專利名稱：一株拜氏不動桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株拜氏不動桿菌及其應用。
背景技術：
石油已經成為了人類生活必不可少的能源，為人類文明和社會進步做出了巨大的貢獻。然而，由于各種原因使石油進入了環境，造成了環境的污染，給人類的生存帶來了危害。土壤鹽堿化目前也是世界性的土壤退化問題之一，土壤鹽堿度是影響植物生長和產量的一個重要的環境因子，鹽堿脅迫幾乎會影響植物所有的重要生命過程，給農業生產造成了極大的損失。污染土壤的植物修復因其費用低、效果好且不會造成二次污染而成為世界各國關
注的焦點。而植物修復在實施過程中也存在問題，如石油及鹽堿土壤的生物有效性低，使植物生長緩慢或不生長，生物量小等，這些都影響植物修復的效果。而石油及鹽堿共同脅迫使修復更加困難。如何促進植物在石油鹽堿共同脅迫情況下提高植物生長及對污染物的代謝是植物修復中的關鍵。環境脅迫可以導致植物體內脅迫乙烯的大量積累，而過量的乙烯會導致植物根部的生長受阻。I-氨基環丙燒-I-羧酸(1-aminocyclopropane-l-carboxylate, ACC)是植物體內乙烯的合成前體，很多研究發現，多種植物根際促生細菌(PGPR)可分泌ACC脫氨酶(ACXD)，將ACC分解為a-丁酮酸和氨，可減少脅迫乙烯的產生，促進植物的生長。因此，亟待開發能夠在石油污染的鹽堿土中有效促進植物生長的植物根際促生細菌。

發明內容
本發明的目的是提供一株拜氏不動桿菌及其應用。本發明提供的拜氏不動桿菌(Acinetobacterbeijerinckii) LJL-12,已于 2012年6月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. 6291。拜氏不動桿菌(Acinetobacter bei jerinckii ) LJL-12CGMCC No. 6291 簡稱拜氏不動桿菌LJL-12。本發明還保護拜氏不動桿菌LJL-12在促進植物生長中的應用。所述植物具體可為燕麥。所述促進植物生長具體可為促進植物在石油污染和/或鹽堿性土壤中的生長。本發明還保護一種植物生長促進劑，其活性成分為拜氏不動桿菌LJL-12。所述植物具體可為燕麥。所述活性成分具體可為將拜氏不動桿菌UL-12懸浮于水中得到的菌懸液。所述菌懸液中，拜氏不動桿菌LJL-12的濃度具體可為109CFU/mL。本發明還保護所述植物生長促進劑在促進植物生長中的應用。所述植物具體可為燕麥。以上任一所述燕麥具體可為品種Baiyan No. 7。 拜氏不動桿菌LJL-12可用于生產I-氨基環丙烷-I-羧酸脫氨酶和/或吲哚乙酸和/或嗜鐵素。應用拜氏不動桿菌LJL-12生產I-氨基環丙烷-I-羧酸脫氨酶可包括如下步驟(I)將拜氏不動桿菌LJL-12懸浮于ADF培養液，振蕩培養后收集菌體；(2)將步驟(I)得到的菌體懸浮于0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8. 0)，加入甲苯并破碎細胞，得到I-氨基環丙烷-I-羧酸脫氨酶。所述0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8. 0)和所述甲苯的加入量配比具體可為600ii L 0. lmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8. 0) 30u L 甲苯。步驟(I)中，所述破碎細胞的方法具體可為采用渦旋震蕩儀振蕩30s。應用所述拜氏不動桿菌LJL-12生產吲哚乙酸具體可包括如下步驟將拜氏不動桿菌LJL-12接種于含有色氨酸的DF培養液，培養后得到吲哚乙酸。所述色氨酸在所述DF培養液中的濃度具體可為50-500 u g -Iiir10所述培養的條件可為室溫培養2天。所述培養的條件具體可為28°C、180r mirT1振蕩培養2天(48小時)。應用所述拜氏不動桿菌LJL-12生產嗜鐵素具體可包括如下步驟將拜氏不動桿菌LJL-12接種于MKB培養基，培養過后得到嗜鐵素。所述培養的條件可為室溫培養2天。所述培養的條件具體可為28°C、180r mirT1振蕩培養2天(48小時)。本發明還保護拜氏不動桿菌LJL-12的發酵液。所述發酵液是將拜氏不動桿菌LJL-12接種于發酵培養基并進行發酵后得到的。所述發酵培養基具體可為含有色氨酸的DF培養液或MKB培養基。所述色氨酸在所述DF培養液中的濃度具體可為50-500 u g所述發酵的條件可為室溫培養2天。所述發酵的條件具體可為28°C、180r ^irT1振蕩培養2天。所述發酵液中含有吲哚乙酸或嗜鐵素。本發明還保護拜氏不動桿菌LJL-12的細胞破碎物。所述細胞破碎物中含有I-氨基環丙烷-I-羧酸脫氨酶。拜氏不動桿菌LJL-12具有如下應用價值可以在ACC作為唯一氮源的環境中生長，同時將ACC分解；可以合成IAA，且IAA合成量隨著L-Trp濃度的增加而增加；可以合成嗜鐵素；在石油污染的鹽堿土中對燕麥的生長有促進作用。拜氏不動桿菌LJL-12有望在石油污染的鹽堿土壤的植物修復中發揮重要作用。


圖I為拜氏不動桿菌LJL-12在ADF培養基上的生長狀況。圖2為拜氏不動桿菌LJL-12在不同濃度L-Trp中IAA合成量的變化。圖3為拜氏不動桿菌LJL-12在鉻天青S固體培養基平板上形成橘黃色暈圈。圖4為拜氏不動桿菌LJL-12對燕麥促生30天時盆栽效果。圖5為拜氏不動桿菌LJL-12對燕麥促生50天時盆栽效果。圖6為拜氏不動桿菌LJL-12對燕麥促生80天時盆栽效果。圖7為拜氏不動桿菌LJL-12在石油污染鹽堿土壤中對燕麥植株生長的影響。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。I-氨基環丙燒-I-羧酸，英文名稱為 l-aminocyclopropane-l-carboxylic acid,簡稱為ACC:購于上海笛柏化學品技術有限公司，貨號為P201735。哌嗪-1，4-二乙磺酸，英文名稱為 piperazine-N, N' -bis (2-ethanesulfonic acid),簡稱為 PIPES :購于 Sigma 公司，貨號為 MFCD06658739。TSB培養液(pH7. 5):取胰蛋白胨17. 0g、大豆胨3. 0g、NaCl 5. 0g、葡萄糖2. 5g、K2HPO4 2. 5g,加入蒸懼水并用蒸懼水定容至1000mL。DF 培養液(pH7.5):取 KH2P044. Og、Na2HP046. Og、MgSO4 7H20 0. 2g、FeSO4 7H200. lmg，葡萄糖 2. Og、葡萄糖酸 2. Og、檸檬酸 2. Og、(NH4) 2S042. 0g、0. ImL 微量元素溶液，加入蒸懼水并用蒸懼水定容至1000mL。
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ADF 培養液(pH7. 5):用 3. Ommol ACC 替代 DF 培養液中的 2. Og (NH4)2S04,其它完全同DF培養液；ADF培養液中ACC為唯一氮源。微量元素溶液取H3BO3IOmg、MnSO4Il. 2mg、ZnSO4124. 6mg、CuS0478. 2mg 和MoO3IOmg,加入蒸懼水并用蒸懼水定容至100mL。MKB培養基(pH7. 2):取酸水解酪蛋白 5g、甘油 15mL、K2HP042. 5g、MgS04 *7H20 2. 5g，加入蒸懼水并用蒸懼水定容至1000mL。實施例I、拜氏不動桿菌LJL-12的分離和鑒定一、菌株LJL-12的獲得I、取樣土壤取自黑龍江省大慶市采油廠附近鹽堿土中生長的稗草的根際土，將根際土裝入滅過菌的采集瓶中帶回實驗室，放入4°C冰箱保存備用。2、篩選和純化(I)取Ig根際土樣于50mL PAF培養基中，28°C振蕩培養。PAF培養基含有蛋白胨、酪蛋白水解物、MgS04、K2HPO4和甘油。(2)取ImL (I)震蕩后的PAF培養液，于50mL PAF培養基中，28°C振蕩培養。(3)取ImL (2)得到的PAF培養液，于50mL DF鹽培養液中，28°C振蕩培養。DF鹽培養液含有 KH2P04、Na2HP04、MgS04、FeS04、葡萄糖、葡萄糖酸、檸檬酸、(NH4)2S04、H3B03、MnS04、ZnSO4、CuSO4 和 MoO3。(4)取ImL (3)得到的DF鹽培養液，于50mL不含(NH4)2SO4但含有3mM I-氨基環丙烷-I-羧酸的上述DF鹽培養液中，28°C振蕩培養。(5)取ImL (4)得到的培養液，涂布于含3mM ACC的DF鹽瓊脂培養基上，28°C培養。(6)取(5)培養基上生長的菌落，純化并得到純培養的菌株。將得到的一株菌命名為LJL-12。二、菌株LJL-12的鑒定I、形態鑒定菌株菌株LJL-12在ADF培養基上形成圓形、不透明、灰白色、突起光滑、邊緣整齊、有粘性的菌落(圖I)。
2、分子鑒定提取菌株LJL-12的基因組DNA，進行16S rDNA的PCR擴增和測序。PCR擴增采用的引物如下F8 :5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；F1541 :5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR 擴增條件-MV 3min ；94°C 30s,55°C 30s,72°C 90s, 30 個循環；72°C IOmin0對PCR擴增產物進行測序，測序結果如序列表的序列I所示。三、菌株LJL-12的保藏通過步驟二的鑒定，菌株LJL-12屬于拜氏不動桿菌(Acinetobacterbeijerinckii)。拜氏不動桿菌(Acinetobacterbei jerinckii ) LJL-12,已于 2012 年 6 月 26 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. 6291。拜氏不動桿菌(Acinetobacter bei jerinckii ) LJL-12CGMCC No. 6291 簡稱拜氏不動桿菌LJL-I2。實施例2、拜氏不動桿菌LJL-12生產ACC脫氨酶的能力實驗機理1_氨基環丙烷-I-羧酸在ACC脫氨酶的作用下，降解生成a _ 丁酮酸(a -KA)和氨氣。實驗步驟如下I、將拜氏不動桿菌LJL-12在TSB培養液中過夜培養，4°C離心收集菌體并用DF培養液洗滌三次。2、將步驟I得到的菌體重新懸浮于ADF培養液，室溫(21 士 1°C )振蕩培養2d，4°C離心收集菌體，用0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7. 6)洗滌三次。3、將步驟2得到的菌體重新懸浮于600 U L 0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)中，加入30 ii L甲苯并迅速振蕩30s (采用渦旋震蕩儀)以破碎細胞，整個破碎后體系即為細胞提取物。4、分組處理實驗組取200 U L細胞提取物，加入20 U L 0. 5mol/L ACC水溶液并混勻，30°C培養15min (即反應時間為15min，也就是0. 25小時);然后加入ImL 0. 56mol/L HCl水溶液，16000g離心5min,取上清液；取ImL上清液，加入800 u L 0. 56mol/L HCl水溶液和300 u L2,4- 二硝基苯肼溶液(溶劑為2M HCl水溶液)，30°C培養30min，加入2mL 2mol/L NaOH水溶液，540nm測吸光度，得到OD54tlnm數值。空白對照組用20 ii L水代替20 ii L 0. 5mol/L ACC水溶液，其它同實驗組。采用a -丙酮酸標準品代替以上細胞提取物進行步驟4的實驗組相同的實驗并制作標準曲線，標準曲線方程(方程甲)如下y=3. 6928x-0. 035(R2=O. 9879)，其中x代表OD54tol數值，y代表0-丁酮酸含量(11!1101)。采用考馬斯亮藍法(Bradford法)檢測細胞提取物的總蛋白含量。以采用牛血清白蛋白為標準品，制作標準曲線，標準曲線方程(方程乙)如下y=205. 73x-l. 3251(R2=O. 9846)，其中x代表OD595nm數值，y代表蛋白含量(mg)。
ACC脫氨酶活性的計算方法如下將(實驗組的OD54tol數值-空白對照組的OD54tol數值)的結果代入方程甲，得到數值A ;將細胞提取物的總蛋白含量作為數值B ;用數值A除以數值B，再除以反應時間(0.25小時)，得到的結果即為ACC脫氨酶活性，單位為U mo I a -KA (mg 蛋白質 h) 1。拜氏不動桿菌LJL-12得到的細胞提取物具有ACC脫氨酶活性，數值為14. 94 u mo I a -KA (mg 蛋白質 h)、實施例3、拜氏不動桿菌LJL-12生產生長激素(D引哚乙酸，IAA)的能力I、將拜氏不動桿菌LJL-12在DF培養液中28 V、180r mirT1振蕩培養2d，再微量轉入添加不同濃度色氨酸(L-Trp)的DF培養液(L-Trp的濃度為0、50、100、200或500 u g mL-1)中繼續280C、180r mirT1振蕩培養2d，取樣測菌液OD600 (OD600nm數值)，其余培養液室溫下SOOOg離心取上清液。
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2、取500 u L步驟I的上清液，添加2mL Salkowski試劑(每升含150mL H2SO4,250mLddH20和7. 5mL 0. 5mol/L FeCl3水溶液,其余為水),室溫黑暗培養20min在535nm處
測吸光度(OD535nm數值)。將DF培養液代替步驟I的上清液進行步驟2的實驗，作為測吸光度的調零處理。將不同濃度的IAA水溶液代替步驟I的上清液進行步驟2的實驗，制作標準曲線，標準曲線方程如下y=0. 1701x-0. 0237 (R2=O. 9855)，其中x代表OD535nm數值，y代表IAA濃度(ii g mL-1)。對照標準曲線，計算步驟I得到的上清液中的IAA濃度。將IAA濃度除以OD6tltol數值，結果見表I和圖2。表I步驟I得到的上清液中的IAA濃度，單位為ii g (mL OD600)
步驟I fl+9 DP培養液中fl<J I Trp濃度(_ . mil__0__50 100 200 500
_Jllit鐵中 ft IM IHfM__0. 073 07F> 0 091 0 139 0-撕結果表明，拜氏不動桿菌LJL-12能產生吲哚乙酸，且隨著L-Trp濃度的增加，吲哚乙酸合成量也隨之增加。實施例4、拜氏不動桿菌LJL-12生產嗜鐵素的能力某些菌株通過產生嗜鐵素(Siderophores)與環境中的鐵離子高度結合，使植物病原菌缺乏鐵營養而不能生長繁殖，從而占據一定的生態位。一、鉻天青S固體培養基平板的制備I、藍色染液的制備(I)將 0. 06g 絡天青 S (chrome azurol S)溶于 50ml 去離子水。(2)取0. 0027g FeCl 6H20溶于IOml IOmM HCl水溶液(溶劑為去離子水)。(3)取0. 073g CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)溶于40ml去離子水。(4)將全部步驟(I)的溶液與9ml步驟(2)的溶液混合，再混合全部步驟(3)的溶液，此時為藍色，121°C滅菌20min。2、鉻天青S固體培養基平板的制備(1)MM9 培養液將 15g KH2PO4'25g NaCl 和 50g NH4Cl 溶于 500ml 去離子水。
(2)將20g葡萄糖溶于IOOmL去離子水，110°C滅菌。(3)將3g酪蛋白水解物溶于27ml去離子水，濾膜過濾并收集濾液。(4)鉻天青S固體培養基平板的制備將100ml MM9培養液與750ml去離子水混勻，然后加入32. 24g PIPES并使其溶解，加入15g瓊脂，121°C滅菌20min后冷卻到50°C，然后加入30ml步驟(3)得到的濾液和IOml步驟(2)得到的溶液，然后緩慢加入IOOml步驟I制備的藍色染液(沿玻璃瓶壁加入，充分混勻)，倒板。二、拜氏不動桿菌LJL-12生產嗜鐵素的能力將拜氏不動桿菌LJL-12接種至于鉻天青S固體培養基平板上，28°C培養48h，觀察菌落周圍的顏色變化，如有橘黃色圈產生說明拜氏不動桿菌UL-12產生了嗜鐵素。28°C培養48h后的照片見圖3。拜氏不動桿菌LJL-12菌落周圍有橘黃色暈圈產生，即拜氏不動桿菌LJL-12可產生嗜鐵素。三、CAS檢測液的制備I、將 0. 182g CTAB 溶于 50ml 去離子水。2、將 0. 0054g FeCl 6H20 溶于 20ml IOmM HCl 水溶液。3、將0. 0605g鉻天青S溶于50ml去離子水。4、將I. 5ml步驟2得到的溶液與7. 5ml步驟3得到的溶液混合，再與6ml步驟I得到的溶液混合，得到混合液。5、將 4. 307g PIPES 用 20_30ml 去離子水溶解，加入 6. 25ml 濃 HC1，調 pH 為 5. 6。6、將全部步驟4得到的溶液和全部步驟5得到的溶液混合，并用去離子水定容至溶 100mlo四、拜氏不動桿菌LJL-12生產嗜鐵素的能力I、將拜氏不動桿菌LJL-12接種于MKB培養基，28°C、180r ^mirT1振蕩培養48h，離心(10000rpm/min, IOmin)取上清液。2、將步驟I得到的上清液與CAS檢測液等體積混勻，28°C靜置lh，然后在630nm處測吸光值(OD63tlnm數值)，結果為A。3、將MKB培養基與CAS檢測液等體積混勻，28°C靜置Ih，然后在630nm處測吸光值(OD63tlnm數值)，結果為Ar。A/Ar值越小，說明合成嗜鐵素能力越強。拜氏不動桿菌LJL-12的A/Ar值為I. 83，說明其具有一定的合成嗜鐵素的能力。實施例5、拜氏不動桿菌LJL-12對燕麥的促生效果土壤(鹽堿土壤)取于黑龍江省大慶市，采集樣品時在每個區域內設置5個樣方，樣方面積為IX Im2,收集表層土壤((T20cm), 土壤混合后,裝入事先準備好的干凈保鮮袋中，迅速將土樣帶回實驗室，經碾碎，混勻，風干后過篩保存。土壤的理化性質見表2。表2 土壤理化性質
權利要求
1.拜氏不動桿菌(Acinetobacterbeijerinckii) LJL-12,它的保藏編號為 CGMCCNo.6291。
2.權利要求I所述拜氏不動桿菌LJL-12在促進植物生長中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述植物為燕麥。
4.一種植物生長促進劑，其活性成分為權利要求I所述拜氏不動桿菌LJL-12。
5.如權利要求4所述的植物生長促進劑，其特征在于所述植物為燕麥。
6.權利要求4所述植物生長促進劑在促進植物生長中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述植物為燕麥。
8.權利要求I所述拜氏不動桿菌LJL-12在生產I-氨基環丙烷-I-羧酸脫氨酶和/或吲哚乙酸和/或嗜鐵素中的應用。
9.權利要求I所述拜氏不動桿菌LJL-12的發酵液。
10.權利要求I所述拜氏不動桿菌LJL-12的細胞破碎物。
全文摘要
本發明公開了一株拜氏不動桿菌及其應用。本發明提供的拜氏不動桿菌(Acinetobacterbeijerinckii)LJL-12，它的保藏編號為CGMCCNo.6291。拜氏不動桿菌LJL-12具有如下應用價值可以在ACC作為唯一氮源的環境中生長，同時將ACC分解；可以合成IAA，且IAA合成量隨著L-Trp濃度的增加而增加；可以合成嗜鐵素；在石油污染的鹽堿土中對燕麥的生長有促進作用。拜氏不動桿菌LJL-12有望在石油污染的鹽堿土壤的植物修復中發揮重要作用。
文檔編號C12P1/04GK102787089SQ20121027916
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年8月7日
發明者劉佳莉, 方芳, 蔡洪生, 謝寶明, 郭長虹 申請人:哈爾濱師范大學