專利名稱：一種無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基的配制方法
技術領域：
本發明涉及無血清或低血清培養基的配制，具體涉及一種無血清大豆蛋白肽動物 細胞培養基的配制方法(病毒宿主)。
背景技術：
動物細胞是病毒、蛋白的表達載體，細胞質量直接影響表達量，只有好的培養基才 能篩選、馴化出優質細胞。普通的細胞培養基中含有小牛血清，由于血清都是批量生產，各 批間差異很大、質量不穩定，而且血清中含有一些對細細胞產生毒性的物質，會影響細胞的 生長，甚至造成細胞死亡，同時也增加了生產中分離純化的難度，而且特別不適合生長因子 對細胞作用的研究、細胞分泌物功能的研究及大量細胞分泌物的制備。無血清培養基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合 成培養基。目前的無血清培養基在原代培養或者細胞狀況不良時，還只能先用有血清的培 養液進行培養，待細胞生長旺盛以后才能再換成無血清培養液；而且多數細胞轉入無血清 培養基培養需要有一個較長的適應過程，一般要逐步降低血清濃度，直至無血清培養。由于 目前的無血清培養基包含非常少的蛋白質，所以更易于受外界因素的影響，容易導致所培 養的細胞致死性損害。

發明內容
本發明的目的是為了解決現有無血清培養基不能直接培養生長狀況不良的細胞， 多數細胞要逐步降低血清濃度才能適應現有的無血清培養基及易受外界因素的影響，容易 造成致死性損害的問題，而提供的一種無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基。本發明是這樣實現的將氯化鈣100-400mg、氯化鉀100_500mg、無水硫酸鎂 50-150mg、氯化鈉 3000-8000mg、無水磷酸二氫鈉 100_200mg、L-谷氨酰胺 100_500mg、D-葡 萄糖 500-2000mg、酚紅 5_20mg、D-泛酸鈣 0. 50_5mg、氯化膽堿 0. 50_5mg、葉酸 0. 5_5mg、 i-肌醇l_5mg、煙酰胺0. 5-5mg、鹽酸吡哆醛0. 5_5mg、核黃素0. 05-lmg、鹽酸硫0. 5_5mg和 大豆蛋白肽2000-8000mg用蒸餾水定容至IOOOmL ；所述的大豆蛋白肽的分子量小于等于 3000道爾頓，大豆蛋白肽含有18種氨基酸或以上。使用該方法生產出來的培養基用于培養CHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、雜交瘤細 胞、HEK293細胞、MDCK細胞、HeLa細胞和MDBK細胞。本發明無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基中所使用的大豆蛋白肽要求其分子量 應當< 3000道爾頓，由微生物發酵法制得。由于微生物的作用將大分子的蛋白分解為更具 有活性的小分子肽，且含有18種氨基酸。在配制培養基的過程中小分子大豆蛋白肽可以代 替血清中的動物源性蛋白和活性因子。由于采用的是大豆蛋白肽，所以可以有效的避免動 物源性蛋白對所培養動物細胞或人細胞的干擾。動物細胞可直接在本發明無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基上培養而不必逐步 馴化和培養，節省了培養周期和其它因素的干擾，并且使用本發明無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基細胞成活率高達94%以上。采用本發明無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基簡化了后期的分離純化工藝，使雜 質含量降低，提高產品純度，降低生產成本。
具體實施例方式實例一將氯化鈣lOOmg、氯化鉀lOOmg、無水硫酸鎂50mg、氯化鈉3000mg、無水磷酸二氫鈉 100mg、L-谷氨酰胺100mg、D-葡萄糖500mg、酚紅5mg、D_泛酸鈣0. 50mg、氯化膽堿0. 50mg、 葉酸0. 5mg、i-肌醇lmg、煙酰胺0. 5mg、鹽酸吡哆醛0. 5mg、核黃素0. 05mg、鹽酸硫0. 5mg和 大豆蛋白肽2000mg用蒸餾水定容至IOOOmL ；所述的大豆蛋白肽的分子量小于等于3000道 爾頓，大豆蛋白肽含有18種氨基酸或以上。此培養基可用于培養CHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、雜交瘤細胞、HEK293細胞、 MDCK細胞、HeLa細胞、MDBK細胞等。對于培養基中必須添加血清培養的特殊細胞，如Marcl45細胞、BHK21、VER0細胞、 骨髓間充質干細胞等，在本發明無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基中再添加質量分數小于 3%的血清，后即可實現成功培養(現有血清培養基中血清加入量為質量的8% 10% )。本實施方式無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基可增加所培養細胞的密度及收獲 次數，提高表達量，從而提高醫藥領域的疫苗產量；并解決因取消或降低牛血清的使用而造 成的細胞過早死亡，形態不飽滿問題。本實施方式因為采用大豆蛋白肽，其成本遠遠低于使用牛血清的培養基，并同時 解決了現有無血清培養基培養細胞過早死亡、形態不飽滿的問題。而且本實施方式無血清 大豆蛋白肽動物細胞培養基培養的細胞不易發生老化脫落現象，細胞增殖迅速、代謝旺盛。實例二將氯化鈣400mg、氯化鉀500mg、無水硫酸鎂150mg、氯化鈉8000mg、無水磷酸二氫 鈉200mg、L-谷氨酰胺500mg、D-葡萄糖2000mg、酚紅20mg、D-泛酸鈣5mg、氯化膽堿5mg、 葉酸5mg、i-肌醇5mg、煙酰胺5mg、鹽酸吡哆醛5mg、核黃素lmg、鹽酸硫5mg和大豆蛋白肽 SOOOmg用蒸餾水定容至IOOOmL;所述的大豆蛋白肽的分子量小于等于3000道爾頓，大豆蛋 白肽含有18種氨基酸或以上。此培養基可用于培養CHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、雜交瘤細胞、HEK293細胞、 MDCK細胞、HeLa細胞、MDBK細胞等。對于培養基中必須添加血清培養的特殊細胞，如Marcl45細胞、BHK21、VER0細胞、 骨髓間充質干細胞等，在本發明無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基中再添加質量分數小于 3%的血清，后即可實現成功培養(現有血清培養基中血清加入量為質量的8% 10% )。實例三本實施方式用無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基培養HaLe細胞(非洲女性宮頸 癌細胞)。分別使用實例一培養基和MEM細胞培養基(產品代碼MD600，批號070512)，在 37°C的條件下直接培養復蘇后的HaLe細胞，并用顯微鏡觀察各組細胞形態及生長增殖情 況。
表 1 無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基中培養的細胞分裂百分率明顯優于普通MEM 細胞培養基，并且無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基中細胞長成單層的時間與傳統培養基 相同，而且細胞形態基本一致。無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基的營養成分優于普通血清培養基，無血清大豆 蛋白肽動物細胞培養基中細胞增殖迅速，代謝旺盛，細胞分裂百分率(24h)明顯高于普通 血清培養基。說明實例一、二所配制的無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基用于動物細胞培 養是可行的。
權利要求
一種無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基的配制方法，其特征在于將氯化鈣100 400mg、氯化鉀100 500mg、無水硫酸鎂50 150mg、氯化鈉3000 8000mg、無水磷酸二氫鈉100 200mg、L 谷氨酰胺100 500mg、D 葡萄糖500 2000mg、酚紅5 20mg、D 泛酸鈣0.50 5mg、氯化膽堿0.50 5mg、葉酸0.5 5mg、i 肌醇1 5mg、煙酰胺0.5 5mg、鹽酸吡哆醛0.5 5mg、核黃素0.05 1mg、鹽酸硫0.5 5mg和大豆蛋白肽2000 8000mg用蒸餾水定容至1000mL；所述的大豆蛋白肽的分子量小于等于3000道爾頓，大豆蛋白肽含有18種氨基酸或以上。
2.根據權利要求1所述的一種無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基的配制方法，使用該 方法生產出來的培養基用于培養CHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、雜交瘤細胞、HEK293細 胞、MDCK細胞、HeLa細胞和MDBK細胞。
全文摘要
一種無血清大豆蛋白肽動物細胞培養基的配制方法，它涉及無血清或低血清通用細胞培養基，由氯化鈣、氯化鉀、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖、酚紅、D-泛酸鈣、氯化膽堿、葉酸、i-肌醇、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺、大豆蛋白肽和蒸餾水制成。它解決了現有無血清培養基不能直接培養生長狀況不良的細胞，多數細胞要逐步降低血清濃度才能適應現有的無血清培養基及易受外界因素影響，容易造成致死性損害的問題。細胞可直接在本發明培養基上培養，不必逐步馴化和培養，節省了培養周期和其它因素的干擾；減少血清帶來的病毒污染，并且細胞成活率高達94％以上。
文檔編號C12N5/071GK101914485SQ20101024550
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者梁金鐘, 王東典, 王淑杰 申請人:樂能生物工程股份有限公司