專利名稱：一種用于釀造葡萄醋的酵母菌及其制備方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體地說是一種用于釀造葡萄醋的酵母菌及其制備方法。
背景技術：
葡萄是葡萄科植物的果實，為落葉藤本植物，是世界最古老的種植植物之一。葡萄原產于歐洲、西亞和北非一帶，現我國南北各地均有生產，主要產于新疆、甘肅、山西、河北、 山東、江浙和云南等地。葡萄中的多量果酸有助于消化，能健脾和胃，把葡萄釀制成葡萄醋能夠減少腸道內不良細菌的數量、幫助有益菌繁殖，消除皮膚色斑。此外，葡萄醋是生理堿性食品，葡萄醋內的多糖、鉀離子能降低體內的酸性，從而緩解疲勞，增強體力。目前國內外報道了不少制造葡萄醋的方法，國內已經有不少關于葡萄醋制備的報道
如申請號200610048850. 4《葡萄醋的制備方法》其方法系自然發酵，產品一致性難以保證，醋酸含量低，只能季節性生產等。如申請號20071005808. 5《葡萄醋的制備方法》其方法是用葡萄汁加蜂蜜、白砂糖、 山梨酸等調制，不是釀造。如申請號97104377. 9《一種葡萄醋的制備方法》其方法是鮮葡萄汁、醋精，白糖等攪拌混合制，并非發酵和釀造。如申請號9912^34. 8《一種山葡萄醋汁及其制造方法》，該醋是純糧釀造出來的醋和山葡萄為原料制造葡萄醋。如申請號200910073703. 6《葡萄與糧食混合發酵生產葡萄醋方法》，其方法生產的不是純的葡萄醋。這些專利文獻公開的方法都具有一個共同點，就是其原料都以葡萄果實或葡萄汁為原料，混合食醋、山梨酸，或者糧食發酵后形成的制造葡萄醋。目前還未見報道直接用葡萄酒為原料，加以畢赤酵母醋酸菌發酵，來生產優質葡萄醋。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于釀造葡萄醋的酵母菌及其制備方法。本發明的酵母菌是畢赤酵母菌，其保藏登記號為CGMCC No. 3076，分類命名為 巴氏畢赤酵母G0ZcAia pastor S^,該菌株于2009年5月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
本發明的酵母菌的制備方法如下 1)菌種的獲得
葡萄酒暴露在空氣中時間一長就會變酸，這就是葡萄酒和自然界中的醋酸菌發生反應，或者在葡萄酒釀造過程中，當葡萄鮮果中糖份全部發酵成酒精后，沒有及時終止發酵， 慢慢葡萄酒也就發酸變成是醋非醋的酸酒，這也是空氣中的醋酸菌和葡萄酒發生的醋酸反
3應，利用這一現象獲取的畢赤酵母醋酸菌，獲取和分離培養程序如下
將鮮果發酵得到的新鮮葡萄酒(不終止發酵即不加二氧化硫)，放入大廣口有色玻璃繞環內，深度是廣口的1/5，上面用紗布蓋好，放在通風避光處，待酒向上集結出一層白色薄膜，這個薄膜就是通常叫醋膜，從其中優選出純度高、產酸多的醋酸菌菌種；
2)將上述菌種移到無菌水中稀釋至10_ 4 10 _ 5倍，制備平板分離培養基葡萄糖 10%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂1. 5%加入要釀造的葡萄酒至100% ；培養基在無菌條件下先加入4%酒精，將稀釋至10 _ 4 10 _ 5倍濃度的醋酸菌ImL分成0. ImL個點滴在培養基上， 送至30°C恒溫箱培養，培養5天后出現醋酸菌菌落，選取單菌落直徑最大的，取出再稀釋至 10 — 4 10 — 5倍，再重復培養三次；
3)將上述2)步驟生長較快的菌種取出用無菌水稀釋至10_ 4 10 _ 5倍，進行印跡法培養，印跡法培養基組成葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%，Caco3 2%，瓊脂1. 5%，加入要釀造的葡萄酒至100% ；將稀釋至10 _ 4 10 _ 5倍濃度的菌種按每滴0. ImL點滴在備制好的印跡法培養基上(每個培養基上最多能滴5個點，每點間留有足夠的距離)，將培養基放入30°C恒溫箱培養3 5天后，將產酸能力強，并生長健壯的醋酸菌種選出進行第二次的印跡法培養，至3 4次的印跡法培養后，產出穩定的醋酸菌種，即巴氏畢赤酵母O0Zdia pastoris)ο將這個菌種繁殖保存或經I級II級菌種培養擴繁后用于生產。種菌的形態特征用普通光學顯微鏡觀察菌種，細胞形態為卵形，該菌無性繁殖方式是細胞芽殖、有假菌絲，有性繁殖方式是產生子囊，子囊呈半園形，表面光滑。菌落為乳白色，圓形，干燥無光澤，在培養基上容易被挑起。分子鑒定提取酵母菌核DNA，用酵母菌通用引物進行ISSrDNA的PCR擴增，PCR 產物連接到PMD18-T載體后進行測序，將測序結果在NCBl上進行BLAST分析，結果表明與 pichia sp. NRRL Y-27259 菌具有 99% 有同源性。特性
最適生酸溫度^°C 33°C; 酒精平均轉化率 93% 95% ； 最高耐酸量9 11(以醋酸計)。利用本發明的畢赤酵母醋酸菌可將葡萄酒發酵成葡萄醋來生產一種葡萄醋，能克服現有葡萄醋生產過程中原料受季節影響限制的缺點，并可以縮短發酵周期，減少生產成本，得到高醋酸度，低酒精含量的優質葡萄醋。即保持了葡萄具有的營養成份，又具有醋的功效，整個釀造過程無需添加其它添加劑。本發明的畢赤酵母菌于2009年5月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區大屯路中國微生物研究所。
具體實施例方式本發明的酵母菌的制備方法如下 1)菌種的獲得
將鮮果發酵得到的新鮮葡萄酒(不終止發酵即不加二氧化硫)，放入大廣口有色玻璃繞環內，深度是廣口的1/5，上面用紗布蓋好，放在通風避光處，待酒向上集結出一層白色薄膜，這個薄膜就是通常叫醋膜，從其中優選出純度高、產酸多的醋酸菌菌種；
2)將上述菌種移到無菌水中稀釋至10_ 4 10 _ 5，制備平板分離培養基組成葡萄糖 10%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂1. 5%加入要釀造的葡萄酒至100% ；培養基在無菌條件下先加入4%酒精，將稀釋至10 - 4的濃度醋酸菌ImL分成0. ImL個點滴在培養基上，送至30°C 恒溫箱培養，培養5天后出現醋酸菌菌落，選取單菌落直徑最大的，取出稀釋至10 _ 4，再重復培養三次；
3)將上述2)生長較快的菌種取出用無菌水稀釋至10- 4，進行印跡法培養，印跡法培養基組成葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%，Caco3 2%，瓊脂1. 5%，加入要釀造的葡萄酒至 100% ；將稀釋至10 - 4濃度的菌種按每滴0. ImL點滴在備制好的印跡法培養基上(每個培養基上最多能滴5個點，每點間留有足夠的距離)，將培養基放入30°C恒溫箱培養3 5天后， 產酸能力強，并生長健壯的醋酸菌，將這個菌種選出進行第二個周期的印跡法培養，至3 4個周期后，產出穩定的醋酸菌種，其保藏登記號為CGMCC No. 3076,分類命名為巴氏畢赤酵母{Pichia pas tor is )。 將這個菌種繁殖保存或經I級II級菌種培養擴繁后用于生產。
權利要求
1.一種用于釀造葡萄醋的酵母菌，其特征在于所述的酵母菌是畢赤酵母菌，其保藏登記號為CGMCC No. 3076,分類命名為巴氏畢赤酵母PicAia pastor is,該菌株于2009年 5月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.權利要求1所述的用于釀造葡萄醋的酵母菌的制備方法，其特征在于按以下步驟進行1)菌種的獲得將鮮果發酵得到的新鮮葡萄酒，放入大廣口有色玻璃繞環內，上面用紗布蓋好，放在通風避光處，待酒面上集結出一層白色薄膜醋膜，從其中優選出純度高、產酸多的醋酸菌菌種；2)將上述菌種移到無菌水中稀釋至10_ 4 10 _ 5倍，制備平板分離培養基葡萄糖 10%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂1. 5%加入要釀造的葡萄酒至100% ；培養基在無菌條件下先加入質量濃度4%酒精，將稀釋至10 _ 4 10 _ 5倍濃度的醋酸菌點滴在培養基上，30°C恒溫箱培養，培養后出現醋酸菌菌落，選取單菌落直徑最大的，取出再稀釋至10 _ 4 10 _ 5倍，再重復培養三次；3)將上述2)步驟生長較快的菌種取出用無菌水稀釋至10_ 4 10 _ 5倍，進行印跡法培養，印跡法培養基組成葡萄糖10%，蛋白胨2%，酵母膏1%，Caco3 2%，瓊脂1. 5%，加入要釀造的葡萄酒至100% ；將稀釋至10 _ 4 10 _ 5倍濃度的菌種點滴在備制好的印跡法培養基上，將培養基放入30°C恒溫箱培養3 5天后，將產酸能力強，并且生長健壯的醋酸菌選出進行第二次的印跡法培養，至3 4次的印跡法培養后，產出穩定的醋酸菌種，即巴氏畢赤酵母{Pichia pas tor is )。
全文摘要
本發明是一種用于釀造葡萄醋的酵母菌，其特征在于所述的酵母菌是畢赤酵母菌，其保藏登記號為CGMCCNo.3076,分類命名為巴氏畢赤酵母Pichia pastoris,該菌株于2009年5月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。利用本發明的畢赤酵母醋酸菌可將葡萄酒發酵成葡萄醋來生產一種葡萄醋，能克服現有葡萄醋生產過程中原料受季節影響限制的缺點，并可以縮短發酵周期，減少生產成本，得到高醋酸度，低酒精含量的優質葡萄醋。既保持了葡萄具有的營養成份，又具有醋的功效，整個釀造過程無需添加其它添加劑。
文檔編號C12J1/02GK102268383SQ20111025897
公開日2011年12月7日 申請日期2011年9月5日 優先權日2011年9月5日
發明者呂汶洋 申請人:云南永仁和立葡萄醋釀造有限公司