一種大豆小RNA基因gma-miR1507a及在鹽堿調控中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種大豆小RNA基因gma-miR1507a及前體基因，它來自于大豆品種吉育72，將前體基因插入經改造的pCAMBIA1301載體中，獲得pCAMBIA-bar-miR1507a載體質粒，將載體質粒轉入農桿菌EHA105中，轉染擬南芥中，實驗結果表明，轉基因擬南芥提高了植物的耐鹽堿脅迫能力。
【專利說明】—種大豆小RNA基因gma-m i R1507a及在鹽堿調控中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬分子生物學領域，具體為大豆中一個小RNA基因gma_miR1507a及在鹽堿調控中的應用。
【背景技術】
[0002]microRNA是目前廣泛研究的一類內源性非編碼小RNA分子，長度范圍在19-29nt，平均長22nt，miRNA的轉錄調控參與真核生物發育的各個時期及過程，靶向調控動植物的多個代謝調控機制。miRNA的轉錄后調控與植物抗逆調控的關聯十分密切，近年來研究發現，miRNA在逆境脅迫下可發生表達變化，通過miRNA的升高或降低表達，響應外界環境刺激。擬南芥中miR393，miR319及miR397，水稻miR393在干旱脅迫下發現表達水平上調。擬南芥的 miR396, miR167, miR319, miR159, miR394, miR156, miR171, miR158 和 miR393 在鹽脅迫條件下表達上調。毛果楊中的miR1446、miR1444、miR1447、miR145等基因在水缺乏的條件下表達下調。另外毛果楊miR1446、miR1445、miR1447、miR530的在鹽堿脅迫下表達下調。
[0003]很多保守miRNA在植物的生長發育中有重要作用，該作用主要通過對靶基因的調控實現。例如 miR156，miR159, miR164, miR165/166, miR167, miR169, miR171, miR172,miR319 及 miR396 的靶基因分別為轉錄因子 SPLs，ARFs, MYBs, TCPs, NACs, HD-ZIPs, NFYA,AP2-like factors, SCLs及GRFs等，轉錄因子作為植物發育的調控因子直接參與植物生長及抗逆應答等過程。根據Genevestigator數據庫顯示:在植物逆境應答過程中,某些保守的miRNA表達產生變化，靶基因表達水平也呈相關調整。在植物對逆境的脅迫應答過程中，miRNA通過對靶基因的調控，增強或改善植物對環境的適應性。
`[0004]大豆(Glycine max)作為世界上重要的糧食作物和油料作物。逆境脅迫嚴重危害大豆產量，通過大豆逆境脅迫下基因表達水平變化，挖掘大豆耐鹽堿基因資源，通過基因工程手段培育耐鹽堿作物，對提高大豆產量有現實意義。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種大豆中一個小RNA基因gma_miR1507a及其前體基因。
[0006]個小RNA基因gma_miR1507a如體基因，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
[0007]一個小RNA基因gma-miR1507a,其堿基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0008]一種小RNA基因gma_miR1507a的表達載體pCAMBIA-bar_miR1507a,它是由下述方法制備:
1)人工合成序列表SEQID N0.3所不的bar基因序列；
2)用XhoI 酶切 bar 基因序列和 pCAMBIA1301，將 bar 插入 pCAMBIA1301 (購自 pcambia公司)的兩個XhoI酶切位點間，替換潮霉素抗性基因；
3)用HindIII和BstE II分步酶切質粒，Taq酶補平末端后，用T4連接酶連接平末端；最后，將克隆的兩端帶有EcoRI的35S啟動子基因與EcoRI單酶切后的質粒連接，獲得質粒pCAMBIA-bar ；
4)目的基因和pCAMBIA-bar用Bamm和歷/?dIII雙酶切，連接，得pCAMBIA-bar-miR1507a。
[0009]本發明又一個目的是一個小RNA基因gma_miR1507a在培育耐鹽堿植物品種中的應用。
[0010]一種培育耐鹽堿植物品種的方法，它包括:
1)將pCAMBIA-bar-miR1507a載體質粒轉入到農桿菌EHA105感受態細胞中；
2)農桿菌轉化至植物中。
[0011 ] 本發明提供了一種大豆中一個小RNA基因gma_miR1507a及前體基因，它來自于大豆品種吉育72，將前體基因插入經改造的pCAMBIA1301載體中，獲得pCAMBIA-bar-miR1507a載體質粒，將載體質粒轉入農桿菌EHA105中，轉染擬南芥中，實驗結果表明，轉基因擬南芥提高了植物的耐鹽堿脅迫能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1吉育72大豆品種gma_miR1507a在逆境脅迫下基因表達分析圖；
圖2為gma-miR1507a前體基因克隆產物電泳圖；
圖3為pMD19-T simple-miRNA1507a質粒進行雙酶切電泳圖；
圖4轉miR1507a基因的擬南芥PCR鑒定圖`；
圖5轉miR1507a基因擬南芥的高表達株系篩選；
圖6為轉基因擬南芥在各協迫條件下的發芽率照片，其中:A.空白對照；B.1OOmM NaCl脅迫條件下轉基因擬南芥生長狀況；C.7.5mM NaHCO3脅迫條件下轉基因擬南芥生長狀況；D.90mM NaCl+5mM NaHCO3脅迫條件下轉基因擬南芥生長狀況；E.7%PEG脅迫條件下轉基因擬南芥生長狀況；
圖7為轉基因擬南芥在各協迫條件下的發芽率柱狀圖；
圖8轉基因擬南芥4片葉齡時，各協迫條件下長勢照片。
【具體實施方式】
[0013]實施例1 gma_miR1507a基因及其前體基因的獲得
選吉育72(本驗室保存)大豆品種，通過I X Hoagland培養液水培獲得大豆幼苗，3天更換一次培養液，待幼苗長出兩葉一心時，使用含有20mM NaCl的培養基脅迫處理。24小時后采集葉片，液氮中固定半小時后放入_80°C冰箱中保存。提取葉片總RNA，反轉錄為cDNA。
[0014]以反轉錄的cDNA 為模板，使用引物 gma-miR1507aF-2，gma_miR1507aR-2，擴增兩端帶有漢3ΜΠ和酶切位點的gma-miR1507a前體基因序列(見圖2)。將含有gma_miR1507a前體序列構建重組質粒pMD19_T simple-miR1507a并進行測序驗證。用限制性內切酶漢.ΗΙ和歷/7dIII按照下列體系對pMD19-T simple-miR1507a進行雙酶切，然后回收目的基因(見圖3)。如體基因喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
【權利要求】
1.1v小RNA某因gmaniR1507a如體基因，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
2.一個小RNA基因gma-miR1507a，其堿基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.一種小RNA基因gma-miR1507a的表達載體pCAMBIA-bar_miR1507a，它是由下述方法制備: 1)人工合成序列表SEQID N0.3所不的bar基因序列； 2)用XhoI 酶切 bar 基因序列和 pCAMBIA1301，將 bar 插入 pCAMBIA1301 (購自 pcambia公司)的兩個XhoI酶切位點間，替換潮霉素抗性基因； 3)用HindIII和BstE II分步酶切質粒，Taq酶補平末端后，用T4連接酶連接平末端；將克隆的兩端帶有EcoRI的35S啟動子基因與EcoRI單酶切后的質粒連接，獲得質粒pCAMBIA-bar ； 4)序列表SEQID N0.1所示的基因和pCAMBIA-bar用漢.ΗΙ和歷雙酶切，連接，得 pCAMBIA-bar-miR1507a。
4.權利要求1或2所述的一個小RNA基因gma-miR1507a在培育耐鹽堿植物品種中的應用。
5.一種培育耐鹽堿植物品種的方法，它包括: 1)將權利要求3所述的pCAMBIA-bar-miR1507a載體質粒轉入到農桿菌EHA105感受態細胞中； 2)農桿菌轉化至植物中。
【文檔編號】C12N15/11GK103757016SQ201410020732
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】李海燕, 董園園, 敬緩緩, 劉偉燦, 王南, 陳歡, 王法微, 周穎, 尹海龍, 周永剛, 趙利旦 申請人:吉林農業大學