏1%，瓊脂1%，尿素0.3%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%, NaCl 0. 5%, MgSO4O. 01%，脫鹽水 10 15%，余量為淀粉；發酵培養基甘油^^，酵母浸膏！^，谷氨酸！^，尿素1.2%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%, MgSO4O. 01%, Fe3+O. 008%，pH 值 7. 5，余量為脫鹽水。實施例4 (1)、菌體發酵培養將惡臭假單胞菌菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，搖床轉速IOOr .miiT1,溫度為35°C，每6小時用4mol化―1的NaOH 溶液調節PH值，使之維持在7. 5，培養50h后得到具有腈水合酶活力的發酵液。由上述方法測得的產酶能力為49. 8毫克/毫升發酵液。將上述發酵液在分離因素為5000，離心分離，去上清液，將細胞懸浮于20mM、pH為 7. 5的磷酸鉀緩沖溶液中，配成細胞濃度為5% (wt)的催化劑懸浮液。O)、利用催化劑懸浮液合成丙烯酰胺向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，在日光照射發酵液、常壓，溫度為25°C下，200r · mirT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應，丙烯腈的添加量占反應體系的20% (wt)，經過20h的反應，獲得濃度為29. 47%的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉化率99. 99%,溶液中丙烯酸、丙烯醛濃度0. 00003%。發酵液與丙烯腈反應液的質量比為1 100。由上述方法測得的腈水合酶活力為lOOOu/mL。固體培養基甘油0.5%，酵母浸膏1%，瓊脂1%，尿素0.3%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%, NaCl 0. 5%, MgSO4O. 01 %，脫鹽水10 15%，余量為淀粉；發酵培養基甘油 1. 5%，酵母浸膏 1%，谷氨酸 1%，尿素 1. 2%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%, MgSO4O. 01%, Fe3+O. 01 %，pH值7. 5，余量為脫鹽水。實施例5 本實施例在發酵過程中未加入狗3+，且在水合階段沒用光照條件，以和上述實施例 4進行對比。(1)、催化劑懸浮液的制取菌體發酵培養將惡臭假單胞菌菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，搖床轉速100r .mirT1,溫度為35°C，每6小時用4mol -L"1的NaOH溶液調節PH值，使之維持在7，培養90h后得到具有腈水合酶活力的發酵液。由上述方法測得的產酶能力為15. 7毫克/毫升發酵液.將上述發酵液在分離因素為5000，離心分離，去上清液，將細胞懸浮于20mM、pH為 7. 5的磷酸鉀緩沖溶液中，配成濃度為5% (wt)的催化劑懸浮液。發酵液與丙烯腈反應液的質量比為1 100。(1)、利用催化劑懸浮液合成丙烯酰胺向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，在常壓，溫度為25°C，200r · mirT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應，丙烯腈的添加量占反應體系的22 % (wt)，經過IOh的反應，獲得濃度為8. 9 %的丙烯酰胺溶液，丙烯腈轉化率 30. 4%。由上述方法測得的腈水合酶活力為106u/mL.固體培養基甘油0.8%，酵母浸膏1%，瓊脂1%，尿素0.3%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%, NaClO. 5%, MgSO4O. 01%，脫鹽水 10%，余量為淀粉；發酵培養基甘油^^，酵母浸膏！^，谷氨酸！^，尿素1.2%，K2HPO4O. 3%, KH2PO4O. 3%, MgSO4O. 01 %，pH 值 7，余量為脫鹽水。上述實施例中所用的百分比為質量百分比。
權利要求
1.一種用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑，菌體發酵培養將惡臭假單胞菌O^eudomonas putida)菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，搖床轉速100 200r ^irT1,溫度為25 40°C，每 6小時用4mol化―1的NaOH溶液調節pH值，使之維持在6. 5 7. 5之間，培養50 IOOh后得到具有腈水合酶活力的發酵液，且發酵液的總酶活達800 1200萬單位/毫升發酵液；催化劑懸浮液將發酵液在分離因素> 4000離心分離，去上清液，將細胞懸浮于去離子水或20mM、pH為7. 0 8. 0的磷酸鉀緩沖溶液中，配成細胞濃度為5% (wt)的催化劑懸浮液；上述方案中所用的固體培養基配方為甘油0. 2 2%、酵母浸膏0. 5 1. 5%、瓊脂 0.2 2%、尿素0.1 1%、K2HPO4O. 1 0. 5 %、KH2PO4O. 1 0. 5 %、NaClO. 1 1 % 及 MgSO4O. 005 0. 02 %，脫鹽水10 15 %，余量為淀粉；發酵培養基配方為甘油0. 2 2 %， 酵母浸膏 0. 5 1. 5%，谷氨酸0. 2 2%，尿素 0. 2 2%,K2HPO4O. 1 0. 5%,KH2PO4O. 1 0. 5%, MgSO4O. 005 ~ 0. 02%, Fe3+O. 001 0. 01 %，pH 值 6. 5 7. 5，余量為脫鹽水；上述百分比為質量百分比。
2.權利要求1所述的用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑，其特征在于菌體發酵培養將菌體接種于固體培養基，活化后挑取菌苔在搖床中發酵制備腈水合酶，搖床轉速IOOr .miiT1,溫度為35°C，每6小時用4mol · L—1的NaOH溶液調節pH值，使之維持在7. 5，培養7 后得到具有腈水合酶活力的發酵液；且發酵液的總酶活達800 1200 萬單位/毫升發酵液；將上述發酵液在分離因素為5000，離心分離，去上清液，將細胞懸浮于20mM、pH為7. 5 的磷酸鉀緩沖溶液中，配成細胞濃度為5% (wt)的催化劑懸浮液；固體培養基甘油0.5 %，酵母浸膏1 %，瓊脂1 %、尿素0.3 %、K2HPO4O. 3 KH2PO4O. 3%, NaCl 0. 5%, MgSO4O. 01%、脫鹽水 10 15%，余量為淀粉；發酵培養基甘油1.5%、酵母浸膏1 %、谷氨酸1 %、尿素1.2^^1^^(^0.3 ^ KH2PO4O. 3%,MgSO4O. 01%, Fe3+O. 003%，pH 值 7，余量為脫鹽水。
3.權利要求3所述的用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑的應用，包括如下步驟向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，在光照、常壓，溫度為25°C，200r ^irT1的攪拌速度下進行酶催化水合反應，丙烯腈的添加量占反應體系的20% (wt)，經過IOh的反應，獲得丙烯酰胺溶液；催化劑懸浮液與丙烯腈反應液質量比為1 100 1 200之間。
全文摘要
本發明涉及一種用于合成丙烯酰胺含有光敏性腈水合酶菌株的催化劑及其應用。該催化劑菌體發酵培養；催化劑懸浮液制取；催化劑的應用，包括如下步驟向催化劑懸浮液中緩慢加入丙烯腈，在光照、常壓，溫度為25℃，200r·min-1的攪拌速度下進行酶催化水合反應，丙烯腈的添加量占反應體系的20％(wt)，經過10h的反應，獲得丙烯酰胺溶液；催化劑懸浮液與丙烯腈反應液質量比為1∶100～1∶200之間。本發明的光敏性腈水合酶惡臭假單胞菌菌種，經傳統發酵、水合催化合成丙烯酰胺，利用本發明菌株合成的丙烯酰胺水合產物濃度高，減少了濃縮的負擔，且副產物少，產品純度高，適合工業化生產丙烯酰胺。
文檔編號C12P13/02GK102329757SQ20111030407
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月10日 優先權日2011年10月10日
發明者孫安順 申請人:孫安順