專利名稱：羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白pip基因的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種羊草的鹽堿脅迫誘導蛋白基因。
背景技術：
將植物轉基因技術應用于強耐鹽堿植物的培育是一種有效的途徑，已經有各種基因獲得專利的報道。目前，應用于農作物分子育種的抗鹽堿基因多來源于非鹽生的模式植物擬南芥、水稻等植物中，雖然通過轉基因過量表達有提高作物抗逆性的報道，但是其轉基因效率及功能尚有待提高。我國大部分地區鹽堿化土壤多為氯化鹽(Cr)鹽堿土，這種土壤主要表現為鹽化影響，即Na+對植物的脅迫，而東北地區鹽堿地的突出特點是不僅存在氯化鹽(Cl—)鹽堿土， 還有大面積的碳酸鹽OX)/—)鹽堿土，即不僅存在高鹽離子而且同時伴有高pH危害。目前， 對植物耐鹽堿的研究還大多集中于植物耐NaCl鹽性，而對植物耐堿性特別是耐碳酸鹽(高 pH)研究還亟待深入。羊草(Leymus chinensis)屬禾本科賴草屬植物，是一種廣布于東北地區的優良牧草，尤其突出的是羊草具有較強的耐鹽堿性，長期的鹽堿地條件下生長的羊草具有了一系列適應鹽堿環境的優良特性，其中蘊藏著大量的抗逆基因，是進行抗性基因篩選的良好材料。

發明內容
本發明目的是為了解決現有耐鹽基因轉化獲得的耐鹽轉基因植物的耐鹽能力不高的問題，克隆一種抗鹽堿能力強的牧草羊草的一種鹽堿脅迫應答基因一羊草(Leymus chinensis)鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因。這種抗逆相關基因可以用于科研與生產中， 用于其詳細的抗性機理等方面的研究，并通過轉基因技術來培育抗逆植物新品種。羊草是一種廣泛分布于東北地區的優良牧草，被稱為“牧草中的細糧”。另外，羊草還具有突出的耐鹽堿性，可在黑龍江的鹽堿土壤地區種植，長期的鹽堿地條件下生長的羊草具有了一系列適應鹽堿環境的優良特性，其中蘊藏著大量的抗逆基因。長期以來，對羊草的研究主要集中在生態學、生殖生物學方面，而針對羊草的抗鹽堿特性的研究也主要集中在生理學指標的測定上，但從分子生物學角度對羊草抗鹽堿特性進行研究還比較少，遠不能滿足對其相關特性分子水平研究的要求。本發明通過克隆出抗鹽堿能力很強的羊草的一種鹽堿脅迫應答基因-鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因，然后通過Northern雜交和基因芯片技術檢測其在鹽堿脅迫下的表達情況，分析它是否與植物的抗鹽堿能力相關。本發明的基因編碼區長 879bp，編碼292個氨基酸。經序列同源性blast分析表明，該基因與禾本科其它植物大麥、 小麥的鹽堿脅迫誘導鐵蛋白PIP基因相比同源性較高，DNA序列有約10%的差異，氨基酸序列差異小于5%，本發明獲得的羊草PIP蛋白基因未見基因登錄信息及相關序列信息報道。 應用Northern雜交和基因芯片技術研究鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因在鹽堿脅迫后的表達，結果發現鹽堿脅迫下該基因表達量增加2倍以上，為抗鹽堿相關基因。


圖1為PIP基因PCR擴增電泳圖，M =DNA Marker DL2000 ；1 目的片段；圖2為鹽脅迫后羊草中PIP基因的表達，樣品順序由1至 分別為200mmOl/LNa2C03@灌處理0h、2h、 6h、12h、24h、48h、72h。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因的編碼區序列如說明書附圖中所示。
具體實施方式
二 本實施方式羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因的氨基酸序列如說明書附圖中所示。
具體實施方式
三本實施方式羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因按以下步驟制備(一)羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因的克隆首先利用TSE法提取羊草的總RNA，用Amersham Biosciences公司的mRNA純化試劑盒分離mRNA。采用PCR-klect cDNA Subtraction Kit，以鹽堿脅迫下的羊草樣品為試驗方(Tester)，非鹽堿條件下生長的羊草樣品為消減方(Driver)構建羊草消減文庫。然后對文庫克隆進行測序，測序引物為T7引物，cDNA文庫克隆的測序儀為GE公司的MegaBACE 1000DNA序列分析儀。通過對文庫克隆的BlastX分析獲得鐵蛋白PIP基因片段，序列為CTGGCAGGCGGGACGCACTANTGATTTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGCGCTTTTTTTTTTTCAAAACTAGGAAATAAGCTATATCGATGAAAGCNTACATTTCAAGAGCAAGGANGAAAATACGGGCAAAACAATACACGAAGGACTCCATCCACAGTCGGCAGACTTGATGGTTTGACTAGTCGCGGCTCTTGCAAGGGGATTGCCCTGGATCACACACACGTGGTAGATGGCCGCACAGCGCCGCGCCTGATAAACGGACACCACCCAGAAAGATCCCAGCTG根據獲得的EST片段序列進行引物設計，利用RACE法，克隆獲得羊草完整的PIP 基因。用NCBI ORF FOUNDER尋找開放讀碼框，所獲得的基因cDNA序列全長1215bp，編碼區長879bp，編碼292個氨基酸，結果見說明書附圖。 根據PIP基因的序列設計引物，利用RACE法進行PCR擴增，經0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在IOOObp處得到了單一條帶(見說明書附圖1)，與預期結果一致。( 二)基因芯片檢測羊草植株在鹽堿脅迫下的應答將羊草抑制性消減文庫中的cDNA序列及本實驗室獲得的星星草、草原龍膽的 cDNA序列共同點制在同一張芯片上，制備cDNA微陣列。在反轉錄過程中，利用引物序列中包含的Cy3、Cy5熒光染料捕獲序列標記鹽堿脅迫下生長的羊草和溫室培養羊草(非鹽堿脅迫)的cDNA，按照3DNA Array900 試劑盒中相應步驟完成芯片雜交。芯片雜交進行了三次生物學重復，雜交結果顯示出的變化倍數超過2倍的認為是具有顯著表達差異的基因。基因芯片檢測結果顯示PIP基因表達變化倍數在3次生物重復中均超過2倍。表1基因芯片檢測PIP基因表達變化倍數
基因編號基因注釋變化倍數GO13402aquaporin PIPl (Pipl)2.192.312.29C022002aquaporin PIPl (Pipl)2.402.452.64A020301aquaporin PIPl (Pipl)2.192.092.74(三)羊草PIP基因對逆境脅迫的應答將溫室(平均溫度^°C，濕度約為60%，光照時間14h/d)中盆栽8周齡羊草分別用200mmol/L Na2CO3溶液澆灌，進行脅迫處理，分別在脅迫處理前，脅迫2，6，12，24，48，72h 后取羊草地上部分，迅速放入液氮冷凍，-80°C保存備用。TSE法提取不同脅迫條件下不同時間的羊草葉部總RNA，利用Northern雜交技術， 研究羊草中該基因在Na2CO3脅迫處理下不同時間點的表達情況，結果見說明書附圖2。從圖中可以看出，對照(非脅迫)羊草無明顯的目的條帶，說明在非脅迫下羊草的 PIP基因表達量很低。而在鹽脅迫1 后，PIP基因表達明顯增加，表明該基因能夠對Na2CO3 脅迫做出應答。
權利要求
1.羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因，其特征在于羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP 基因的編碼區序列如下所示ATGGAGGGCAAGGAGGAGGACGTGCGCCTGGGCGCGAACCGGTACTCGGAGCACCAGCCTATCGGCACGGCG GCGCAGGGCGGCGGCGCGGACGAGAAGGACTACAAGGAGCCTCCCCCGGCCCCGCTCTTCGAGGCGGAGGAGCTCAC CTCCTGGTCCTTCTACCGGGCCGGCATCGCCGAGTTCCTGGCCACCTTCCTCTTCCTCTACATCAGCGTCCTCACCG TCATGGGCGTGGTGGGCAACCCGTCGGGGTCCAAGTGCGGGACCGTGGGCATCCAGGGCATCGCCTGGAGCTTCGGC GGCATGATCTTCGTGCTCGTCCACTGCACCGCCGGCATCTCCGGCGGCCACATCAACCCGGCGGTCACCTTCGGGCT GTTCCTGGCCCGGAAGCTGTCGCTCACCAGGGCCGTCTTCTACATGGTGATGCAGTGCCTGGGCGCGATATGCGGGG CTGGGGTTGTCAAGGGGTTCCAGACCACGCTGTACCAGGGCAACGGCGGCGGCGCCAACTCCGTCGCGCCCGGGTAC ACCAAGGGAGACGGGCTCGGGGCCGAGATCGTCGGCACGTTCGTGCTGGTTTACACCGTGTTCTCCGCCACCGACGC CAAGCGCAGCGCCAGAGACTCACACGTCCCCATTTTGGCGCCGCTTCCGATCGGGTTCGCAGTGTTCCTGGTGCACC TGGCGACGATCCCCATCACCGGGACCGGCATCAACCCGGCGAGGTCCCTCGGCGCCGCCATCATCTACAACAAGAAG CAGGCGTGGGACGACCACTGGATCTTCTGGGTGGGTCCGTTCATCGGCGCAGCGCTGGCGGCCATCTACCACGTGGT GGTGATCAGGGCAATCCCCTTCAAGAGCCGCGACTAG。
2.羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP基因，其特征在于羊草鹽堿脅迫誘導水孔蛋白PIP 基因的氨基酸序列如下所示MetGluGlyLysGluGluAspValArgLeuGlyAlaAsnArg TyrSerGluHisGlnProlieGlyThrAlaAlaGlnGlyGlyGly AlaAspGluLysAspTyrLysGluProProProAlaProLeuPheGluAlaGluGluLeuThrSerTrpSerPheTyrArgAlaGlyIle AlaGluPheLeuAlaThrPheLeuPheLeuTyrlieSerValLeuThrValMetGlyValValGlyAsnProSerGlySerLysCysGlyThrValGlylieGlnGlylieAlaTrpSerPheGlyGlyMetliePheValLeuValHisCysThrAlaGlylieSerGlyGlyHislieAsnProAlaValThrPheGlyLeuPheLeuAlaArgLysLeuSerLeuThrArgAlaValPheTyrMetValMetGlnCysLeuGlyAlalieCysGlyAlaGlyValValLysGlyPheGlnThrThrLeuTyrGlnGlyAsnGlyGlyGlyAlaAsnSerValAlaProGlyTyrThrLysGlyAspGlyLeuGlyAlaGlulieValGlyThrPheValLeuValTyrThrValPheSerAlaThrAspAlaLysArgSerAlaArgAspSerHisValProlieLeuAlaProLeuProlieGlyPheAlaValPheLeuValHisLeuAlaThrlieProlieThrGlyThrGlylieAsnProAlaArgSerLeuGlyAlaAlalielieTyrAsnLysLysGlnAlaTrpAspAspHisTrpliePheTrpValGlyProPhelieGlyAlaAlaLeuAlaAlalieTyrHisValValVallieArgAlalieProPheLysSerArgAsp
全文摘要
羊草鹽堿脅迫誘導PIP蛋白基因，它屬于基因工程技術領域。本發明利用RACE法克隆獲得耐鹽堿能力極強的羊草的一種鹽堿脅迫應答基因-PIP蛋白基因全長序列，然后，通過Northern檢測和遺傳轉化檢測其在鹽堿脅迫下表達情況，分析它是否與抗鹽堿脅迫相關。本發明獲得的PIP蛋白基因編碼區879bp，編碼292個氨基酸。與禾本科其它植物大麥、小麥等相比同源性較高，DNA序列有約10％的差異，氨基酸序列差異小于5％，本發明獲得的羊草PIP蛋白基因未見基因登錄信息及相關序列信息報道。本發明所得基因Northern雜交和基因芯片技術研究鹽堿脅迫誘導PIP蛋白基因在鹽堿脅迫后的表達，結果發現，鹽堿脅迫下該基因的表達量增加2倍以上，為與鹽堿脅迫相關基因。
文檔編號C12N15/29GK102373219SQ20101025590
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月9日 優先權日2010年8月9日
發明者張旸, 李玉花, 王江, 解莉楠 申請人:張旸, 李玉花, 王江, 解莉楠